李 斌，陳 晶

(包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，內蒙古包頭 014040)

AP-1及其siRNA對心肌細胞中TGF-β1的影響

李 斌，陳 晶

(包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，內蒙古包頭 014040)

采用RNA干擾方法研究轉錄因子AP-1對TGF-β1的轉錄調控影響及其對心肌細胞的影響。設計合成兩對AP-1基因的siRNA-59和siRNA-60，同時合成與AP-1基因序列無關的siRNA-58，試驗設置陰性對照、陽性對照組及干擾組(AP-1-58、AP-1-59和AP-1-60)共5組，使用LipofectantineTM2000轉染AP-1 siRNA入培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；采用實時熒光定量PCR法檢測AP-1和TGF-β1在心肌細胞中mRNA水平表達量的變化。結果顯示，siRNA-58對AP-1的基因沉默(表達下調)無顯著差異(P>0.05)，siRNA-59和siRNA-60對AP-1的基因沉默(表達下調)有顯著差異(P<0.05)，同時對應siRNA-59和siRNA-60組的TGF-β1基因有顯著性下調(P<0.05)，說明AP-1和TGF-β1的基因表達存在正相關。

AP-1；TGF-β1；心肌細胞；RNA干擾；實時熒光定量PCR

心血管疾病尤其是心臟疾病發(fā)病率一直居高不下，且有逐年增加和年輕化的趨勢。心肌肥厚是多種心臟疾病共同的病理過程，影響因素較多，包括心肌細胞肥大，具體表現(xiàn)為心肌細胞體積增大、心肌細胞表型胚胎基因再表達及與收縮功能有關的收縮蛋白的改變等[1-2]。心肌肥厚機制非常復雜，至今人們尚未研究清楚。

資料顯示轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可以刺激心肌細胞合成收縮蛋白[3]。Li C[4]等在大量的動物模型和人手術后的病理標本檢測結果顯示，各種原因導致的心肌肥厚均同時伴隨著TGF-β1表達的上調。在左心室肥厚的體外試驗中，大量研究均表明TGF-β1與左心室肥厚關系密切，呈顯著正相關[5-7]。

本研究采用RNA干擾技術[8]，設計AP-1(c-jun)的siRNA，體外檢測細胞中的AP-1和TGF-β1的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 心肌細胞 大鼠心肌細胞H9C2購于北京協(xié)和細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑 LipofectantineTM2 000試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，胰酶為杭州四季青生物制品工程公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM(高糖型)為Gibeo公司產(chǎn)品；反轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent kit perfect real-time、實時熒光定量試劑盒SYBR?premix ExTaqTM Ⅱ RT-PCR kit和Trizol RNA提取試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；SiRNA 為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 H9C2細胞在 DMEM、100 mL/L的小牛血清、100 U /mL青霉素及100 U/mL鏈霉素培養(yǎng)基中,于37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞傳代用 2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞。用相差顯微鏡常規(guī)觀察細胞生長形態(tài)及生長規(guī)律。

1.2.2 siRNA的脂質體瞬時轉染 采用 Invitrogen公司 Lipofectamine 2000并按說明書進行：將1 mL無抗培養(yǎng)基中接種0.5×105～2×105細胞于6孔板,經(jīng)24 h培養(yǎng)待細胞生長融合度達40%～50%后進行瞬時轉染[9]。用250 μL DMEM稀釋5 μL LipofectantineTM2000，靜置5 min；用250 μL DMEM稀釋5 μL siRNA；混合轉染試劑和SiRNA，靜置20 min。轉染4 h～6 h后換新培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。

試驗分為3組，siRNA-AP-1組、control-RNAi-AP-1組和未進行細胞轉染組。轉染前1 d，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90%～95%，以LipofectamineTM 2000轉染。將稀釋的脂質體與合成的RNA寡聚物等體積混勻，滴加到細胞液中，讓RNA寡聚物/脂質體復合物與細胞在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下接觸6 h后，換成有血清和抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h～72 h，收集細胞，熒光相差顯微鏡檢測轉染率。

1.2.3 實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測TGF-β1在mRNA水平的表達

1.2.3.1 總RNA提取及逆轉錄 用異硫氰酸胍法提取細胞總RNA(TaKaRa RNAiso plus)，對RNA進行完整性和純度檢測，然后用反轉錄試劑盒(TaKaRa PrimeScript?RT reagent kit)反轉錄成cDNA，置-20℃保存。1.2.3.2 合成引物和內參 引物由上海生工生物工程技術服務有限合成，序列如下：GAPDH (129 bp) 5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3′；5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′;TGF-β1(149 bp) 5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′；5′-GTTTGGGACTGATCCCATTG-3′;AP-1(c-jun，125 bp) 5′-TGACTGCAAAGATGGAAACGA-3′；5′-CAGGTTCAAGGTCATGCTCTGT-3′。

2 結果

2.1 RNA干擾結果

使用6孔板分5組(陰性對照、陽性對照、 SiRNA-58、 SiRNA-59、 SiRNA-60)，當細胞融合度達到40%左右時，進行轉染干擾(圖1A)。干擾后，陰性對照組細胞正常生長，細胞融合度由40%增長至70%(圖1B)；干擾后，陽性對照組細胞形態(tài)發(fā)生變化，有部分細胞死亡，細胞融合度由40%增長至60%左右，考慮可能是脂質體影響了細胞活性(圖1C)；干擾后，SiRNA-58組由于是與AP-1(c-jun)基因無關的SiRNA，現(xiàn)象比較接近陽性對照，細胞融合度50%至60%，考慮此SiRNA對細胞干擾不大，主要是脂質體影響了細胞活性(圖1D)；干擾后，SiRNA-59組細胞形態(tài)變化大，部分視野下細胞死亡，呈圓點或圓點狀聚集，此SiRNA對細胞干擾明顯(圖1E)，干擾后，SiRNA-60組細胞形態(tài)變化大，部分視野下細胞死亡，呈圓點或圓點狀聚集，此SiRNA對細胞干擾最為明顯(圖1F)。

2.2 TGF-β1在mRNA水平的表達情況

經(jīng)real-time PCR，各組中AP-1在mRNA水平

表達情況如圖2所示，TGF-β1在mRNA水平表達情況如圖3所示。在RNA干擾組中siRNA-58組為與AP-1基因無關的siRNA，假陽性組，與陰性對照和陽性對照相比，無顯著性差異；siRNA-59組、siRNA-60組與陰性陽性對照相比，差異極顯著；siRNA-60組干擾效果更為明顯(圖2)。TGF-β1在干擾組中呈顯著性下調，與AP-1的表達量呈正相關(圖3)。

圖1 轉染前后細胞鏡檢結果

圖2 各組細胞中AP-1在mRNA的表達情況

圖3 各組細胞中TGF-β1在mRNA的表達情況

3 討論

激動蛋白-1(activator protein-1，AP-1)屬于堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，是由原癌基因c-jun和c-fos分別編碼的c-Jun和c-Fos蛋白嵌合而成的二聚體復合物，且以c-Jun為主[11-12]。Weigert C等[13]發(fā)現(xiàn)TGF-β1的基因啟動子中含有兩個AP-1結合位點(位于-453至-323之間)。

我們通過RNA干擾技術，設計AP-1(c-jun)的siRNA，進行RNA干擾，體外檢測細胞中的AP-1和TGF-β1的表達。研究顯示，siRNA-59組、siRNA-60組干擾效果較為理想，TGF-β1在干擾組中呈顯著性下調，與AP-1的表達量呈正相關。

TGF-β1在各種病因引起的心肌肥厚中均有上調趨勢。Wang W S[14]將大鼠TGF-β1基因敲除后持續(xù)給AngⅡ并不發(fā)生心肌肥厚，提示TGF-β1可直接誘導心肌肥大。謝雙倫等[15]以AP-1為靶點采用decoy ODNs技術對大鼠心肌成纖維細胞的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)AP-1 decoy ODNs可以抑制成纖維細胞增殖和膠原的合成。TGF-β1在各種病因引起的心肌肥厚中均有上調趨勢，是多種心臟疾病共同的病理過程，影響因素較多，包括心肌細胞肥大，具體表現(xiàn)為心肌細胞體積增大、心肌細胞表型胚胎基因再表達及與收縮功能有關的收縮蛋白的改變等。TGF-β1基因上游的啟動子有AP-1結合位點，本研究證實了它們之間呈正相關?？梢赃M一步檢測心肌細胞表型胚胎基因再表達及與收縮功能有關的收縮蛋白的改變等，進而可能找到治療心肌肥厚的新的靶點。

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Effects of AP-1 and siRNA on TGF-β1in Myocardial Cells

LI Bin,CHEN Jing

(DepartmentofBasicMedicineandForensicMedicine,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014040,China)

To study the effect of transcription factor AP-1 on TGF-β1and cardiomyocytes by using RNA interference method,two pairs of siRNA of AP-1 genes were designed and synthesized,meanwhile unrelated siRNA of AP-1 genes was synthesized as control. The experiment was divided into five groups, including negative control group, positive control group and three interference groups(siRNA-58,siRNA-59,siRNA -60). The cultured rat cardiomyocytes were transfected with AP-1 siRNA using LipofectamineTM2000.Cell morphology was observed by inverted microscope.The changes of mRNA expressions of AP-1 and TGF-β1in cardiomyocytes were detected by real-time quantitative PCR.The results showed,there was no significant difference in the expression of AP-1 gene in siRNA-58 group.In the siRNA-59 group and siRNA-60 group, the expression of AP-1 gene decreased significantly,while the expression of TGF-β1gene was significantly reduced.The results indicated that the expression of AP-1 gene and TGF-β1gene were positively correlated.

activator protein-1; transforming growth factor β1; cardiomyocyte; RNA interference; real-time PCR

2016-05-19

內蒙古自治區(qū)高等學?？茖W技術研究項目(NJZY12215)；內蒙古自然科學基金項目(2014MS0804，2016MS(LH)0826)

李 斌(1977-)，男，內蒙古包頭人，副教授，碩士，主要從事心血管疾病致病機制研究。

S856.2

A

1007-5038(2016)12-0046-04