穆建強，梁文潔，張芳松，熊 意，祝建波

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子 832000)

天山雪蓮sikFBA1基因克隆定位及表達分析

穆建強，梁文潔，張芳松，熊 意，祝建波*

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子 832000)

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶FBA家族(fructose-l,6-bisphosphate aldolase)在植物響應(yīng)逆境調(diào)控中具有重要的意義。該研究基于天山雪蓮低溫轉(zhuǎn)錄組研究，采用RT-PCR方法克隆了1個sikFBA1基因, ORF長度為1 077 bp，共編碼358個氨基酸，含有1個保守的Glycolytic結(jié)構(gòu)域，具有典型的FBA家族特征。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，sikFBA1蛋白分類上屬于Ⅰ型FBA，與來自四葉參(Codonopsislanceolata)的同源蛋白親緣關(guān)系最近。亞細胞定位結(jié)果表明，sikFBA1蛋白定位于細胞質(zhì)，屬于胞質(zhì)型同工酶，與預(yù)測一致。實時定量PCR結(jié)果顯示，天山雪蓮經(jīng)過不同低溫(4 ℃/-2 ℃)處理，sikFBA1基因的表達水平整體下調(diào)，但該基因在冷脅迫與冰凍脅迫、冷馴化與非冷馴化下呈現(xiàn)出不同的表達模式。研究表明，sikFBA1基因參與了天山雪蓮低溫脅迫的響應(yīng)。

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶；基因克??；亞細胞定位；表達分析

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(Fructose-l,6-bisphosphate aldolase, FBA, EC4.1.2.13)在碳、氮代謝及糖代謝等過程中起著極為重要的作用[1]，同時也是卡爾文循環(huán)中必不可少的一個關(guān)鍵調(diào)控酶[2]，催化甘油醛-3-磷酸(GAP)、磷酸二羥丙酮(DHAP)和果糖-1,6-二磷酸(FBP)的可逆反應(yīng)。Rutter等[3]依據(jù)作用機制不同將其分為Ⅰ類和Ⅱ類FBA。Ⅰ類FBA主要存在于真核生物中，由同源四聚體構(gòu)成共價“schiff”中間體，作為酶的活性中心[4]。Ⅱ類FBA主要存在于細菌、真菌物和某些原生生物中[5]，其催化作用需要依賴二價金屬離子作為輔酶因子，主要是Zn2+和Fe2+。高等植物中的FBA又存在2種亞型，即胞質(zhì)型FBA和質(zhì)體型FBA[6-7]。前者參與糖酵解和糖異生途徑，催化果糖-1,6-二磷酸的裂解[8-10]；后者則參與卡爾文循環(huán)中1,5-二磷酸核酮糖的再生，與淀粉合成有關(guān)[11-12]。

FBA基因通常以基因家族形式存在，通過對已發(fā)布的植物基因組分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組中含有8個FBA編碼基因，水稻基因組中含有7個，楊樹中有9個，番茄中有8個，而大量證據(jù)也表明FBA家族參與了植物的冷調(diào)控。Yamada等[13]研究發(fā)現(xiàn)超表達CpFBA基因的煙草植株與其對照相比具有更強的低溫耐受性；而冷脅迫下四葉參[14]體內(nèi)果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的mRNA水平也發(fā)生了變化。通過對擬南芥的表型分析及基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在3個低溫致死突變體中，果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶基因表達水平都發(fā)生了明顯上調(diào)[15]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Abbasi等[16]發(fā)現(xiàn)水稻中果糖二磷酸醛縮酶LSY206能夠被低溫誘導(dǎo)，而果糖二磷酸醛縮酶LSY248并不受低溫影響。郭玉瓊等[17]在龍眼球形胚低溫預(yù)培養(yǎng)時，分析發(fā)現(xiàn)新誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)LLT4可能是果糖-1,6-二磷酸醛縮酶，推測與龍眼的抗凍性有關(guān)。他認為果糖二磷酸醛縮酶催化糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，通過三羧酸循環(huán)生成酮戊二酸改變代謝途徑，催化合成新的適應(yīng)抗寒力提高的物質(zhì)脯氨酸。果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的活性與脯氨酸的含量提高有關(guān)[18]。在番茄中，發(fā)現(xiàn)SIFBA3基因隨著低溫處理時間的增加表達量是逐漸降低的，而SlFBA4基因剛好相反，這和其他幾個FBAs基因低溫表達模式不同[19]。

溫度是植物正常生長的必要條件。低溫脅迫幾乎影響植物生命活動的全過程。Bruggemann等[20]對栽培番茄和高海拔的野生番茄進行低溫低光強處理，發(fā)現(xiàn)栽培番茄質(zhì)體果糖-1,6-二磷酸酶和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的活性大幅度降低，而高海拔的野生番茄這2種酶活性幾乎不受影響。不同生境、不同遺傳背景植物的酶，動力學(xué)特性不同，來源于抗寒植物的酶具有更好的低溫適應(yīng)性[21]。天山雪蓮(SaussureainvolucrataKar. et Kir )，屬菊科(Compositae)鳳毛菊屬(Saussurea)，屬于典型的耐極端低溫的多年生高山植物[22]，經(jīng)過長期的自然選擇，產(chǎn)生了適應(yīng)極端環(huán)境條件的獨特生存機制[23]。結(jié)合天山雪蓮生境特點，本研究從天山雪蓮中克隆得到天山雪蓮sikFBA1基因，通過對其進行生物信息學(xué)、亞細胞定位以及低溫響應(yīng)表達譜變化的分析，以期為sikFBA1基因的功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

天山雪蓮(S.involucrataKar. et Kir)由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室組培繁殖。本氏煙(Nicotianabenthamiana)種子由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存。

1.2 sikFBA1基因克隆

天山雪蓮RNA提取依據(jù)Easypure Plant RNA Kit試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄cDNA過程參照EasyScript?One-Step gDNA Removaland Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列設(shè)計引物sikFBA1-1F(5′-AGATTCGGGGCGATGATAC-3′)和sikFBA1-1R(5′-CAGAGAAGAATTACCCAACGGA-3′)，以上述合成cDNA為模板，擴增天山雪蓮FBA基因的開放閱讀框(ORF)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各(10 μmol/L) 0.5 μL，dd H2O 8 μL，2×Easy TapPCR SuperMIX 10 μL；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)，此后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶純化回收?；厥债a(chǎn)物通過TA克隆連入pMD19-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，測序，獲得純化質(zhì)粒pMD19-T-sikFBA1。

1.3 sikFBA1蛋白生物信息相關(guān)分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih. gov)提供的Blast在線進行同源序列分析，采用ORF Finder在線查找克隆基因開放閱讀框；利用DNAMAN進行序列分析，ExPASy Proteomics Server上(http:// web. expasy. org/prot-param/)提供ProtParam在線對編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析；ProtScale分析該蛋白的疏水性，采用SOMPA(http://www.expasy.ch/tools)對sikFBA1編碼蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析；SWISS-MODEL(https:// www.swissmodel.expasy.org/)對該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；蛋白定位信號預(yù)測分析使用SignalP 4.0 Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)。利用Clustal X 1.83進行多序列比對，結(jié)合MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 sikFBA1蛋白亞細胞定位

1.4.1 載體構(gòu)建 根據(jù)天山雪蓮FBA基因測序結(jié)果，設(shè)計引物sikFBA1-2F(5′-gaattcCGATGATACCGATGGCTCT-3′)和sikFBA1-2R(5′-atcgatGTACTTGTAGTCCTTCACGTGG-3′)，并分別引入EcoRⅠ與Bsu151(ClaⅠ)酶切位點。從天山雪蓮cDNA擴增FBA基因去終止密碼子的編碼區(qū)，TA克隆連入pMD19-T載體，測序后提取陽性克隆的質(zhì)粒，EcoRⅠ與Bsu151(ClaⅠ)雙酶切得到目標基因片段，構(gòu)建GFP融合表達載體，將GFP與天山雪蓮FBA蛋白的C端連接，得到sikFBA1-GFP融合載體。

1.4.2 轉(zhuǎn)化煙草葉片試驗方法 轉(zhuǎn)化煙草實驗參照Blatt等的方法[24]，略有改動。

將構(gòu)建好的融合載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，鑒定之后，劃線、挑單克隆于5 mL Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基，加入相應(yīng)抗生素，28 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)；將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶25比例接種含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，同樣條件下培育OD為0.5左右；接著3 000 g離心15 min，棄上清，用AS培養(yǎng)基(10 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L MES-KOH, pH 5.6, 150 μmol/L乙酰丁香酮)重懸，調(diào)整OD為0.8左右；室溫靜置1 h，用不加針頭的1 mL注射器進行注射。將含sikFBA1-GFP侵染液注射到4～5周齡的本氏煙草遠軸下表皮，完成瞬時表達。以不連接目的基因的空載體為陽性對照，處理方法與sikFBA1-GFP相同，使用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡LSM 710(CarlZeiss，Oberkochen)觀察綠色熒光定位結(jié)果。

1.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)與基因表達分析

利用本實驗室天山雪蓮組培苗，對蓮座葉伸展至5葉期(下同)的雪蓮幼苗進行4 ℃/-2 ℃低溫處理，正常生長條件(19 ℃)下的雪蓮組培苗為對照，處理時間分別為1、3、6、12和24 h。為研究冷馴化對天山雪蓮sikFBA1基因表達的影響，將雪蓮在4 ℃冷馴化7 d，之后對其進行-2 ℃的處理，處理時間同上。所有處理材料采樣后迅速用液氮處理，并保存在-80 ℃，直到使用。

根據(jù)sikFBA1基因cDNA序列設(shè)計實時熒光定量引物q-sikFBA1-F(5′-GTGGCGTGCGGTCCTAAAT A-3′)和q-sikFBA1-R(5′-CCGTTCTCCTGGCAGATGATG-3′)。以天山雪蓮GAPDH基因為內(nèi)參，引物序列參照郭新勇等[25]。提取不同溫-時組合下天山雪蓮的RNA，根據(jù)SYBR GreenⅠMaster Mix (Roche) 進行qRT-PCR，分析sikFBA1基因的相對表達量。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。每個樣品3個重復(fù)，采用2-ΔΔCt分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 天山雪蓮sikFBA1基因 ORF的克隆與序列分析

基于天山雪蓮轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列，RT-PCR回收得到1 262 bp條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，天山雪蓮sikFBA基因的開放閱讀框(ORF)長度為1 077 bp，并將該cDNA序列命名為sikFBA1。

M1. 250 bp DNA Ladder; 1. PCR擴增產(chǎn)物；M2. Marker 3；2. 雙酶切產(chǎn)物圖1 sikFBA1基因ORF擴增結(jié)果(A)和sikFBA1-GFP重組質(zhì)粒酶切鑒定(B)M1. 250 bp DNA Ladder; 1. Product of PCR; M2. Marker 3; 2. Double digestion productFig.1 ORF amplification production of sikFBA1(A) and restriction digestion analysis of recombinant plasmids of sikFBA1(B)

下劃線部分為醛縮酶型的TIM barrel結(jié)構(gòu)域；*表示終止密碼子圖2 sikFBA1的ORF序列及其預(yù)測的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列The underlined represents the TIM barrel domain of aldolase; * Stop codonFig.2 ORF sequence of sikFBA1 and predicted amino acid sequence of the coding protein

ProtParam在線軟件分析sikFBA1氨基酸序列理化性質(zhì)表明：該基因編碼358個氨基酸(圖2)，相對分子質(zhì)量約38 kD，理論等電點6.91。CDD(Conserved Domain Datebse)數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果(圖3，A)顯示，sikFBA1蛋白含有一個果糖-1,6-二磷酸酸縮酶結(jié)構(gòu)域FBP_aldolase_I_a，屬于I型醛縮酶；存在一個典型且十分保守的結(jié)構(gòu)域，稱為TIM barrel結(jié)構(gòu)域，屬于TIM-phosphate-binding 超家族[26]。SOPMA軟件對sikFBA1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，α螺旋所占比例大，為43.85%；不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)次之，為27.37%；β轉(zhuǎn)角最少，僅為10.34%。此外，ProtScale軟件對sikFBA1蛋白進行親/疏水性分析 (圖3，B)顯示，該蛋白為親水性蛋白。目前，人類肌肉中的果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(PDB ID: 4ALD)已報道其二級結(jié)構(gòu)及蛋白其他的結(jié)構(gòu)特點[27]，與sikFBA1的氨基酸序列相似度為61.06%。以4ALD蛋白為模型，用SWISS-MODEL對sikFBA1進行同源建模，獲得sikFBA1單體的三級結(jié)構(gòu)(圖3，C)。對sikFBA1氨基酸序列進行BlastP檢索，下載與sikFBA1高度相似的9個氨基酸序列(4ALD為同源建模參考序列)，利用Clustal W2進行序列比對，結(jié)合建模獲得的三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，ESORIPT3.0作圖[28]。結(jié)果(圖5)顯示：參與比對的氨基酸都含有一個保守賴氨酸(Lys)殘基，該位點為催化活性位點，可以與底物形成“schiff”結(jié)構(gòu)，從而形成反應(yīng)中間體。

2.2 sikFBA1系統(tǒng)發(fā)育分析

NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果(圖4)顯示，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶家族成員可清晰地分為兩大分支，I型和Ⅱ型，I型在高等植物中又分為胞質(zhì)型和質(zhì)體型2種亞型。天山雪蓮sikFBA1在進化分類上屬于I型的胞質(zhì)同工酶，并且該蛋白與四葉參(Codonopsislanceolata) ClAldC(BAE48790.1)蛋白親緣關(guān)系最近，推測與其在結(jié)構(gòu)和功能上有一定相似性。

2.3 天山雪蓮sikFBA1亞細胞定位

sikFBA1蛋白信號肽分析結(jié)果顯示無信號肽序列，亞細胞定位預(yù)測該蛋白定位分布在細胞質(zhì)，這與其不含有信號肽結(jié)果相符，并且與進化發(fā)育分析結(jié)果相一致。通過本氏煙草表皮細胞瞬時轉(zhuǎn)化，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察信號結(jié)果顯示(圖6)：對照GFP可單獨在煙草表皮細胞中大量表達，綠色熒光信號在細胞質(zhì)、質(zhì)膜和細胞核中均有分布，而sikFBA1-GFP融合蛋白的綠色熒光信號主要分布于細胞質(zhì)中，細胞核中未檢測到明顯的信號，說明sikFBA1蛋白屬于細胞質(zhì)蛋白。

A. sikFBA1蛋白保守域；B. sikFBA1編碼氨基酸的疏水性/親水性分析；C. sikFBA1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖圖3 sikFBA1的序列分析A. Prediction conserved domain of sikFBA1; B. Prediction of the hydrophobicity and hydrophilicity of sikFBA1; C. Three-dimensional structure of deduced sikFBA1 proteinFig. 3 Sequence analysis of sikFBA1

節(jié)點上的數(shù)值表示bootstrap重復(fù)1 000次的置信度，括號內(nèi)為氨基酸登錄號圖4 天山雪蓮sikFBA1蛋白的系統(tǒng)進化分析Numbers on branches indicate the percentage of 1 000 bootstrap replicates that support the adjacent node and the accession number of each sequence is given in the bracketFig.4 Phylogenetic analysis of the sikFBA1 in S.involucrata

4ALD. 智人；ALF_CICAR. 鷹嘴豆；ALF_ORYSJ. 水稻；ALF2_PEA. 豌豆；ALF_SPIOL. 菠菜；ALF_MAIZE. 玉米；ALF1_PEA. 豌豆；ALF_ARATH. 擬南芥；ALF_DICDI. 盤基網(wǎng)柄菌. ALF_ECHMU. 多房棘球絳蟲。螺旋線表示α-螺旋，箭頭表示β-折疊，T表示β-轉(zhuǎn)角，黑色三角為催化活性位點圖5 sikFBA1氨基酸與其他物種氨基酸序列的對比4ALD. Homo sapiens; ALF_CICAR.; Cicer arietinum; ALF_ORYSJ. Oryza sativa Japonica; ALF2_PEA . Pisum sativum; ALF_SPIOL. Spinacia oleracea; ALF_MAIZE. Zea mays; ALF1_PEA. Pisum sativum; ALF_ARATH. Arabidopsis thaliana; ALF_DICDI. Dictyostelium discoideum; ALF_ECHMU. Echinococcus multilocularis; α-helices are rendered as helical lines; β-strands are rendered as arrows; T are rendered as β-turn. The dark triangle denotes active site amino residuesFig.5 Multialignment of the deduced amino acid sequences of sikFBA1 and other FBA proteins

圖6 本氏煙表皮細胞中sikFBA1蛋白的定位Fig.6 Subcellular localization of sikFBA1 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamiana

Ⅰ. 4 ℃處理；Ⅱ. -2 ℃處理; Ⅲ.經(jīng)4 ℃馴化7d后, -2 ℃處理;對照組的相對表達量均為1.0，不同小寫字母表示同一溫度處理不同處理時間差異顯著性(P<0.05, LSD檢驗)圖7 sikFBA1的低溫表達分析Ⅰ. 4 ℃; Ⅱ. -2 ℃; Ⅲ. -2 ℃ after cold acclimation with 7-day at 4 ℃；The relative expression level of the control group defined as 1.0. Different normal letters refer to significant differences among different time points of the same treatment (P<0.05, LSD test)Fig.7 Expression analysis of sikFBA1 under low temperature

2.4 sikFBA1低溫表達分析

本實驗以不同低溫(4 ℃/-2 ℃)處理天山雪蓮，研究sikFBA1基因在不同低溫下的表達模式。qRT-PCR結(jié)果(圖7)顯示：正常培養(yǎng)條件(19 ℃)的天山雪蓮經(jīng)過低溫處理，sikFBA1基因表達水平整體下調(diào)，但該基因在不同低溫脅迫下其響應(yīng)模式又表現(xiàn)出差異性。在 4 ℃處理1 h后該基因表達量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，3 h時達到最高，隨后逐漸下降，12 h后趨于穩(wěn)定。而-2 ℃處理1 h后其表達水平的變化趨勢與4 ℃剛好相反，在1～6 h期間，sikFBA1基因表達沒有明顯變化，到12 h表達量顯著下調(diào)，24 h時又顯著的上升。推測sikFBA1基因?qū)涿{迫和凍脅迫的應(yīng)答機制是不同的。有趣的是經(jīng)過冷馴化的雪蓮在-2 ℃處理1 h后，sikFBA1表達量變化趨勢卻與4 ℃處理相似，表達量均在處理3 h處達到最大值，且發(fā)現(xiàn)除1 h處理之外，其它處理時間下未經(jīng)冷馴化的雪蓮在-2 ℃處理下sikFBA1基因的表達量均是最低的。也表明冷馴化使sikFBA1基因?qū)τ诒鶅雒{迫的響應(yīng)模式發(fā)生改變，該基因可能參與了天山雪蓮的低溫響應(yīng)。

3 討 論

FBA作為一類重要的糖代謝酶，處于6C糖可逆地轉(zhuǎn)化為3C糖的關(guān)鍵部位，具有承上啟下的作用，而且越來越多的證據(jù)表明這一家族在許多代謝和發(fā)育過程中扮演著重要的作用[29-31]。自Meyethof等[32]首次發(fā)現(xiàn)果糖-1,6-二磷酸醛縮酶以來，相繼在不同的物種中展開了研究，如玉米[33]、擬南芥[7]、番茄[19]等，以及細菌[34-35]和脊椎動物[36-37]中都有大量的報道，但是未發(fā)現(xiàn)該酶在天山雪蓮中的報道。本研究結(jié)合天山雪蓮生境特點，并基于低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果，從天山雪蓮中成功的克隆到sikFBA1基因。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列具有果糖-1,6-二磷酸醛縮酶家族的基本特征，與其他物種FBA家族成員有較高一致性。sikFBA1蛋白的第225個氨基酸是賴氨酸(Lys)，是該酶的催化活性位點，可以與底物反應(yīng)形成“schiff”結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明該蛋白與四葉參ClAldC蛋白的進化關(guān)系最近。同時該結(jié)果與亞細胞定位結(jié)果一致，表明FBA家族成員亞細胞定位與其在進化樹上的分布存在一定對應(yīng)關(guān)系[38]。

之前的研究表明，F(xiàn)BA基因家族參與了植物的冷調(diào)控。天山雪蓮經(jīng)過不同低溫處理，sikFBA1基因表達水平整體下調(diào)，但不同溫度處理下表達量變化趨勢又有所不同。天山雪蓮在4 ℃冷處理前期，外界冷信號激發(fā)雪蓮的冷防御機制，機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，sikFBA1基因參與到糖代謝途徑以增加能源需求和供應(yīng)中間體來適應(yīng)低溫脅迫[39]，其表達量在3 h時迅速上升，經(jīng)過短期適應(yīng)或者sikFBA1基因產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，其表達量在6 h顯著下降，12 h后趨于穩(wěn)定。這與四葉參ClAldC基因4 ℃處理時的表達模式相似[14]。天山雪蓮從19 ℃驟然進入-2 ℃，溫度變化落差大，sikFBA1基因在脅迫前期并沒有做出快速響應(yīng)，推測在凍脅迫前期由sikFBA基因家族的其他凍敏感型同工酶發(fā)揮作用，與sikFBA1基因功能互補。脅迫后期，sikFBA1基因表達開始恢復(fù)。同工酶分工合作現(xiàn)象在多種研究中也有表現(xiàn)。鹽脅迫處理下煙草的果糖-1,6-二磷酸醛縮酶NpAldP1和NpAldP2基因表達量變化也不一致，后者表達量發(fā)生明顯的上調(diào)而前者的表達量卻是下調(diào)[13]。Lu等[7]在對擬南芥中FBA基因家族進行研究時也發(fā)現(xiàn)，4 ℃處理時地上部分AtFBA3、AtFBA4、AtFBA5 和AtFBA8 基因表達上調(diào)，而AtFBA1、AtFBA2和AtFBA7基因表達則被抑制。而在番茄FBA基因家族的研究中也有類似結(jié)論[19]。低溫馴化可以提高植物的抗寒應(yīng)力，植物通過調(diào)節(jié)抗寒相關(guān)基因發(fā)生變化對低溫做出響應(yīng)[40]，這可能是sikFBA1基因在冷馴化前后的表達模式不同的原因之一，同時也表明參與糖酵解的酶有足夠程度的靈活性來適應(yīng)脅迫[39]。

天山雪蓮在溫差極大的環(huán)境下，如果較少的同工酶以及單一的表達模式，很難滿足機體在劇烈變化的環(huán)境中的代謝能力。那么選擇不同溫度酶學(xué)特性的混合群體，就能滿足這種需要。本研究發(fā)現(xiàn)sikFBA1基因在冷脅迫和冰凍脅迫下表達模式存在差異，且冷馴化前后該基因?qū)Ρ鶅雒{迫的響應(yīng)也不同。這為揭示該基因家族的抗寒機制研究奠定了基礎(chǔ)，對進一步研究天山雪蓮的抗凍性具有的重要意義。但本實驗僅獲得1個sikFBA基因，不利于對該基因家族進行深入研究，后期實驗進一步發(fā)掘更多的sikFBA基因，深入研究該基因家族在天山雪蓮冷脅迫下的調(diào)節(jié)機制。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning, Subcellular Localization and Expression Analysis ofsikFBA1 fromSaussureainvolucrataKar. et Kir

MU Jianqiang，LIANG Wenjie，ZHANG Fangsong，XIONG Yi，ZHU Jianbo*

(Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000, China)

The fructose-1, 6-bisphosphate aldolase (FBA) family plays an important role in plants stress-response. AsikFBA1 gene was cloned based on the sequencing results of theSaussureainvolucrataKar. et Kir transcriptome with RT-PCR method. The open reading frame (ORF) of thesikFBA1 gene is 1 077 bp which encoded a deduced protein including 358 amino acids residues. The protein sequence of sikFBA1 possesses the conserved Glycolytic domain, the typical family characteristic of FBA. Phylogenetic analysis exhibitied that sikFBA1 ofS.involucrataKar. et Kir showed the closest genetic relationship with that ofCodonopsislanceolataand they are all belonged to the FBA class I .When fused to green fluorescent protein (GFP) in the subcellular localization assay, we found that sikFBA1 protein was present in the cytoplasm, which was consistent with the predicted results. sikFBA1 is cytoplasmic isoenzyme. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was performed to determine the expression pattern in 4 ℃ and -2 ℃ during the low temperature treatment. The results showed that the expression level ofsikFBA1 gene was generally down-regulated after treatment. Interestingly, thesikFBA1 gene showed different expression patterns between the different stress conditions of cold and freeze, cold acclimation and unacclimation respectively. These results indicated thatsikFBA1 had the potential function inS.involucrataKar. et Kir response to low temperature stress.

fructose- l, 6- bisphosphate aldolase；gene cloning；subcellular localization；expression analysis

1000-4025(2016)11-2137-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2137

2016-09-15;修改稿收到日期:2016-11-08

國家自然科學(xué)基金(31360053)

穆建強(1991-)，男，在讀碩士研究生，主要從事基因資源的研究與評價。E-mail：jianqiangmshz@163.com.

*通信作者:祝建波，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆基因工程和環(huán)境生物技術(shù)研究。E-mail：zjbshz@163.com.

Q785;Q786

A