黃 宇，李國雷，廖 敏*，韓東道，張 楠，陳 娜

（1.浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室，浙江杭州 310058；2.象山縣農(nóng)業(yè)技術推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江杭州 310058；4.寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，浙江象山 315700）

蚯蚓水解液對草莓白粉病的抑制效果初探

黃 宇1，3，李國雷1，2，廖 敏1，3*，韓東道4，張 楠1，3，陳 娜1，3

（1.浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室，浙江杭州 310058；2.象山縣農(nóng)業(yè)技術推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江杭州 310058；4.寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，浙江象山 315700）

通過蚯蚓水解液對草莓白粉病孢子抑制及田間防效試驗，探討對草莓白粉病的抑制潛力。結(jié)果表明，蚯蚓水解液對草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的EC50為總氨基酸21.81 mg·L-1。田間防效表明，在草莓白粉病發(fā)病期，連續(xù)3次噴施蚯蚓水解液，草莓白粉病能被有效控制，防效為80.7%～90.0%，蚯蚓水解液對草莓白粉病的田間防效的噴施濃度以50～100倍液較為適宜。同時蚯蚓水解液的使用不會對草莓的生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響，反而是促進草莓生長發(fā)育，對有益生物也無不良影響，說明蚯蚓水解液在草莓生產(chǎn)上具有很好的防病和促進生長的應用前景。

蚯蚓水解液；草莓白粉?。灰种菩Ч?/p>

草莓白粉病是因子囊菌亞門專性寄生真菌羽衣草單囊殼菌（Sphaerothecamacularis）侵染造成，是草莓生產(chǎn)中一種常發(fā)性病害，在世界各地均有分布［1-3］。我國南方一般10月下旬至11月上旬始發(fā)，12月至翌年4月為發(fā)生高峰期。為害導致草莓幼果停止發(fā)育，果面覆蓋一層白粉，隨著病情的加重，草莓果實品質(zhì)變差，甚至腐爛變質(zhì)，失去商品價值［4］。該病害已成為草莓生產(chǎn)主要障礙因子，給種植戶造成嚴重的經(jīng)濟損失。

草莓果實一般以直接入口鮮食為主，對果實農(nóng)藥殘留限量要求嚴格，目前生產(chǎn)上防治草莓白粉病常用的化學農(nóng)藥如腈菌唑、百菌清、粉銹寧等，易造成農(nóng)藥殘留［5］，同時由于多年的連續(xù)使用，使病菌產(chǎn)生抗性，造成防效下降。因此，尋找高效、安全的白粉病真菌抑制劑是草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟須解決的一個問題。

蚯蚓是分解腐熟廢棄有機物效率最高的生物，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位，不但藥用價值大，而且蛋白質(zhì)含量高，約占鮮質(zhì)量的8%～10%，占干重的56%～66%。正常情況下，蚯蚓體內(nèi)含有低量的抗菌肽。孫振鈞［6］通過熱處理、超濾和分子篩等方法，從蚯蚓體液中純化得到相對分子量低于10 000的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其具有很強的抑菌活性，且抗菌譜廣，熱穩(wěn)定性較強。張希春等［7］研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)存在多種抗菌成分，特別是分子量較小的成分中含有性質(zhì)有別的2種及以上的抗菌肽類成分。賈久滿等［8］研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓水解液對大腸桿菌具有很好的抑制效果，這一現(xiàn)象在李彥青等［9］研究中也得到驗證，這是蚯蚓水解液保留了抗菌肽的活性，同時還新增了有抗菌潛力的系列小分子肽緣故。可見，含有抗菌肽的蚯蚓水解液可作為一種新型的安全抑菌劑加以開發(fā)利用。

蚯蚓消化道有10多種蛋白水解酶，這些酶類對蚯蚓蛋白有較強的水解活性。武金霞等［10-11］研究發(fā)現(xiàn)，利用蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白質(zhì)，可獲得較高營養(yǎng)價值和富含生物活性物質(zhì)的蚯蚓水解液。筆者研究也發(fā)現(xiàn)，其成分主要為18種氨基酸和少量短肽，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白質(zhì)占12%～15%［12］。目前，蚯蚓水解液利用研究主要集中在氨基酸葉面肥生產(chǎn)原料，或作為動物養(yǎng)殖的營養(yǎng)液利用方面，利用其含抗菌肽活性因子控制作物微生物病害方面的研究等未見報道。本研究通過初步探討蚯蚓水解液對草莓白粉病菌的抑制效果，旨在為防治草莓白粉病尋找高效、安全的抑制劑，解決草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸制約問題，同時也為提高蚯蚓資源的附加值利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試草莓白粉病菌采自于象山縣東陳鄉(xiāng)東塔村的寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司的大棚草莓白粉病發(fā)生的果實上，采集后在浙江大學實驗室制成孢子懸浮液備用。

1.2 蚯蚓水解液制備

選用大平2號蚯蚓，洗凈并吐出體內(nèi)的食物殘渣。稱取鮮蚯蚓500 g，用高速組織搗碎機搗碎，在pH 7.0、鮮蚯蚓與水重量比為1∶1.5、溫度50℃的條件下反應48 h，取粗過濾液在4 500 r·m in-1下離心10 min，取上清液，封樣備用。

1.3 處理設計與測定方法

1.3.1 抑制率測定

通過測定蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率來確定抑菌效果［13］。將制備好的蚯蚓水解液稀釋不同倍數(shù)，與草莓白粉病菌孢子懸浮液混合，分別配制成含蚯蚓水解總氨基酸12.0、24.0、48.0、96.0和192.0 mg·L-1的草莓白粉病菌孢子懸浮液的混合液，以滅菌水配制成的草莓白粉病菌孢子懸浮液為對照，各取1滴（約0.25 m L）分別置入雙凹載玻片上，每處理重復3次；將凹面朝下，置于鋪有吸水濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，放入25℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，24 h后于光學顯微鏡下隨機選擇3個視野觀察，每個視野隨機檢查100個孢子，記錄孢子的萌發(fā)情況，凡孢子的芽管超過孢子直徑一半時即判為萌發(fā)孢子，計算萌發(fā)率和抑制萌發(fā)率以及EC50。

1.3.2 處理設計

田間試驗于2015年3月15日至4月13日在寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司草莓大棚內(nèi)進行，草莓品種為紅頰。該大棚歷年發(fā)生白粉病較為嚴重，施藥時正處于白粉病發(fā)病初期，少數(shù)果實開始發(fā)病。試驗共設6個處理：蚯蚓水解液50倍稀釋液，蚯蚓水解液100倍稀釋液，蚯蚓水解液200倍稀釋液，蚯蚓水解液400倍稀釋液，10%苯醚甲環(huán)唑水分散顆粒劑600倍稀釋液（防治草莓白粉病常用化學農(nóng)藥），清水對照（CK）。每處理重復3次，共18個小區(qū)，每小區(qū)面積20 m2，小區(qū)隨機區(qū)組排列。噴施時間第1次3月15日，第2次3月22日，第3次4月1日，采用背負式噴霧機噴施，均勻噴灑在草莓植株葉的正反面及幼果果面，每小區(qū)噴施1.5 L藥液。

1.3.3 調(diào)查方法和分級標準

第1次噴施前（3月15日）調(diào)查病情基數(shù)，第1次噴施后7 d（3月22日）、第2次噴施后10 d（4月1日）、第3次噴施后12 d（4月13日）調(diào)查發(fā)病情況和防治效果。每小區(qū)對角線5點取樣，每點取5株，每株調(diào)查所有果實，以每個果實上病斑面積占整個果實的百分比進行病情分級。病害分級如下［14］：0級，葉片、果實無??；1級，病斑面積占整個葉、果面積的5%以下；3級，病斑面積占整個葉、果面積6%～15%；5級，病斑面積占整個葉、果面積16%～25%；7級：病斑面積占整個葉、果面積26%～50%；9級：病斑面積占整個葉、果面積50%以上。同時，每次調(diào)查病害時觀察草莓植株生長情況，考查蚯蚓水解液的安全性和促進生長情況。

根據(jù)病害調(diào)查結(jié)果計算病情指數(shù)和防治效果，采用鄧肯氏新復極差法（DMRT）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

病情指數(shù)=100×［（各級病葉病果數(shù)×病害級別數(shù)）］/（調(diào)查總?cè)~總果數(shù)×9）；

防治效果/%=100×（1—對照區(qū)噴施清水前病情指數(shù)×處理區(qū)噴施后病情指數(shù)÷對照區(qū)噴施清水后病情指數(shù)÷處理區(qū)噴施前病情指數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且隨著蚯蚓水解液濃度的增加抑制作用增強。經(jīng)對蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率的回歸方程，即：Y=0.125 5X+47.263，相關系數(shù)為r= 0.961 1，式中Y為萌發(fā)抑制率（%），X為蚯蚓水解液總氨基酸濃度（mg·L-1），可見蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率與蚯蚓水解液總氨基酸濃度存在良好的正相關關系。依據(jù)上述回歸方程，可推算出蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制率的半最大效應濃度（EC50）值，即EC50為總氨基酸21.81mg·L-1，可見蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制效果明顯，這主要是由于蚯蚓水解液中含有一定量抗菌小分子肽之故［6-8］。因此，蚯蚓水解液除了可提供草莓氨基酸營養(yǎng)之外，還具有對白粉病菌等良好的抑制效果，又可能成為替代防治草莓白粉病化學農(nóng)藥的環(huán)境友好型藥劑，具有一定市場開發(fā)前景。

2.2 對草莓白粉病的田間防效

從表2可知，第1次施蚯蚓水解液之后的第7天考查，蚯蚓水解液對草莓白粉病的防效隨噴施濃度的增加而提高，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為74.5%、68.6%、62.1%和58.0%。其中，100倍稀釋液防效與苯醚甲環(huán)唑化學農(nóng)藥的防效無顯著差異，而200倍和400倍稀釋液防效低于化學農(nóng)藥，50倍稀釋液防效高于化學農(nóng)藥，這可能是由于隨著蚯蚓水解液稀釋倍數(shù)的增加，單位數(shù)量內(nèi)抗菌小分子肽等生理活性物質(zhì)濃度降低，導致抗菌效果下降的原因所致［6-8］。第2次施蚯蚓水解液后的第10天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為85.7%、81.8%、79.1%和76.6%，這種趨勢與第1次施蚯蚓水解液后的第7天考查結(jié)果相同。第3次施蚯蚓水解液后的第12天考查，蚯蚓水解液50、100、200和400倍稀釋液的平均防效分別為90.0%、83.8%、81.8%和80.7%，防效趨勢仍與第1和2次施蚯蚓水解液后的考查結(jié)果相同。由此可見，在草莓白粉病初發(fā)期，連續(xù)噴施蚯蚓水解液3次后，草莓白粉病的病情指數(shù)大幅下降，而空白對照區(qū)白粉病發(fā)生日趨嚴重。試驗結(jié)果還表明，蚯蚓水解液的稀釋倍數(shù)應控制在50～100倍，以保證優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑化學農(nóng)藥的防治效果。此方法值得在草莓生產(chǎn)上推廣應用，防止直接入口鮮食水果因農(nóng)殘超標危害身體健康。

表1 蚯蚓水解液對草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3 對草莓生長安全性影響

在每次調(diào)查病害時，目測蚯蚓水解液對草莓葉片和幼果等生長發(fā)育情況的影響，以判斷其安全性。在整個試驗過程中，噴施蚯蚓水解液的處理區(qū)未發(fā)現(xiàn)草莓的莖葉、花和果實有任何異常藥害癥狀發(fā)生。相反，與對照和噴施化學農(nóng)藥的處理區(qū)相比，噴施蚯蚓水解液的處理區(qū)植株長勢更好，葉片顏色更深，果實顏色更鮮艷。

由表3可知，隨著蚯蚓水解液噴施濃度提高和次數(shù)增加，草莓近似葉面積有隨之增加的趨勢，且這一趨勢隨著時間的延長進一步得到強化，而噴施化學農(nóng)藥的處理區(qū)近似葉面積與對照無顯著差異，這可能因為蚯蚓水解液本身是一種氨基酸葉面營養(yǎng)肥［15-17］，可為植株提供氨基酸和微量元素，促進植物生長，達到藥肥一體之效果。同時，也未發(fā)現(xiàn)放養(yǎng)的授粉蜜蜂有異常死亡現(xiàn)象，說明在草莓上噴施蚯蚓水解液對有益昆蟲是安全的，在草莓生產(chǎn)上具有很好的應用前景。

表2 蚯蚓水解液對草莓白粉病田間防效

表3 不同濃度蚯蚓水解液對草莓近似葉面積的影響

3 小結(jié)

蚯蚓水解液對草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，其抑制孢子萌發(fā)的EC50為總氨基酸21.81 mg·L-1。田間試驗結(jié)果表明，在草莓白粉病初發(fā)期，連續(xù)噴施蚯蚓水解液3次，防效在80.7%以上，如選用適宜噴施濃度50～100倍且連續(xù)噴施3次，防效可達83.8%～90.0%。同時蚯蚓水解液還有促進草莓生長發(fā)育的作用，對有益生物無不良影響，對以鮮食為主的草莓生產(chǎn)有很好的推廣應用價值。

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（責任編輯：張瑞麟）

S482.2+92

：A

：0528-9017（2016）12-2067-04

文獻著錄格式：黃宇，李國雷，廖敏，等.蚯蚓水解液對草莓白粉病的抑制效果初探［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（12）：2067-2070.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161246

2016-05-31

寧波市重大（重點）科技攻關計劃項目（2013C11012）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項（201003059）

黃 宇（1990—），男，湖南株洲人，碩士研究生，主要從事環(huán)境生態(tài)研究工作，E-mail：huangyuyuer@126.com。

廖 敏，研究員，博士，從事土壤化學與土壤生物化學研究工作，E-mail：liaom in@zju.edu.cn。