陳 磊，羅金燕，趙玉強，余 慧，姚紅梅

（上海市農業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103）

上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對策

陳 磊，羅金燕，趙玉強，余 慧，姚紅梅

（上海市農業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103）

番茄潰瘍病是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis）引起的番茄最具毀滅性病害之一，在松江區(qū)3個大棚內發(fā)現可疑番茄病株。大棚內采集的發(fā)病植株經南京農業(yè)大學病原物分離培養(yǎng)和PCR檢測，檢測出番茄潰瘍病菌。為進一步確認，筆者對分離到的菌株進行了致病性測定，對接種病原物進行了再分離，經?；悦庖咴嚰垪l檢測和PCR檢測，確定為番茄潰瘍病菌。同時，總結出一套適用于上海的綜合防控措施。

番茄潰瘍?。恢虏⌒詼y定；免疫試紙條檢測；PCR檢測；防控措施

番茄潰瘍病是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的番茄最具毀滅性病害之一，既是我國進境植物檢疫對象，又是全國農業(yè)植物檢疫對象。番茄幼苗至結果期均可發(fā)生潰瘍病，主要表現為葉片凋萎或蜷縮，似缺水狀，莖內部變褐，并向上下擴展，后至中空，最后下陷或開裂呈潰瘍狀，莖略變粗，生出許多不定根，嚴重時全株枯死。在切開病株時可發(fā)現中間呈褐色腐爛，濕度大時，莖稈中還會溢出白色菌膿。此病特有的癥狀為病果表面產生鳥眼狀壞死斑，稱為“鳥眼斑”［1-3］。該病自從1909年首次在美國溫室番茄上發(fā)現以來，現已廣泛分布于美國各番茄產區(qū)，并逐漸成為世界性病害。1943—1946年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭工業(yè)受到嚴重影響。1991年法國因該病番茄減產20%～30%［4］。

國內有關番茄潰瘍病的記載始于1954年，當時在大連市場上采集到2個癥狀頗似潰瘍病的番茄果實［5］。李明遠等［6］于1980年6月在北京首次發(fā)現此病（朝陽太陽宮公社八隊病株率13%），因受條件所限，未能確認病因，至1986年初才正式報道北京發(fā)生。隨后，山西、內蒙古、遼寧、黑龍江、新疆、安徽、天津、廣西、江蘇、貴州、河南等地區(qū)都相繼報道發(fā)生［4，5，7-15］。2014年6月上海市農業(yè)植物檢疫人員在松江區(qū)3個大棚內發(fā)現可疑番茄病株，發(fā)病面積1 000 m2。大棚內采集的發(fā)病植株經南京農業(yè)大學病原物分離培養(yǎng)和PCR檢測，檢測出番茄潰瘍病菌，這是上海市首次發(fā)現番茄潰瘍病疫情。為進一步確認，筆者對分離到的菌株進行了柯赫氏法則驗證。疫情發(fā)生后，上海市農業(yè)技術推廣服務中心在上海市范圍進行普查，未在其他地方新發(fā)現疫情，但松江區(qū)發(fā)生該病的3個番茄大棚損失率均在50%以上。同時，由筆者擬定的番茄潰瘍病的處置意見和防控技術方案指導開展相關防控處置工作，疫情處置近兩年來，上海市未再發(fā)生番茄潰瘍病，由此總結出一套適合上海地區(qū)推廣的綜合防控措施。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 主要試劑和試劑盒

番茄潰瘍病菌檢測試紙條購自美國Agdia公司，細菌DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR試劑購自TaKaRa公司，引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.1.2 供試細菌菌株

番茄潰瘍病菌標準菌株BX由中國農業(yè)大學提供，菌株SH1406由南京農業(yè)大學從采自松江區(qū)新浜鎮(zhèn)的發(fā)病番茄植株上分離得到。

1.1.3 供試番茄

致病性測定的供試番茄品種為合作908（已報道為感病品種）［3］，購自上海長種番茄種業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細菌學鑒定

革蘭氏染色反應采用結晶紫草酸銨染色法，氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗參照常規(guī)的植病研究方法［16］。

1.2.2 過敏性反應和致病性的測定

將待測菌株BX、SH1406在YDC固體培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)72 h后，再用無菌ddH2O配制成108～109CFU·m L-1的菌懸液。采用打頂法［17］接種于播種后培育21～28 d的2～3片真葉期番茄幼苗（播種前種子用0.01%醋酸溶液浸泡消毒處理24 h），每菌接12株幼苗，以無菌ddH2O為空白對照（CK）。接種后植株置于人工氣候箱生長，氣候箱從7：30—18：30提供光照，且溫度保持在30℃，其余保持在24℃。接種后7～21 d觀察番茄上的發(fā)病情況。同時用菌懸液注射煙草葉片，接種36～54 h后觀察煙草葉片接種處有無過敏性反應（Hypersensitive Reaction，HR）。

1.2.3 發(fā)病植株病原菌的再分離及檢測鑒定

病原菌的再分離與純化。選取顯癥植株，剪取病部1～2 cm莖段，置于滅菌后的培養(yǎng)皿內加入無菌水200μL，擠壓出莖部組織液，用接種環(huán)蘸取組織液在LB培養(yǎng)基上畫線分離培養(yǎng)，置于25℃下培養(yǎng)3～4 d，根據菌落形態(tài)選擇淡黃色的單菌落，在YDC培養(yǎng)基平板上純化。

?；悦庖咴嚰垪l檢測。使用從美國Agdia公司購買的檢測Cmm專用的免疫試紙條，對發(fā)病植株進行檢測，以是否出現陽性反應檢測線作為判斷依據。

PCR檢測。對病原菌的再分離與純化中分離純化的細菌在YDC液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，提取DNA。按照Dreier等［18］和Cho等［19］報道的番茄細菌性潰瘍病菌特異性引物Cmm5/Cmm6（引物序列：Cmm5為5′-GCGAATAAGCCCATATCAA-3′；Cmm6為5′-CGTCAGGAGGTCGCTAATA-3′）和Cmm 141F/Cmm141R（引物序列；Cmm141F為5′-CAG GCGTCCGTCGGTGAGGTGGTC-3′；Cmm141R為5′-GCGGGAGAGCGGTGCGGGAATG-3′）分別進行PCR擴增。反應體系為10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2μL，5U·μL Taq DNA聚合酶0.2μL，上、下游引物（20μmol·L-1）各0.5μL，模板DNA 1μL，無菌ddH2O補充至25μL。反應條件參照相關文獻［18-19］。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶（EB）染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析，觀測是否得到614和141 bp的特異性擴增產物。

2 結果與分析

2.1 生理生化測定

對菌株SH1406進行4項生理生化測定，結果顯示與標準菌株BX一致，即革蘭氏染色反應陽性，氧化酶試驗反應陰性，氧化酶試驗反應陽性，明膠液化能力較弱。

2.2 過敏性、致病性測定

通過過敏性反應測試，菌株SH1406與菌株BX一樣可激發(fā)煙草的HR（過敏性）反應（圖1）。接種7 d后觀察，所接種的番茄幼苗未顯現明顯潰瘍病癥狀；接種后14～21 d觀察，2個菌株接種的幼苗均不同程度出現子葉萎蔫、莖壞死、植株死亡等典型細菌性潰瘍病癥狀（圖2），表明菌株SH1406確為番茄潰瘍病菌。

圖1 煙草過敏性反應檢測結果

2.3 病原物再分離和檢測

通過LB和YDC培養(yǎng)基分離純化顯癥植株表明，從接種的病株上能夠再次分離純化獲得培養(yǎng)性狀與BX和SH1406一致的菌落，經純化后的分離物在YDC培養(yǎng)基上呈黃色黏稠狀菌落。而從無菌水接種處理的幼苗上未能分離獲得培養(yǎng)性狀與BX和SH1406相似的菌落。免疫試紙條檢測結果顯示表明，BX和SH1406接種處理的病株能夠使專化性試紙條呈陽性反應，CK處理呈陰性反應（圖3）。用特異性引物Cmm5/Cmm6和Cmm141F/ Cmm141R分別對從接種的病株上獲得分離物的DNA進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，可見到特異性的614和141 bp擴增片段（圖4）。

圖2 打頂接種21 d發(fā)病結果

圖3 免疫試紙條檢測結果

圖4 PCR電泳檢測結果

3 綜合防控措施

對松江新浜新發(fā)生番茄潰瘍病的3個大棚立即進行封鎖，及時拔除了番茄植株并就地堆放在大棚內，待植株曬干后集中進行深埋，同時對栽培設施進行消毒處理，防止該病害的擴散蔓延。根據該病的發(fā)生規(guī)律和上海市番茄的種植情況，提出以下防控策略。

嚴格植物檢疫。番茄潰瘍病是典型的種傳病害，在番茄繁（育）種過程中須嚴格執(zhí)行產地檢疫，嚴禁從疫情發(fā)生區(qū)向非疫區(qū)調種。對調入的種子、秧苗、果實等要加強檢疫復檢，嚴禁帶菌種子銷售。對種植區(qū)加強普查和監(jiān)測，一旦發(fā)現疫情，及時向當地植物檢疫機構報告，并采取有效的控制封鎖措施。

建立無病留種田。種子繁育時，要選擇無病田塊，開展田間檢驗，防止生產帶菌種子。

種子消毒處理。溫湯浸種：先將種子在涼水中浸泡10 m in，撈出后將種子放入55℃溫水中浸30 min，不斷攪拌，并隨時補充熱水。藥劑浸種：選用0.6%醋酸溶液浸種24 h，或用72%農用鏈霉素2 000倍液浸種2 h，或用1.5%次氯酸鈉浸種30～40 m in，取出沖凈晾干后催芽。干熱處理：將充分干燥的種子放入70℃恒溫箱中滅菌72 h，此法效果顯著。

加強田間管理。選擇未種過茄科蔬菜的地塊作為苗床，避免大水漫灌，采用滴灌或滲灌，防止病菌傳播。避免露水未干時進行整枝打杈等農事操作，栽培管理過程中減少對番茄的機械傷害，雨后及時排水，一旦發(fā)現番茄潰瘍病病株，立即拔除病株及病殘體，集中帶離棚室進行深埋，降低菌源和損失。

高溫悶棚土壤消毒。選擇夏季溫度較高的時期，密閉溫室大棚，可殺死土壤中殘留的病菌，防止病害傳播。清除大棚內病殘體和田間雜草后，每667 m2均勻撒施1 000 kg豬糞等腐熟或半腐熟有機肥和50 kg碳酸氫銨，翻耕整地后灌大水至土壤充分濕潤后，覆蓋地膜，封閉大棚，保持棚內高溫高濕狀態(tài)3周。

輪作倒茬。種植番茄等茄科作物要與非茄科植物實行輪作倒茬3年以上。

藥劑防治。在發(fā)病初期，可選用72%農用鏈霉素4 000倍液和77%氫氧化銅（可殺得）500倍液，對番茄地上部植株進行噴藥，隔7～10 d噴1次，連續(xù)施藥2～3次，以徹底消滅病菌。

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（責任編輯：張瑞麟）

S436

：B

：0528-9017（2016）12-2054-04

文獻著錄格式：陳磊，羅金燕，趙玉強，等.上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對策［J］.浙江農業(yè)科學，2016，57（12）：2054-2057.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161241

2016-06-22

上海市市級農口系統(tǒng)青年人才成長計劃（滬農青字（2015）第4-7號）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2014）第7-3-1號）

陳 磊（1982—），男，上海人，農藝師，碩士，從事植物疫情監(jiān)測與防控工作，E-mail：chenlei200524@126.com。