劉亞妮 周嘉黎 楊春曉 羅小梅 楊婷玉 張 玉 師少軍 黃怡菲

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢430022)

·基礎免疫學·

RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達水平的影響①

劉亞妮 周嘉黎 楊春曉 羅小梅 楊婷玉 張 玉 師少軍 黃怡菲②

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢430022)

目的：考察RAC1基因多態(tài)性與Rac1-GTP蛋白表達水平的相關性。方法：選擇182例健康漢族志愿者，經(jīng)TaqMan-MGB探針等位基因分型技術測定RAC1基因中的4個標簽單核苷酸多態(tài)性(tag single nucleotide polymorphism,tag-SNPs)位點的基因型，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定其血漿中的Rac1-GTP蛋白表達水平。分析Rac1-GTP蛋白表達水平的分布特點；對RAC1基因4個tag-SNPs不同基因型間Rac1-GTP蛋白表達水平進行比較。結(jié)果：Rac1-GTP蛋白表達水平在健康漢族人群中呈現(xiàn)正偏態(tài)分布，女性中的表達水平高于男性(P<0.05)；隨著年齡的增加有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Rac1-GTP蛋白表達水平在位點rs702482和rs10951982基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，但在位點rs702483和rs6954996基因型間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)論：在健康漢族人群中RAC1基因多態(tài)性存在影響Rac1-GTP蛋白表達水平的SNP位點。

RAC1；基因多態(tài)性；Rac1-GTP；蛋白表達水平；漢族健康人群

Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)蛋白是小G蛋白Rho超家族Rac亞家族中關鍵成員之一，廣泛分布于各種組織，是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子。Rac1在調(diào)整細胞骨架與遷移、細胞的增殖分化與凋亡、細胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲、機體免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的生物學作用[1-4]。Rac1蛋白由位于人第7號染色體上的RAC1基因編碼，RAC1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有Rho-GTPase結(jié)合區(qū)，使Rac1蛋白具有結(jié)合和水解GTP核苷酸的能力，從而使Rac1蛋白在具有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間進行轉(zhuǎn)換[4]。Rac1的生物學功能發(fā)揮依賴于此兩種結(jié)合形式間的轉(zhuǎn)換。RAC1基因序列上堿基的突變可能引起Rac1蛋白活性表達的改變。已有研究表明，Rac1蛋白活性的表達與卵巢癌、肺癌、腎功能損害、心臟功能受損、炎癥性腸病等疾病的發(fā)生及發(fā)展相關[5-8]。此外，RAC1的基因多態(tài)性和Rac1蛋白活性已被證明與嘌呤類免疫抑制藥的療效和不良反應有關[9]。因此，分析RAC1基因多態(tài)性對Rac1蛋白表達的影響，有利于預測疾病的風險及藥物的療效和不良反應。

本課題組前期建立了人RAC1基因上8個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點基因型的測定方法，經(jīng)過對150例湖北地區(qū)漢族健康志愿者RAC1基因上這8個SNPs的基因型分析，篩選出4個代表性的tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)[10,11]。本研究通過建立Rac1-GTP活性蛋白表達水平的測定方法，進一步篩選健康志愿者并測定其血漿中Rac1-GTP活性蛋白表達的水平，并對Rac1-GTP活性蛋白水平和RAC1基因上的4個tag-SNPs基因型的相關性進行了分析，旨在探討RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達的影響，為進一步研究RAC1基因多態(tài)性與藥物效應及相關疾病之間的關系奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 7900HT型熒光定量PCR儀、NanoDrop1000微量紫外分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)；EnSpire多模式微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)；TaqMan Genotyping Master Mix試劑盒、TaqMan SNP Genotyping Assay Mix試劑盒(含引物和探針)、熱啟動Taq DNA聚合酶(美國ABI公司)；人Rac1-GTP結(jié)合蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，北京天根生化科技有限公司)。

1.1.2 研究對象 選取2014年2～3月期間于武漢協(xié)和醫(yī)院體檢中心進行體檢的182例健康受試者作為研究對象，男女各半。年齡23～85歲，平均(44.7±12.1)歲，性別間年齡分布無統(tǒng)計學差異(P=0.33)。所有研究對象均為漢族，無血緣關系；無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)等病史，無腫瘤病史；體格檢查、ECG、胸片、B超及實驗室檢查均未見臨床意義的異常。該研究項目通過華中科技大學醫(yī)學倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理 采集健康受試者靜脈血3 ml，經(jīng)EDTA抗凝，于3 000 r/min離心10 min，取離心后的上層血漿置于-70℃以下冰箱中保存用于Rac1-GTP結(jié)合蛋白水平的測定。再將分離后的白細胞層采用DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，按照試劑盒的說明書操作。提取后的DNA經(jīng)微量紫外分光光度儀進行濃度與純度的測定，濃度均在1～20 ng/μl之間，OD260/OD280值均在1.6～2.0之間，純度滿足要求。將測定合格后的DNA置于-70℃以下冰箱中保存用于基因型分析。

1.2.2 基因型分析[11]采用實時熒光TaqMan-MGB探針等位基因分型技術對課題組前期篩選出的4個tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)進行基因分型檢測。10 μl的PCR反應體系包括：5 μl TaqMan? Genotyping Master Mix，1.0 μl TaqMan? SNP Genotyping Assay Mix，1.0 μl DNA樣本，3 μl 純化水。PCR擴增反應條件為：95℃預變性4 min，激活Ampli Taq酶；然后94 ℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)，72℃最終延伸2 min。反應結(jié)束由ABI Prism? 7900HT實時熒光PCR等位基因辨別系統(tǒng)(SDS v2.3 Allelic Discrimination Software)確定各DNA樣本的基因分型結(jié)果。對4個tag-SNPs位點的各基因分型PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序驗證。

1.2.3 Rac1-GTP結(jié)合蛋白水平測定 人血漿中Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達水平的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，選用人Rac1-GTP ELISA試劑盒。嚴格按照試劑盒使用說明書方法對稀釋后的標準品及樣品進行加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、加終止液。終止反應后15 min內(nèi)于酶標儀依序測定各孔的450 nm波長處的吸光度。人血漿樣本中Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達水平的結(jié)果由標準曲線讀取。

2 結(jié)果

2.1RAC1基因分型 實時熒光TaqMan-MGB探針等位基因分型測定結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，各tag-SNPs位點的基因分型測序驗證結(jié)果，見圖1。4個tag-SNPs位點基因型的分布，經(jīng)χ2檢驗均符合Hardy-weinberg遺傳平衡，性別間分布無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 各tag-SNPs位點的基因型分布

Tab.1 Genotypic distributions of 4 tag-SNPs

SNPsGenotypeTotal[n(%)]Male[n(%)]Female[n(%)]P1)P2)rs702482AA53(291)26(286)27(297)019061AT82(451)44(484)38(418)TT47(258)21(231)26(286)rs10951982GG118(648)60(659)58(637)026085GA54(297)27(297)27(297)AA10(55)4(44)6(66)rs702483AA134(736)66(725)68(747)072079AG45(247)24(264)21(231)GG3(16)1(11)2(22)rs6954996GG133(731)67(736)66(725)093073GA45(247)23(253)22(242)AA4(22)1(11)3(33)

Note：1)Hardy-Weinberg equilibrium test;2)Comparison between male and female subjects.

圖1 各tag-SNPs位點基因分型測序圖Fig.1 Representative figures of direct sequencing for four tag-SNPs

2.2 Rac1-GTP結(jié)合蛋白活性分布 182例健康受試者的血漿樣本經(jīng)ELISA法測定，Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達水平為(222.30±108.85)ng/L，通過Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達水平呈正偏態(tài)分布(偏度=1.921，P<0.05)，見圖2A；將數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)化后，符合正態(tài)分布(P=0.23)，見圖2B。

將數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后進行單因素方差分析，考察年齡和性別因素是否會影響Rac1-GTP蛋白的表達。Rac1-GTP蛋白在男、女性別間的表達分別為(199.83±88.75) ng/L和(244.76±122.20) ng/L，女性中Rac1-GTP蛋白的表達高于男性；性別間存在顯著性差異(P<0.05)。將受試者按年齡分為青年組(18～40歲)、中年組(41～60歲)和老年組(≥61歲)隨著年齡的增加Rac1-GTP結(jié)合蛋白的表達水平有降低的趨勢，但經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后的方差分析顯示在三個年齡組間表達無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

圖2 Rac1-GTP表達水平分布圖Fig.2 Distribution of Rac1-GTP expression levelsNote:A.Data without log-transform;B.Data with log-transform.

表2 不同性別、年齡組間Rac1-GTP蛋白表達水平

Tab.2 Rac1-GTP expression levels in different gender and age groups

GroupnRac1?GTPlevel(ng/L)P1)Gender0003Male9119983±8875Female9124476±12220Age21-407023207±10268040641-609521770±11672≥611720772±88130

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

表3 4個tag-SNPs不同基因型間Rac1-GTP蛋白表達水平

Tab.3 Rac1-GTP expression levels in different genotypes of four tag-SNPs

SNPsGenotypeRac1?GTPlevel(ng/L)P1)rs702482AA2650±147200037AT2114±8560TT1931±7774rs10951982GG2409±120700023GA1930±7319AA1611±5917rs702483AA2260±115906600AG2149±8806GG1690±3822rs6954996GG2299±115501300GA1974±8561AA2517±8857

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

圖3 RAC1基因型與Rac1-GTP表達水平相關性Fig.3 Association analysis of RAC1 genotypes with Rac1-GTP expression levelsNote: *.P<0.05；**.P<0.01；ns.P>0.05.

2.3RAC1基因型與Rac1-GTP結(jié)合蛋白活性的相關性RAC1基因4個tag-SNPs不同基因型對應的Rac1-GTP蛋白表達水平及比較，如表3和圖3所示。由結(jié)果可知：Rac1-GTP蛋白表達水平在位點rs702482和rs10951982基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，在位點rs702483和rs6954996基因型間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

3 討論

RAC1是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，具有多種生物學功能，如調(diào)整細胞骨架與遷移、抑制細胞凋亡、調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄因子等；廣泛地分布于全身各組織中[1-4]。

因具有Rho-GTPase高度親和結(jié)合區(qū)，Rac1蛋白在體內(nèi)以具有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間進行轉(zhuǎn)換[4]，而生物功能的發(fā)揮與GTP結(jié)合時激活密切相關。Rac1由RAC1基因編碼，其蛋白表達水平可因RAC1基因堿基的突變而發(fā)生改變。SNP是最普遍的一種基因突變形式，與蛋白個體化表達差異密切相關。目前關于RAC1基因多態(tài)性對Rac1蛋白表達的影響尚未見報道，而已報道的文獻主要與疾病相關性及藥物療效差異有關。如已有研究發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等患者中存在高表達現(xiàn)象[12,13]；RAC1基因的部分SNP位點對某些疾病呈現(xiàn)易感性，如黑色素瘤、炎癥性腸疾病、高血壓等[8,14,15]。此外，嘌呤類免疫抑制藥因通過抑制RAC1的下游靶基因表達和阻斷Rac1活性，發(fā)揮免疫抑制作用，進而RAC1基因和Rac1蛋白對嘌呤類免疫抑制藥的療效及不良反應的差異有影響[9]。本研究以健康志愿者為研究對象，選擇測定Rac1-GTP活性蛋白的表達水平；以課題組前期研究基礎篩選出的4個tag-SNPs作為RAC1基因多態(tài)性的位點，考察RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達的影響，希望能找出與Rac1-GTP蛋白相關的基因多態(tài)性位點，進一步為揭示疾病和藥物效應相關性的分子機制奠定基礎。

本研究入選182名健康受試者，按照年齡匹配，男女各半。所篩選的4個SNP位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明選擇的人群具有代表性；并且無性別間的分布差異(P>0.05)。4個SNP位點的基因型頻率與前期研究結(jié)果及HAPMAP數(shù)據(jù)庫中亞洲人群的報道相接近，但是與非洲和歐洲人群的報道有較大差異。本研究所報道的中國健康人群攜帶rs702482位點AA基因型的頻率(29.1%)遠低于歐洲人群(96.7%)，而攜帶rs702483位點AA基因型的頻率(73.6%)遠高于歐洲人群 (26.4%)。最小等位基因頻率rs702482/T (48.4%)和rs10951982/A (20.3%)分別遠高于歐洲(1.7%)和非洲人群(2.5%)，rs702483/G (14.0%)和rs6954996/A (14.6%)分別明顯低于歐洲(49.1%)和非洲人群(23.3%)。提示RAC1基因上的這4個SNP位點的多態(tài)性存在地域或種族的差異。

完成RAC1基因上4個SNP位點基因分型測定后，進一步考察了RAC1基因編碼的Rac1-GTP蛋白在182名健康受試者血漿中的表達水平。Rac1-GTP蛋白表達水平在中國健康人群中存在男低女高的趨勢(P<0.05)，4個SNP位點的基因型分布未見明顯差異(P>0.05)。提示可能存在其他位點的性別分布差異，進而影響Rac1-GTP蛋白表達性別差異；亦或是男女性別的生理因素差異造成的。因已有大量文獻報道Rac1蛋白的表達與諸多疾病相關，進而推測Rac1-GTP蛋白表達性別差異是否會造成相關疾病發(fā)病率的性別差異，有待大樣本的考察和深入的研究。雖然未觀察到Rac1-GTP蛋白的表達水平在年齡分組間的差異(P>0.05)，但是依舊呈現(xiàn)出了隨著年齡段的增加Rac1-GTP蛋白的表達水平降低的趨勢，可能是由于各年齡組樣本分布不均，老年組樣本量較少，未能滿足顯著性差異的樣本量統(tǒng)計，需要后期大樣本的進一步證實。因為Rac1-GTP蛋白表達水平的差異，使用嘌呤類免疫抑制的患者對于療效和不良反應需要關注性別和年齡因素。

通過分析4個SNP位點的基因型與Rac1-GTP蛋白表達水平的相關性，發(fā)現(xiàn)rs702482位點攜帶AA基因型人群的Rac1-GTP蛋白表達水平高于AT和TT基因型(P<0.05)；rs10951982位點攜帶GG基因型人群的Rac1-GTP蛋白表達水平明顯高于GA和AA基因型。提示SNP位點rs702482和rs10951982的基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達水平存在影響。

本研究僅分析了Rac1活性結(jié)合蛋白Rac1-GTP表達水平在健康人群中的分布特點，并發(fā)現(xiàn)了影響Rac1-GTP表達水平的RAC1基因多態(tài)性位點。已有研究表明Rac1在眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程中起著重要作用。Rac1-GTP在健康人群與腫瘤患者間的表達水平是否存在差異，差異是否會與RAC1基因多態(tài)性相關，需要開展大樣本的病例對照研究進一步確定。課題組后期將擴大樣本量并篩選納入腫瘤病例患者進行對照研究，進一步的綜合分析RAC1基因多態(tài)性與mRNA和Rac1蛋白表達的相關性，探究調(diào)控RAC1基因表達的機制。

[1] 周嘉黎，張 玉，師少軍.Rac1的生物學作用及其調(diào)控機制研究進展 [J].中國藥師,2014，17(1):146-149.

[2] Heasman SJ,Ridley AJ.Mammalian Rho GTPases:new insights into their functions from in vivo studies [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(9):690-701.

[3] Vega FM,Ridley AJ.Rho GTPases in cancer cell biology [J].FEBS Lett,2008,582(14):2093-2101.

[4] Etienne-Manneville S,Hall A.Rho GTPases in cell biology [J].Nature,2002,420(6916):629-635.

[5] Leng R,Liao G,Wang H,etal.Rac1 expression in epithelial ovarian cancer:effect on cell EMT and clinical outcome [J].Med Oncol,2015,32(2):329.

[6] Nagase M,Fujita T.Role of Rac1-mineralocorticoid-receptor signalling in renal and cardiac disease [J].Nat Rev Nephrol,2013,9(2):86-98.

[7] Lezoualc′h F,Métrich M,Hmitou I,etal.Small GTP-binding proteins and their regulators in cardiac hypertrophy [J].J Mol Cell Cardiol,2008,44(4):623-632.

[8] Muise AM,Walters T,Xu W,etal.Single nucleotide polymorphisms that increase expression of the guanosine triphosphatase RAC1 are associated with ulcerative colitis [J].Gastroenterology,2011,141(2):633-641.

[9] Bourgine J,Garat A,Allorge D,etal.Evidence for a functional genetic polymorphism of the Rho-GTPase Rac1.Implication in azathioprine response? [J].Pharmacogenet Genomics,2011,21(6):313-324.

[10] 周嘉黎，劉亞妮，沈如飛，等.中國湖北地區(qū)健康人群RAC1基因多態(tài)性的測定與分析 [J].中國免疫學雜志,2014，30(10):1297-1301.

[11] 劉亞妮，周嘉黎，楊春曉，等.Rac1基因多態(tài)性在湖北漢族腎移植患者中的分布 [J].中國藥學雜志,2014，49(21):1923-1927.

[12] Hernández E,De La Mota-Peynado A,Dharmawardhane S,etal.Novel inhibitors of Rac1 in metastatic breast cancer [J].P R Health Sci J,2010,29(4):348-356.

[13] 章 碩，姜 浩，蘇 琦.Rac1與腫瘤的研究進展 [J].國際病理科學與臨床雜志,2011，31(5):410-414.

[14] Krauthammer M,Kong Y,Ha BH,etal.Exome sequencing identifies recurrent somatic RAC1 mutations in melanoma [J].Nat Genet,2012,44(9):1006-1014.

[15] Tapia-Castillo A,Carvajal CA,Campino C,etal.Polymorphisms in the RAC1 gene are associated with hypertension risk factors in a Chilean pediatric population [J].Am J Hypertens,2014,27(3):299-307.

[收稿2016-03-31 修回2016-05-06]

(編輯 許四平)

Influence of RAC1 gene polymorphisms on Rac1-GTP expression levels

LIU Ya-Ni,ZHOU Jia-Li,YANG Chun-Xiao,LUO Xiao-Mei,YANG Ting-Yu,ZHANG Yu,SHI Shao-Jun,HUNAG Yi-Fei.

Department of Pharmacy,Affiliated Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To study the association ofRAC1 gene polymorphisms with protein expression levels of Rac1-GTP.Methods:A total of 182 healthy Hans population in Hubei were recruited.The 4 tag-SNPs inRAC1 gene were genotyped by Real time TaqMan-MGB genotyping assay.And the Rac1-GTP protein levels in plasma samples from all participants were determined by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA).The distribution characteristics of Rac1-GTP expression levels were also analyzed.Furthermore,the expression levels of Rac1-GTP were compared among different genotypes of the 4 tag-SNPs inRAC1 gene.Results:The distribution of Rac1-GTP expression levels was positive skewed in healthy Chinese Hans population.The expression levels were significantly higher in females than in males (P<0.05),and appeared in decreased trend with age,but without significant differences (P>0.05).Different expression levels of Rac1-GTP were observed in different genotypes for rs702482 and rs10951982 (P<0.05).However,no significant difference was found for rs702483 and rs6954996 (P>0.05).Conclusion:RAC1 genetic polymorphisms can potentially affect the expression levels of Rac1-GTP protein in healthy Chinese Hans population.

RAC1;Gene polymorphisms;Rac1-GTP;Protein expression levels;Healthy Chinese Hans population

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.001

①本文為國家自然科學基金(No.81273591、No.81503161)、湖北省自然科學基金(No.2009CD-B380)和中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(No.2014-YGYL003)資助項目。

劉亞妮(1980年-)，女，碩士，副主任藥師，主要從事遺傳藥理與藥代動力學相關研究，E-mail:yani_liu@hotmail.com。

R394

A

1000-484X(2016)12-1729-05

②通訊作者，E-mail:yf_huang2012@163.com。