韋傳寶 曹佳敏

(皖西學院生物與制藥工程學院，六安237012)

在制備尖吻蝮蛇毒出血毒素抗血清中不同凝膠染色方法的比較①

韋傳寶 曹佳敏

(皖西學院生物與制藥工程學院，六安237012)

目的：尋找在制備出血毒素抗血清中電泳后染色凝膠的好方法。方法：按照前人的方法從皖南產尖吻蝮蛇毒中初步分離3種出血毒素:AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ并獲得3種粗提取的出血毒素，用制備電泳的方法進一步純化AaHⅠ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ，對每種出血毒素，配制6塊制備電泳板并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用6種不同的染色方法分別染色，將含出血毒素的凝膠切下，磨細后直接免疫注射小鼠并獲得抗血清，用ELISA檢測和中和出血毒素出血活性兩種方法檢測抗血清的質量。結果：不同染色方法制備的抗血清中有效IgG濃度不同，用無毒型蛋白質快速染色試劑盒染色制備的抗血清有效IgG濃度最高。結論：用無毒型蛋白質快速染色試劑盒染色是制備抗血清最好的染色方法。

尖吻蝮蛇；出血毒素；抗血清制備；染色法；質量檢測

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus) 俗稱五步蛇，屬于蝮亞科、蝮屬，分布于我國長江以南地區(qū)(包括臺灣)，是我國特有的劇毒蛇。該蛇毒為血循環(huán)型蛇毒,其主要毒素為出血毒素。Xu等[1]最先從皖南產尖吻蝮蛇毒中分離出3種低分子量出血毒素，分別命名為出血毒素Ⅰ(AaH Ⅰ)、出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)和出血毒素 Ⅲ(AaH Ⅲ)；隨后Zhu等[2]從皖南尖吻蝮蛇毒中純化出1種中等分子量的出血毒素，命名為出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。在分離的4種出血毒素中，AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ屬于酸性蛋白，AaH Ⅲ屬于堿性蛋白，AaH Ⅰ、AaH Ⅱ、AaH Ⅳ的出血活性強，最小出血劑量(MHD)分別為0.4 μg、1.5 μg和0.4 μg，AaH Ⅲ出血活性弱，最小出血劑量為10.0 μg，該毒素還具有凝聚白細胞的功能[3]。

研究這些蛋白的性質需要對應的抗血清，對于蛇毒出血毒素而言，制備優(yōu)質出血毒素抗血清是研究出血毒素性質的基礎。要想獲得優(yōu)質抗出血毒素血清，必須先獲得純的出血毒素。離子交換層析和分子篩層析純化的出血毒素通常情況下還含有少量的其他雜質蛋白，制備的抗血清含有抗雜蛋白的抗體，因此，抗血清的質量不高。制備電泳的方法是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法分離蛋白質，分離的蛋白質純度高，但缺點是分離的蛋白質量少，而且包含在聚丙烯酰胺凝膠中，去除凝膠比較困難。本研究先通過離子交換層析和分子篩層析將尖吻蝮蛇三種酸性出血毒素進行初步分離純化，然后通過制備電泳進一步純化，用不同的染色方法對凝膠進行染色，切出含出血毒素的蛋白質凝膠條帶，直接將凝膠加生理鹽水磨細后免疫注射小鼠，通過比較幾種染色方法切出的凝膠制備的抗血清質量，為制備優(yōu)質抗出血毒素血清尋找一種方便、可靠的凝膠染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料 尖吻蝮蛇毒購自安徽省祁門縣祁門蛇傷研究所；DEAE-Sephadex A-50、CM-Sephadex C-25、Sephadex G-75、DE52、羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶購自Sigma公司；可逆型鋅染試劑盒(產品編號：C510019)、可逆型銅染試劑盒(產品編號：C510017)、高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒(產品編號：C510041)和無毒型蛋白質快速染色試劑盒(產品編號：C503011)、考馬斯亮藍R250、SDS購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產分析純；小鼠購自安徽醫(yī)科大學，規(guī)格18～22 g；蛋白質純化系統(tǒng)(GE公司)；層析柜(普析通用公司)；酶標儀(伯樂公司)；電泳儀、電泳槽(百晶科技公司)等。

1.2 方法

1.2.1 三種酸性出血毒素的初步分離純化 按照Xu等[1]的方法初步純化出血毒素Ⅰ(AaHⅠ)和出血毒素 Ⅱ(AaH Ⅱ)；按照Zhu等[2]的方法從皖南尖吻蝮蛇毒中初步純化出血毒素Ⅳ(AaH Ⅳ)。

1.2.2 出血活性的檢測 傳統(tǒng)的出血活性檢測是用家兔皮內注射的方法，最小出血劑量為產生直徑10 mm出血斑點的出血毒素量[4]。本研究用18～22 g小鼠檢測出血活性。小鼠有出血敏感、試驗方便、成本低的優(yōu)點。采用1 ml的注射器，將待測樣品總量控制在0.12 ml，如果少于0.12 ml用生理鹽水補齊。將樣品注射到小鼠腹部皮下，每只小鼠腹部注射4個點。30 min后處死小鼠并解剖，出血明顯且出血點直徑10 mm以上確定為有出血活性。對于每一種出血毒素，通過注射不同量出血毒素確定最小出血劑量(MHD)。

1.2.3 制備電泳膠的配制與制備電泳純化出血毒素 制備電泳與檢測電泳區(qū)別在于前者濃縮膠里不插梳子，12%PAGE制備電泳膠的配制見表1。將初步純化的AaHⅠ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ配制成20 mg/ml，每種毒素制備6塊制備電泳凝膠板，每個電泳槽加1.0 ml出血毒素溶液，電泳結束取下凝膠，放塑料盒中待染色。

1.2.4 染色與脫色 將每種毒素電泳后的6塊凝膠分別放置不同的塑料盒中，分別用6種方法染色，第1塊膠用可逆型鋅染試劑盒；第2塊膠用可逆型銅染色試劑盒；第3塊膠用高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒；第4塊膠用無毒型蛋白質快速染色試劑盒；均按照說明書進行染色與脫色；第5塊膠用實驗室配制的常用的考馬斯亮藍染色液(甲醇∶水∶冰乙酸=45∶45∶10，100 ml含0.26 g 考馬斯亮藍R250)染色，用配制的常用脫色液(甲醇∶冰乙酸∶水=300∶100∶600)脫色。第6塊膠先用含SDS的電泳緩沖液(1 000 ml含5.0 g Tris,14.4 g Gly,1 g SDS)浸泡30 min，然后用預先冷卻4℃的0.25 mol/L KCl染色，蛋白質條帶為乳白色。

表1 12% PAGE制備電泳配制表

Tab.1 12% PAGE preparation electrophoresis compon-ent table

ReagentsSeparationgel(12%)36mlConcentrationgel(5%)10mlddH2O118868030%acrylamide144017015mol/LTris?HCl(pH88)90000010mol/LTris?HCl(pH68)00012510%Ammoniumammoniumsulfate036010TEMED0015001

1.2.5 抗血清的制備 每種毒素每個染色組免疫1組小鼠(4只)，共4次免疫注射，二次注射間隔7 d。具體方法為：取1份含出血毒素的膠體，加2 ml生理鹽水，于研缽內充分磨細，將凝膠懸浮液吸入到5 ml規(guī)格的一次性注射器中，免疫注射18～22 g的小鼠，共免疫注射4次，每次每只小鼠注射0.5 ml樣品，第一次注射每只小鼠皮下注射0.25 ml,腹腔注射0.25 ml，第二、第三、第四次免疫均為腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，第四次注射后第3天斷頭取血，6 h后離心獲得抗血清，冷凍保存。

1.2.6 抗血清質量的ELISA檢測[5]將步驟1.2.1中制備的粗提的各種出血毒素用包被液配成5 mg/ml濃度，作為抗原包被液，制備的相應抗血清作為一抗，空白對照為無抗原的包被液，陰性對照為未免疫的小鼠血清，二抗用1/10 000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶，顯色30 min后在酶標儀上測定OD405nm。加制備的抗血清組的吸收光值如果大于陰性對照組吸收光值2.1倍，說明血清中含抗該種毒素的IgG，并與毒素結合，抗血清合格，否則不合格。

1.2.7 抗血清中和出血活性檢測 ELISA檢測呈陽性從理論上說明抗血清中有對應的IgG，抗血清如果能夠中和對應的出血毒素的出血活性將是對抗血清質量的直接證明。對每種毒素，取最小出血劑量分別與6種染色方法制備的抗血清混合，30 min后13 000 r/min離心6 min，將上清液注射小鼠腹部皮下，抗血清的用量均為100 μl。30 min后解剖，確定抗血清是否能夠中和出血活性，中和出血活性強弱直接說明抗血清的質量。

2 結果

2.1 3種酸性出血毒素的初步純化 依據(jù)前人的方法成功分離出四種出血毒素，每種出血毒素純度都較高(圖略)，而且具有出血活性(圖1)。AaH Ⅰ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ的最小出血劑量(MHD)分別為0.5、1.3和0.45 μg，與前人的研究結果基本一致[1,2]。

2.2 染色和脫色后毒素的獲得 因為電泳的樣品是粗提的出血毒素，雜質很少，所有的主條帶(粗條帶)都是出血毒素，因此用手術刀切下出血毒素蛋白條帶(粗條帶)，將含出血毒素的膠條平分成4份，冷凍保存。每種出血毒素獲得6種制備電泳純化后不同染色的凝膠。

圖1 分離的3種出血毒素出血活性檢測Fig.1 Hemorrhagic activities test to purified three kinds of hemorrhagins

2.3 抗血清的制備 經(jīng)過4次免疫，每種出血毒素每組獲得約2.8 ml的小鼠抗血清。

2.4 抗血清質量的ELISA檢測結果 3種出血毒素與對應的6組抗血清反應的ELISA檢測結果見表2。從表2可以看出，第4組用無毒型蛋白質快速染色試劑盒染色制備的抗血清質量比較高，其他抗對應出血毒素血清IgG含量比較低。

2.5 抗血清中和出血活性檢測結果 3種出血毒素與對應的6組抗血清中和出血毒素出血活性試驗結果表3。從表3可以看出，第4組用無毒型蛋白質快速染色試劑盒染色制備的抗血清能夠完全中和對應出血毒素出血活性，其他組制備的抗血清只能部分中和對應出血毒素的出血活性，與ELISA檢測結果相吻合。

3 討論

6組試驗都是同樣的制備電泳，區(qū)別的是染色不同，由于染色劑和脫色劑的成分不同，對出血毒素蛋白的影響也不同。第4組無毒型蛋白質快速染色試劑盒含有單一考馬斯亮藍G-250染色液，膠體狀染色液不含有刺激性的甲醇和冰醋酸，安全無毒，該染色液只與蛋白結合，與膠的結合程度低，不需要固定和脫色，蛋白量大于200 ng 時可以清楚地出現(xiàn)染色條帶，本試劑盒只需要簡單的水洗步驟，不用可能引起蛋白質變性的脫色液。該染色劑染色后出血毒素的蛋白質高級結構基本未變，抗原性完全保留，因此抗血清效價也相對較高?？赡嫘豌~染試劑盒用銅離子與蛋白質結合的方法使蛋白質呈現(xiàn)淡藍色，可逆型鋅染試劑盒用鋅離子結合蛋白質染色，由于過量的銅離子或者鋅離子對小鼠有毒，在免疫注射時凝膠用量少小鼠才不會死亡，抗原少產生的抗體也少，因此中和出血活性的能力弱。高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒的脫色液含甲醇和乙酸，脫色后出血毒素變性，抗原決定簇發(fā)生變化，免疫產生的抗體含量也少，與檢測結果相符合。常規(guī)考馬斯亮藍染色組使用的染色液和脫色液都含甲醇和乙酸，染色后考馬斯亮藍與出血毒素緊密結合，抗原發(fā)生了變化，因此產生的抗體也少，KCl染色組在進行染色前用含SDS的電泳緩沖液浸泡了30 min，出血毒素蛋白質與SDS結合，出血毒素的結構發(fā)生了變化并失去活性，抗原性也發(fā)生了變化，可以預期產生的抗體也少。

表2 3種出血毒素分別與6組對應抗血清反應的ELISA檢測結果

Tab.2 ELISA test results between three kinds of hemorrhagins with its antiserums

HemorrhaginGroupone(ProteinStainsZn)OD405nmGrouptwo(ProteinStainsCu)OD405nmGroupthree(ProteinStainsH)OD405nmGroupfour(ProteinStainsL)OD405nmGroupfive(commonCoomassiebrilliantblue)OD405nmGroupsix(KCldyeing)OD405nmAaHⅠ134013501457240013001489AaHⅡ143313351309214912801567AaHⅣ140213501240249011301245

表3 6組抗血清中和3種出血毒素出血活性結果

Tab.3 Results of neutralization of hemorrhagic activities by its antiserums

HemorrhaginNeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupone(ProteinStainsZn)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGrouptwo(ProteinStainsCu)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupthree(ProteinStainsH)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupfour(ProteinStainsL)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupfive(commonCoomassiebrilliantblue)NeutralizationofhemorrhagicactivityabilityofGroupsix(KCldyeing)AaHⅠ+++++++++++AaHⅡ+++++++++++AaHⅣ+++++++++++

制備電泳分離的出血毒素包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，免疫注射后，出血毒素從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動物體內，抗原不但在動物體內停留時間長，充分刺激免疫系統(tǒng)，聚丙烯酰胺凝膠也替代了昂貴的弗氏佐劑。

綜上所述，在6種染色方法中，無毒型蛋白質快速染色試劑盒染色制備的蛋白質抗原性保留最完整，免疫小鼠制備的抗血清質量最好，該染色試劑盒可以推廣到其他蛋白質抗血清的制備中。

[1] Xu X，Wang C，Liu J，etal.purification and characterization of hemorrhagic components from Agkistrodon acutus (hundred pace snake) venom[J].Toxicon,1981,19(5):633-644.

[2] Zhu ZL,Gong WM,Zhu XY,etal.Purification,characterization and conformational analysis of a haemorrhagin from the venom of Agkistrodon acutus[J].Toxicon,1997,35(2):283-292.

[3] Wei CB,Chen J，Li JH.Acutolysin C,a weak hemorrhagic toxin from the venom of Agkistrodon acutus with leucoagglutination activity[J].J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis，2011，17(1):34-41.

[4] Kondo H,Kondo SI,kezawa H,etal.Studies on the quantitative method for determination of hemorrhagic activity of Habu snake venom[J].Japan J Med Sci Biol，1960，13:43-51.

[5] 徐宜為編著.免疫檢測技術[M].第3版.北京：科學出版社，1991：158-183.

[收稿2016-08-12 修回2016-09-28]

(編輯 倪 鵬)

Comparative studies by different dyeing methods on antiserum preparation against hemorrhagins from Agkistrodon acutus venom

WEI Chuan-Bao,CAO Jia-Min.

Biological and Pharmaceutical Engineering College,West Anhui University,Liuan 237012,China

Objective:In order to look for a good method for preparation of hemorrhagin antiserum.Methods: Three kinds of hemorrhagins including AaH Ⅰ, AaH Ⅱ, and AaH Ⅳ were purified from Agkistrodon acutus venom according to predecessors′s methods and crude AaH Ⅰ, AaH Ⅱ and AaH Ⅳ were obtained. Preparation electrophoresis was used to purify AaH Ⅰ，AaH Ⅱand AaH Ⅳ further. As for an hemorrhagin, six different dyeing methods were used to dye PAGE gel and the gel contained hemorrhagin was obtained respectively. The ground gel contained hemorrhagin was used to immune mice and its antiserum was obtained. Antiserums quality was tested through ELISA test and neutralization of the hemorrhagic activities of corresponding hemorrhagin. Results: Effective IgG concentration in different antiserum was different and effective IgG made through non toxic type protein fast stain reagent kit was higher than others. Conclusion: Non toxic type protein fast stain reagent kit is the best dyeing method among the six dyeing methods.

Agkistrodon acutus;Hemorrhagin;Antiserum preparation;Dyeing;Quality test

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.015

①本文為安徽自然科學基金項目(1408085MC43)和安徽省教育廳自然科學重點項目(KJ2015A454，KJ2013A264)。

韋傳寶(1961年-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事蛇毒蛋白方面的研究，同時就職于皖西學院抗體制備及其質量檢測中心，E-mail:weichuanbao@sina.com。

R991

A

1000-484X(2016)12-1793-04