苗同國 王立靜 馬立偉 陳午盛 邵明亮 段玉松 穆永旭

(石家莊市第五醫(yī)院介入科，石家莊 050021)

·實驗研究·

射頻消融治療對原發(fā)性肝癌患者T細胞免疫功能的影響*

苗同國 王立靜 馬立偉 陳午盛 邵明亮 段玉松 穆永旭**①

(石家莊市第五醫(yī)院介入科，石家莊 050021)

目的 探討射頻消融(radio frequency ablation，RFA)前后原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)患者T細胞亞群的變化。 方法 采用流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測2011年1月～2013年6月40例PHC患者RFA術前24 h與術后1周、4周時外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Treg細胞的變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清Th1型細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量。選擇40例健康志愿者作為對照組。 結果 術前肝癌患者外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯低于健康對照組，CD8+、Treg細胞明顯高于健康對照組(P<0.01)；肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯低于健康對照組(P<0.01)。術后1周，肝癌患者CD3+、CD8+、CD4+/CD8+與術前相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后4周CD3+、CD4+明顯升高，CD8+明顯降低(P<0.05)；Treg細胞術后1周、4周與術前比較均明顯降低(P<0.01)。RFA治療1周、4周IL-2、IFN-γ、TNF-α較治療前均明顯升高(P<0.01)。 結論 射頻消融可以改善肝癌患者短期內的T淋巴細胞功能，促進Th1型細胞因子分泌，從而對原發(fā)性肝癌患者的免疫狀況產生有益的影響。

原發(fā)性肝癌； 射頻消融； T細胞亞群； Th1型細胞因子； 細胞免疫功能

對于原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinomas，PHC)，肝切除術、肝移植和肝部分切除術是肝細胞肝癌唯一的根治方法，雖然有早期的檢出計劃，但是大多數(shù)患者確診時仍為中晚期，只有20%～30%的患者可以手術切除[1]。射頻消融(radio frequency ablation,RFA)是近年發(fā)展起來的一種治療腫瘤的新技術，具有微創(chuàng)、安全、適應證寬、耐受性好、療效肯定、并發(fā)癥少等特點，已應用于各種實體腫瘤，尤其是肝癌的治療，己經成為繼手術切除、介入治療后的第三大肝癌治療手段，而且由于其療效確切，特別是在小肝癌的治療方面，射頻消融療效與手術切除相近，被認為是小肝癌的根治性治療手段之一[2]。

近年來，許多學者認為，RFA不僅能直接滅活腫瘤，治療后還能增加腫瘤局部和外周血中免疫細胞數(shù)量及抗腫瘤功能，提高機體免疫力可能是治療腫瘤的另一種作用。我們選取我院2011年1月～2013年6月經臨床或肝穿刺病理證實為原發(fā)性肝癌患者40例，通過觀察RFA術前24 h與術后1周、4周時外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+T細胞，CD4+/CD8+，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)，以及Th1型細胞因子白介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，探討RFA對肝癌患者外周血T細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

病例選擇標準：依據(jù)衛(wèi)生部《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011版)》[2]選取原發(fā)性肝癌，并且符合：①不適合手術切除的直徑≤5 cm單發(fā)腫瘤，或最大直徑≤3 cm的多發(fā)(≤3個)腫瘤，無血管、膽管和鄰近器官侵犯以及遠處轉移；②無肝臟腫瘤射頻消融禁忌證[3]。

所選40例肝癌患者，男31例，女9例。年齡28～71歲，(56.2±13.8)歲。單發(fā)病灶25例，雙病灶11例，三病灶4例，共59處病灶。病灶直徑<3 cm 37處，3～5 cm 22處。均有乙型肝炎病史，治療前均在接受核苷類藥物抗病毒治療。以年齡、性別相同為匹配條件選擇40例正常體檢志愿者作為對照組。所有研究對象均無糖尿病、類風濕、甲狀腺功能亢進等自身免疫性疾病史和免疫治療史。

1.2 射頻消融步驟

采用美國RITA射頻消融治療系統(tǒng)(RF-1500)，消融電極針為RITA-Star Burst XL多極腫瘤消融電極及皮膚電極(美國硅谷公司生產)。術前禁食，肌內注射哌替啶50 mg、異丙嗪25 mg。取仰臥位，建立靜脈通路，常規(guī)消毒鋪巾，依據(jù)腫瘤部位尋找合適進針路線，確定穿刺點。在CT引導下將射頻針穿刺至預定部位，根據(jù)腫瘤大小和位置，RITA消融參數(shù)為：溫度80～100 ℃，時間10～30 min。消融范圍包括腫瘤及瘤周0.5～1.0 cm肝組織。

1.3 觀察指標

抽取40例健康志愿者和40例PHC患者術前24 h肘靜脈血3 ml作為基線，并于RFA術后1周和4周抽取40例PHC患者肘靜脈血3 ml，用于測定外周血免疫細胞亞群和相關免疫細胞因子。

流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Treg細胞含量。嚴格按照試劑說明進行，采用德國美天妮MACS Quant流式細胞儀檢測并分析免疫細胞亞群。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α含量。嚴格按試劑說明書進行，采用美國Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波長酶標儀測定并記錄結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1RFA治療前肝癌患者與健康對照組T細胞亞群和Th1型細胞因子水平的比較

見表1。肝癌患者術前外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著低于健康對照組，CD8+、Treg細胞明顯高于健康對照組(P<0.01)；肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯低于健康對照組(P<0.01)。

2.2 RFA治療前后肝癌患者外周血T細胞亞群的變化

見表2。與術前比較，術后1周肝癌患者CD3+、CD8+、CD4+/CD8+無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后4周，CD3+、CD4+明顯升高，CD8+明顯降低(P<0.05)；Treg細胞術后1周、4周與術前比較均明顯降低(P<0.01)。

2.3 RFA治療前后肝癌患者血清Th1型細胞因子含量比較

見表3。治療1周和4周后肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α含量較術前明顯升高(P<0.01)。

時間IL-2IFN-γTNF-α術前24h①86.14±7.5338.62±6.2862.35±7.21術后1周②96.52±3.2751.05±3.7074.04±6.89術后4周③100.39±11.9453.73±5.2678.38±5.85t1-2,P值-7.977,0.000-10.785,0.000-7.414,0.000t1-3,P值-6.385,0.000-11.666,0.000-10.919,0.000

3 討論

針對PHC的基礎和臨床研究一直是腫瘤學科研究的重點和熱點。加強對機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測，對于肝癌患者病情評估、臨床診療方案的制定、完善肝癌治療模式和提高療效具有重要作用[4]。機體免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉歸關系密切，其中T細胞在機體抗腫瘤的免疫調節(jié)中起著舉足輕重的作用[5]。

CD3+細胞代表成熟的T淋巴細胞，是細胞免疫中主要的活性細胞。可分為CD4+和CD8+T細胞2個亞群。在正常情況下，淋巴細胞亞群中CD4+細胞和CD8+細胞處于一個相對穩(wěn)定平衡狀態(tài)，維持機體免疫功能。但在癌癥患者，機體免疫力常遭到不同程度的破壞，表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值下降[6]，抗腫瘤作用減弱，以致有利于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Treg細胞是近年發(fā)現(xiàn)的非常重要的免疫負調節(jié)性細胞[7]，能抑制抗腫瘤效應細胞的活化和增殖，與腫瘤免疫逃逸有關[8]。Yang等[9]分析25例肝細胞肝癌的肝組織，觀察到癌旁組織的Treg細胞比例高于癌遠端組織。研究[10，11]顯示肝癌患者Treg細胞比例明顯高于正常人群，而淋巴細胞總數(shù)偏低，同樣提示肝癌患者存在不同程度的免疫抑制。因此，通過測定這些淋巴細胞亞群數(shù)目可從側面反映腫瘤患者免疫狀態(tài)。

本研究結果顯示，與健康對照組相比，肝癌患者存在細胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為外周血CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，Treg細胞明顯升高，提示肝癌患者的細胞免疫功能穩(wěn)態(tài)處于明顯抑制水平。40例原發(fā)性肝癌患者射頻消融治療4周后，T細胞亞群及Treg細胞產生了明顯和積極的變化，與治療前相比，均有顯著性差異，一定程度上說明射頻消融治療可以在短時間內使機體細胞免疫功能有所改善，在抗腫瘤治療中對肝癌患者是有益的。

癌變過程中，CD4+T細胞被激活并向4種方向發(fā)生極化，即Th1、Th2、Th17和Treg細胞。多數(shù)研究[12～14]認為機體的抗腫瘤作用以Th1介導的細胞免疫為主，其與抗腫瘤免疫效果有關，而Treg細胞則發(fā)揮相反的抑制作用，特別是在腫瘤晚期，Treg細胞在腫瘤局部富集，加速腫瘤的進展。因此，對于腫瘤的預防和治療，原則上應優(yōu)先考慮應用多種手段促進Th1細胞極化和功能激活。RFA治療后可以導致Th1型細胞因子明顯增多，促進Th0向Th1偏移，從而增強機體抗腫瘤細胞免疫功能。本研究結果顯示RFA后1周Th1型細胞因子分泌明顯增多，說明RFA可以在短期內激活Th1型免疫，并持續(xù)至術后4周。

本研究結果顯示，RFA在改善腫瘤患者的免疫抑制狀態(tài)上發(fā)揮了積極有益的作用，不但促進Th1型細胞因子的表達，進而促進細胞毒性T細胞的分化和殺傷作用，而且抑制Treg細胞導致的免疫抑制狀態(tài)，以產生有效的抗腫瘤免疫。

1 Lencioni R,Cioni D,Donati F,et al.Combination of interventional therapies in hepatocellular carcinoma.Hepatogastroenterology,2001,48(37):8-14.

2 中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011版).臨床肝膽病雜志，2011,27(11):1141-1159.

3 鄭加生,徐 克,騰皋軍，等.經皮肝臟腫瘤射頻消融治療操作規(guī)范專家共識.中華放射學雜志,2012,46(7):581-585.

4 O’Beirne JP,Harrison PM.The role of the immune system in the control of hepatocellular carcinoma.Eur J Gastroenterol Hepatol,2004,16(12):1257-1260.

5 王志利,張躍偉,徐丹鳳.射頻消融治療肝癌后機體免疫功能變化的研究進展.當代醫(yī)學,2012,18(14):24-25．

6 Cho Y,Miyamoto M，Kato K,et al.CD4+and CD8+T cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,2003,63(7):1555-1559.

7 Chen X,Du Y,Huang Z.CD4+CD25+Treg derived from hepatocellular carcinoma mice inhibit tumor immunity.Immunol Lett,2012,148(1):83-89.

8 Delhem N,Carpentier A,Moralès O,et al.Regulatory T-cells and hepatocellular carcinoma: implication of the regulatory T lymphocytes in the control of the immune response. Bull Cancer,2008,95(12):1219-1225.

9 Yang XH,Yamagiwa S,Ichida T,et al.Increase of CD4+CD25+regulatory T-cells in the liver of patients with hepatocellular carcinoma.J Hepatol,2006,45(2):254-262.

10 陳 中,晏建軍,黃 亮,等.肝癌微環(huán)境中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞與T細胞免疫的關系.臨床肝膽病雜志,2008,24(1):38-40.

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12 Yan-bin Wang,Wei-Guo Xu,He-liang Liu,等.Effects of Radiofrequency Ablation on Lymphocyte Subsets and Tppe1/ Tppe2 T Cell Subpopulations in Patients with Hepatocellular Carcinoma.中國癌癥研究(英文版),2009,21(4):310-317.

13 Armeanu S,Krusch M,Baltz KM,et al.Direct and natural killer cell-mediated antitumor effects of low-dose bortezomib in hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res,2008,14(11):3520-3528.

14 李 剛，寸英麗，楊麗春.肝癌患者射頻消融后血清Th1、Th2型細胞因子的變化.肝膽胰外科雜志，2010,22(2)：94-96.

(修回日期：2016-03-22)

(責任編輯：王惠群)

Influence of Radio Frequency Ablation on T Lymphocyte Subsets in Patients with Primary Liver Cancer

MiaoTongguo,WangLijing,MaLiwei,etal.

DepartmentofInterventionalRadiology,FifthHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050021,China

MuYongxu,E-mail:myx6738@sohu.com

Objective To investigate changes of T lymphocyte subsets in patients with primary hepatocellular carcinoma (PHC) after radio frequency ablation (RFA). Methods A total of 40 patients with pathologically-proved PHC (study group) were enrolled in our study during the period from January 2011 to June 2013. Peripheral blood CD3+, CD4+and CD8+T cells as well as CD4+/CD8+, CD4+CD25+Treg cells were determined 24 h before RFA and at 1 and 4 weeks after RFA in all the patients by using flow cytometry assay. Serum Th1 type cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α) were analyzed by ELISA assay. Another 40 healthy volunteers were collected and used as the control group. Results As compared to the control group, the CD3+, CD4+T cells, CD4+/CD8+, IL-2, IFN-γ and TNF-α in the study group were significantly lower while CD8+T cells and CD4+CD25+Treg cells were higher (P<0.01) 24 h before RFA. As compared to 24 h before RFA, the peripheral T lymphocyte subsets CD3+, CD8+T cells and CD4+/CD8+at 1 week after RFA had no statistically changes in the study group (P>0.05), while after 4 weeks CD3+, CD4+T cells were significantly increased and CD8+T cells significantly decreased (P<0.05). The Treg cells were obviously reduced at 1 week and 4 weeks after RFA (P<0.01). Additionally, serum IL-2, IFN-γ and TNF-α levels in the study group raised significantly after 1 week and 4 weeks (P<0.01). Conclusion RFA can improve immune functions of T lymphocytes and promote secretion of Th1 type cytokines, which benefits the immune functions against primary hepatocellular carcinoma.

Primary hepatocellular carcinoma; Radio frequency ablation; T lymphocyte subsets; Th1 type cytokines; Cellular immune function

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(ZD20140284)

A

1009-6604(2016)06-0538-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.06.017

2015-12-22)

**通訊作者，E-mail：myx6738@sohu.com

①(包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院介入科，包頭 014010)