李 佳

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PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在紅景天苷保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制

李 佳

目的 研究磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)信號(hào)傳導(dǎo)通路在紅景天苷保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。方法 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，復(fù)制心肌缺血再灌注損傷(I/R)模型，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組(Sham)、心肌缺血-再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預(yù)防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預(yù)防組+P13K特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+P13K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)，每組6只。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、AKT磷酸化(p-AKT)、糖原合酶激酶(GSK3-b)、GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-AKT、p-GSK3-b蛋白表達(dá)。結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western Blot結(jié)果顯示：與 I/R組相比，紅景天苷預(yù)防組、治療組大鼠心肌組織中AKT、GSK3-b的磷酸化激活程度顯著升高(P<0.05)，紅景天苷預(yù)防組和治療組組間AKT、GSK3-b磷酸化狀態(tài)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，此變化被PI3K特異性抑制劑LY294002部分阻斷(P<0.05)；I/R組與Sham組相比，AKT、GSK3-b磷酸化蛋白表達(dá)略增加，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 紅景天苷對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，推測(cè)其可能機(jī)制主要與激活PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)通路等因素有關(guān)。

心肌缺血-再灌注損傷；紅景天苷；磷脂酰肌醇-3激酶；絲氨酸；糖原合酶激酶-3b

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡、存活以及增殖等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。2004年Hausenloy等[1]首次提出再灌注損傷激酶(RISK)信號(hào)通路，是一組促細(xì)胞存活的蛋白激酶，包括PI3K-AKT 和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)，它們?cè)谠俟嘧⒌膸追昼妰?nèi)激活，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的關(guān)鍵通路。多種生長(zhǎng)因子、癌蛋白和生存因子能引起受體酪氨酸的磷酸化，激活 PI3K 形成磷酸化肌醇磷脂產(chǎn)物PIP3，PIP3作為第二信使將細(xì)胞外信號(hào)傳遞給PI3K下游的靶蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的磷酸化過(guò)程就是其中之一?；罨腁KT具有抗心肌缺血缺氧、抗心肌細(xì)胞凋亡等作用。繼而使之脫離質(zhì)膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)糖原合酶激酶(GSK3-b)、p70S6蛋白激酶(p70S6K)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及抗凋亡因子 Bcl-2 等的表達(dá)[2-4]產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。Wu 等[5]研究發(fā)現(xiàn)：舒芬太尼藥物后處理可以縮小心肌梗死面積，同時(shí)觀察到藥物后處理組AKT、GSK3-b磷酸化水平增高，PI3K 抑制劑可消除舒芬太尼藥物后處理的心肌保護(hù)作用，推測(cè)其通過(guò)PI3K/AKT/GSK-3b信號(hào)通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重240 g±10 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。全部大鼠分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，在一定濕度(60%)和室溫(25 ℃)的空間內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 紅景天苷20 mg：HPLC檢測(cè)純度≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司；10%水合氯醛、10%甲醛溶液，0.9%氯化鈉注射液，雙蒸水：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科提供；AKT抗體：購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)：#4685)；p-AKT抗體：購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)：#2965)；GS3K-b抗體：購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)：#9315)；p-GS3K-b抗體：購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)：#9322)；PI3K抑制劑LY294002：購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)：#9901)；DAB Kit ：中國(guó)福州邁新生物科技有限公司DAB-1031；蘇木素染色液：南京建成生物工程研究所D005。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)：成都泰盟科技有限公司；12導(dǎo)自動(dòng)分析心電圖機(jī)：北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司；超低溫保存箱：中國(guó)海爾公司BCD-258A/C；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)：HH-1)：金壇瑞爾電器有限公司；生物倒置顯微鏡：日本Olympus IX51；Image-Pro Plus 6.0 軟件：美國(guó) Media Cybernetics公司。

1.4 方法

1.4.1 分組方法 雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重240 g±10 g。將全部大鼠編號(hào)，采用數(shù)字化隨機(jī)分組：假手術(shù)組(Sham)、心肌缺血再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預(yù)防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預(yù)防組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)，每組6只。飼養(yǎng)于恒溫凈化通風(fēng)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水。

1.4.2 模型制備方法 大鼠稱重240 g±10 g，按文獻(xiàn)[6]復(fù)制模型，以10%水合氯酸(0.32 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于鼠板，針狀電極穿刺四肢皮下接心電圖機(jī)心電監(jiān)護(hù)，在50 W燈泡頸部照射下，將大鼠舌頭拉出，以防舌根后墜。頸部及左胸備皮，頸前正中縱向剪開(kāi)大鼠皮膚(長(zhǎng)約2 cm)，充分暴露氣管，分離出氣管，于氣管軟骨間隙中橫向切開(kāi)氣管壁，右手持16G靜脈留置針套管迅速插入，后拔出管芯，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，輔助呼吸參數(shù)為：呼吸頻率80次/min～100次/min，潮氣量3 mL/kg，呼吸比為5∶2。于大鼠胸骨左緣第3、4助間，距胸骨左緣0.5 cm處依次切開(kāi)皮膚、淺筋膜、深筋膜，用血管鉗鈍性分離胸大肌及前鋸肌，逐步剪開(kāi)肋間肌，用自制拉鉤牽開(kāi)胸廓，注意用棉球保護(hù)肺葉以免肺出血，小心打開(kāi)心包，充分暴露心臟。于肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，用棉簽挑起左心耳，并于其根部下方3 mm～5 mm處進(jìn)針，使用5/0縫合線，進(jìn)針深度0.5 mm左右，寬度2 mm左右。并聯(lián)合冠脈充氣球囊一同結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。清除胸腔內(nèi)積血，暫時(shí)關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組僅在左冠狀動(dòng)脈穿線不結(jié)扎，直接關(guān)胸。結(jié)扎成功的標(biāo)志為：心電圖標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)上ST段上抬、QRS波出現(xiàn)形似左束支傳導(dǎo)阻滯樣的寬大畸形，左室前壁局部顏色蒼白或發(fā)紺。結(jié)扎30 min后，松開(kāi)球囊開(kāi)始再灌注。冠脈再通的標(biāo)志為：抬高的ST段下降50%以上，QRS波幅變窄而低，缺血區(qū)心肌蒼白或發(fā)紺色轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)。關(guān)閉呼吸機(jī)，拔出導(dǎo)管，加壓縫合氣管周圍肌肉及皮膚。并將大鼠置于恒溫下待其蘇醒。

1.4.3 給藥方法 紅景天苷預(yù)防組和預(yù)防組+LY組在造模前連續(xù)給藥3 d，1次/日，紅景天苷12 mg/kg腹腔注射；紅景天苷治療組和治療+LY組在再灌注即刻加予紅景天苷12 mg/kg腹腔注射，Sham組和I/R組均給予等量的生理鹽水腹腔注射。紅景天苷預(yù)防+LY組和紅景天苷治療+LY組于術(shù)前10 min給予腹腔注射磷脂酰肌醇3激酶特異性抑制劑LY294002(溶于DMSO)0.3 mg/(kg·d)。

1.4.4 蛋白表達(dá)檢測(cè)及磷酸化狀態(tài) 采用改良RIPA緩沖液提取心肌組織中蛋白質(zhì)，BCA比色法測(cè)定所提取蛋白的濃度。分離膠12%，濃縮膠5%，按照SDS-PAGE試劑盒說(shuō)明書(shū)配方依次加入制備試劑。將樣品用微量加樣器按一定順序加到孔內(nèi)。電流20 mA，電壓70 V，130 min，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出凝膠底部時(shí)即可終止電泳。恒壓70 V轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜放入培養(yǎng)皿中，加封閉液，37 ℃溫育1.5 h。封閉結(jié)束后取出膜TBST洗3次×5 min，用封閉液按比例稀釋一抗(1∶1 000)后敷一抗，4 ℃過(guò)夜。將膜取出封閉液3次×5 min，TBST洗3次×5 min，濾紙吸干，PBS稀釋二抗(1∶2 500)，37 ℃溫育1 h。封閉液3次×5 min，TBST洗3次×5 min，濾紙吸干，應(yīng)用顯影定影法顯像。

2 結(jié) 果

2.1 完成實(shí)驗(yàn)情況 本實(shí)驗(yàn)共用大鼠44只，預(yù)實(shí)驗(yàn)8只，在制備模型過(guò)程中，有4只大鼠因建模失敗剔除(氣管插管失敗1只，結(jié)扎后即刻出現(xiàn)室顫死亡1只，缺血期間發(fā)生無(wú)法糾正的惡性心律失常死亡1只，拔出氣管插管后死亡1只)。

2.2 心肌組織AKT磷酸化狀態(tài) Sham組大鼠心肌組織AKT的磷酸化水平很低，I/R組與Sham組相比，AKT磷酸化(pAKT)蛋白表達(dá)略增加，這可能是大鼠自身的保護(hù)性反饋?zhàn)饔?，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血再灌注后，與 I/R組(p-AKT/AKT 0.56±0.09)相比，紅景天苷預(yù)防組(p-AKT/AKT0.86±0.12)、治療組(p-AKT/AKT 0.73±0.11)大鼠心肌組織中AKT的磷酸化激活程度顯著升高。紅景天苷預(yù)防組和紅景天苷治療組間AKT磷酸化狀態(tài)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而這種激活程度的上升可以被PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷，表現(xiàn)為紅景天苷預(yù)防+LY組(p-AKT/AKT 0.27±0.07)、紅景天苷治療+LY組(p-AKT/AKT 0.36±0.11)AKT磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 各組梗死區(qū)心肌組織 AKT蛋白表達(dá)的代表性條帶

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與預(yù)防組+LY比較，

#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖2 各組梗死區(qū)心肌組織 AKT蛋白表達(dá)

2.3 各組心肌組織GSK3-b磷酸化狀態(tài) Sham組大鼠心肌組織GSK3-b的磷酸化水平很低，I/R組與Sham組相比，GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)蛋白表達(dá)略增加，這可能是大鼠自身的保護(hù)性反饋?zhàn)饔?，兩組 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺血再灌注后，與 I/R組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.47±0.07)相比，紅景天苷預(yù) 防組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.97±0.07)、治療組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.91±0.13)大鼠心肌組織中GSK3-b 的磷酸化激活程度顯著升高。紅景天苷預(yù)防組和紅景天苷治療組比較，GSK3-b磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002后，紅景天苷對(duì)GSK3-b的激活明顯被抑制，表現(xiàn)為紅景天苷預(yù)防+LY組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.21±0.07)、紅景天苷治療+LY組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.30±0.05)GSK3-b磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組梗死區(qū)心肌組織 GSK3-b蛋白表達(dá)的代表性條帶

注：與手術(shù)組比較，*P<0.05；與預(yù)防組+LY比較，#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖4 各組梗死區(qū)心肌組織 GSK3-b蛋白表達(dá)

3 討 論

PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)通路是經(jīng)典的再灌注損傷挽救激酶信號(hào)通路(RISK)之一，具有很多保護(hù)性的調(diào)控作用，如調(diào)節(jié)糖原合成、減少細(xì)胞凋亡、調(diào)控葡萄

糖的轉(zhuǎn)運(yùn)等。Tisser等研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素藥物能夠減輕兔心肌缺血再灌注損傷，且可以觀察到AKT磷酸化增加{6]。隨著研究的不斷深入，大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道很多藥物可以通過(guò)激活RISK進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。RISK信號(hào)通路的激活主要表現(xiàn)為相關(guān)靶點(diǎn)的磷酸化，如PI3K，AKT和GSK3-b的磷酸化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：紅景天苷預(yù)處理、后處理可激活 RISK 通路，使AKT、GSK3-b磷酸化狀態(tài)增多，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。同時(shí)，預(yù)處理、后處理在AKT、GSK3-b磷酸化水平上無(wú)顯著差異，表明二者激活 RISK 通路作用類似，均是有效減輕MIRI的途徑。為了進(jìn)一步證明紅景天苷經(jīng) PI3K/AKT/GSK3-b通路發(fā)揮作用，選擇了PI3K的特異性抑制劑 LY294002進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示治療+LY 組和紅景天苷預(yù)防+LY組的AKT、GSK3-b磷酸化水平較紅景天苷預(yù)防組和治療組顯著降低，且與I/R組比較埋頭差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PI3K信號(hào)通路被抑制，AKT、GSK3-b的磷酸化受限，紅景天苷的心肌保護(hù)作用消失。

綜上所述，紅景天苷對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，由研究結(jié)果推測(cè)，其可能的作用機(jī)制與增加GSK3-b、AKT磷酸化蛋白表達(dá)，激活PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)通路等因素有關(guān)。當(dāng)然本研究仍存在不足，如時(shí)間關(guān)系及實(shí)驗(yàn)條件限制，僅對(duì)紅景天苷抗MIRI的分子生物學(xué)機(jī)制做了初步探討，希望從PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游及下游的相關(guān)通路入手，進(jìn)行更深入的研究，為臨床應(yīng)用提供更豐富的理論依據(jù)。

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(本文編輯郭懷印)

江蘇省常州市德安醫(yī)院(江蘇常州 213000)，E-mail：609234006@qq.com

引用信息：李佳.PI3K/AKT/GSK3-b信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在紅景天苷保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2621-2624.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.009

1672-1349(2016)22-2621-04

2016-03-21)