李 瓊，常志芳，楊國(guó)安，龐春艷,，王永福,△

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010)

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·論著·

1型1-磷酸鞘氨醇受體的siRNA對(duì)人涎腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的作用

李 瓊1，常志芳1，楊國(guó)安2，龐春艷1,2，王永福1,2△

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭 014010)

目的：構(gòu)建靶向1型1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor-1,S1P1)基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)慢病毒表達(dá)載體，感染干燥綜合征細(xì)胞模型——人涎腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(human salivary gland cells，HSG)，探討S1P1的siRNA治療干燥綜合征的可能性，為臨床靶標(biāo)治療提供廣闊的思路。方法：實(shí)驗(yàn)分空白組、空載體組、scramble-siRNA組及S1P1-siRNA組，分別將pLL3.7空載體、構(gòu)建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)載體與pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備病毒，感染HSG細(xì)胞株48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其感染效率，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)HSG細(xì)胞中S1P1 mRNA的表達(dá)水平，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中S1P1蛋白的表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17的表達(dá)水平。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)載體，慢病毒的滴度約為3.5×108TU/mL。(2)感染48 h后S1P1-siRNA組HSG細(xì)胞中S1P1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于空白組、空載體組和scramble-siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)S1P1-siRNA組HSG細(xì)胞中S1P1蛋白的表達(dá)水平低于空白組、空載體組和scramble-siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)S1P1-siRNA組HSG細(xì)胞分泌的IL-17的濃度明顯降低，與空白組、空載體組和scramble-siRNA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(5)S1P1-siRNA組細(xì)胞上清液中IFN-γ的濃度降低，與空白組、空載體組和scramble-siRNA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：成功構(gòu)建了靶向S1P1基因的慢病毒載體，S1P1 siRNA可以使S1P1 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，細(xì)胞上清液中IL-17和IFN-γ的濃度下降，證明S1P1 siRNA可轉(zhuǎn)染HSG細(xì)胞且特異、高效地抑制S1P1基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)，為治療干燥綜合征奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

受體, 鞘磷脂；RNA，小分子干擾；涎腺；腺泡細(xì)胞；遺傳載體

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種侵犯外分泌腺體(以淚腺、唾液腺為主)、具有高度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的彌漫性結(jié)締組織病，臨床主要表現(xiàn)為眼干、口干等癥狀[1]。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)信使和細(xì)胞外介質(zhì)，其作為第一信使與細(xì)胞膜上相應(yīng)的S1P受體相互作用調(diào)節(jié)免疫功能，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用。位于細(xì)胞膜上的S1P受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(guanosine-binding protein coupled receptor，GPCR)家族，分別為1～5型S1P受體(S1P1～S1P5)，不同受體在不同時(shí)間的表達(dá)激活會(huì)發(fā)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。S1P1是淋巴細(xì)胞的重要受體，與淋巴細(xì)胞的再循環(huán)相關(guān)，其成為很多疾病的治療靶標(biāo)。S1P/S1P1信號(hào)參與多發(fā)性硬化癥[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]、SS[4]等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。

人涎腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(human salivary gland cells，HSG)來(lái)源于一位口底癌患者的頜下腺，該患者經(jīng)過(guò)放射治療后取出頜下腺，病理檢查未見(jiàn)癌變，經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)、篩選、克隆出了HSG細(xì)胞，它與涎腺的發(fā)生和生長(zhǎng)有一定的關(guān)系，常被用來(lái)研究SS。本研究采用慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)沉默HSG細(xì)胞中S1P1基因的表達(dá)，探討S1P1基因的siRNA對(duì)HSG細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，實(shí)時(shí)熒光PCR儀Line Gene 9640購(gòu)自BIOER公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，載體PLL3.7購(gòu)自美國(guó)Origene公司，pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV購(gòu)自美國(guó)Addgene公司，AxyPrep質(zhì)粒DNA大量抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，lipofectamineTM2000、二抗購(gòu)自美國(guó)Invotrigen公司，一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，ELISA試劑盒(RD國(guó)內(nèi)分裝試劑盒)購(gòu)自上海生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Elbashir的設(shè)計(jì)原則，并參考在線(xiàn)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件(http：//www.ambion.com/techlib/mis/siRNA-finder.html)確定靶序列。針對(duì)S1P1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)1段siRNA，序列為：CGCGGACTAGGAGAACAGGAACAAA，同時(shí)設(shè)計(jì)1段scramble siRNA，序列為：CGCGGACAAGGAGAACAGCATTAAA。將上述序列插入經(jīng)HpaⅠ、XhoⅠ雙酶切后的質(zhì)粒載體pLL3.7中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，陽(yáng)性克隆送Invotrigen公司進(jìn)行DNA基因測(cè)序分析鑒定慢病毒表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

1.3 慢病毒的包裝和滴度測(cè)定

慢病毒包裝前1天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞調(diào)整為6×106/mL接種在60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵育箱內(nèi)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。將空載體pLL3.7、慢病毒載體pLL3.7-S1P1-siRNA(30 μL)及pLL3.7-S1P1-scramble-siRNA分別與輔助載體pMD2.G(15 μL)、pMDL g/p RRE(15 μL)和pRSV-REV(15 μL)以體積比為2 ∶1 ∶1 ∶1的比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)病毒，12 h后換完全培養(yǎng)液，48 h后收集病毒液，-80 ℃冰箱保存。

1.4 慢病毒感染HSG細(xì)胞

將HSG細(xì)胞以1×105/mL接種于24孔板，每孔400 μL，接種24 h后，加polybrene進(jìn)行慢病毒第1次感染，24 h后進(jìn)行慢病毒第2次感染，再24 h后換完全培養(yǎng)液。感染后48 h，倒置顯微鏡明視野和熒光視野下觀(guān)察病毒感染情況，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為空白組、空載體組、scramble-siRNA組和S1P1-siRNA 4組，將成功構(gòu)建的scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)載體及空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備病毒，之后將含有scramble-siRNA、S1P1-siRNA和空載體的病毒液分別感染HSG細(xì)胞。感染48 h后，在倒置顯微鏡明視野和熒光視野下觀(guān)察細(xì)胞感染情況,同時(shí)使用BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒感染HSG細(xì)胞的效率。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中S1P1 mRNA的表達(dá)，并根據(jù)Ct值計(jì)算2-ΔΔCt，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。S1P1上游引物：5′-AGGGAGTATGTTTGTGGC-3′，下游引物：5′-AGAGGCGGAAGTTATTGC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，下游引物：5′-TGATTTTGGAGGGATC-TCGC-3′。同時(shí)，4組細(xì)胞做熒光免疫組織化學(xué)染色，圖片采用IPP6軟件分析平均光密度(D)值。ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的變化，測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出IFN-γ和IL-17的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果

構(gòu)建的S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)載體送Invitrogen公司進(jìn)行DNA基因測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示S1P1-siRNA表達(dá)序列及scramble序列已完整無(wú)誤地插入質(zhì)粒載體pLL3.7中(圖1)。

A, scramble-siRNA group; B, S1P1-siRNA group. S1P1, sphingosine 1-phosphate receptor-1; siRNA, small interfering RNA.

圖1 S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)基因測(cè)序圖

Figure1 Gene sequecing pattern of the S1P1-siRNA lentiviral vector

2.2 慢病毒滴度的滴定

將pLL3.7空載體和構(gòu)建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表達(dá)載體分別與輔助載體pMD2.G、pMDL g/p RRE和pRSV-REV共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備病毒，病毒感染293T細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，病毒的滴度為3.5×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染HSG細(xì)胞的效率

慢病毒感染HSG細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)大量綠色熒光，說(shuō)明慢病毒可以高效地感染HSG細(xì)胞(圖2)。

將上述在熒光顯微鏡下觀(guān)察后的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化并收集，流式細(xì)胞儀分析慢病毒感染HSG細(xì)胞的感染效率，結(jié)果顯示空載體、scramble-siRNA及S1P1-siRNA組的感染效率依次為55.6%、54.0%、50.6%(圖3)，感染效率均在50%以上,可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

HSG, human salivary gland cells; S1P1, sphingosine 1-phosphate receptor-1; siRNA, small interfering RNA.

圖2 HSG細(xì)胞感染效率(×200)

Figure2 HSG cell infection efficiency(×200)

2.4 慢病毒感染后HSG細(xì)胞中S1P1 mRNA的表達(dá)水平

HSG細(xì)胞感染后，S1P1-siRNA組細(xì)胞中S1P1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于空白組、空載體組和scramble-siRNA組(P<0.01)，空白組、空載體組和scramble-siRNA組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 4組HSG細(xì)胞中S1P1 mRNA表達(dá)水平

*P<0.01, compared with the other three groups. Abbreviations as in Figure 2.

2.5 慢病毒感染后HSG細(xì)胞中S1P1蛋白的表達(dá)水平

慢病毒感染HSG細(xì)胞后，S1P1-siRNA組的紅色熒光弱于空白組、空載體組和scramble-siRNA組(P<0.05)，空白組、空載體組和scramble-siRNA組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。將上述各組細(xì)胞收集，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，S1P1-siRNA組細(xì)胞S1P1蛋白的表達(dá)低于空白組、空載體組和scramble-siRNA組(P<0.05)，空白組、空載體組和scramble-siRNA組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

2.6 慢病毒感染后細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-17的表達(dá)水平

慢病毒感染HSG細(xì)胞后，S1P1-siRNA組細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-17的水平明顯低于空白組、空載體組和scramble-siRNA組(P<0.05)，空白組、空載體組和scramble-siRNA組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

A, blank group; B, empty vector group; C, scramble-siRNA group; D, S1P1-siRNA group. Abbreviations as in Figure 2.

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSG細(xì)胞感染效率

Figure3 HSG cell infection efficiency was analysis by flow cytometry

A, blank group; B, empty vector group; C, scramble-siRNA group; D, S1P1-siRNA group. Abbreviations as in Figure 2.

圖4 免疫熒光檢測(cè)HSG細(xì)胞中S1P1蛋白的表達(dá)水平

Figure4 Expression levels of S1P1 protein in HSG by immunofluorescence assay cells

3 討論

SS是一種全身性自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是外分泌腺的慢性炎癥導(dǎo)致組織損傷和分泌功能障礙[5-6]，臨床主要表現(xiàn)為黏膜干燥，其確切發(fā)病機(jī)制仍不明，大多研究者認(rèn)為是多因素相互作用最終導(dǎo)致免疫功能紊亂，從而引起機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的異常反應(yīng)，并進(jìn)一步通過(guò)各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)造成組織損傷。目前，SS尚無(wú)根治方法，主要使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物對(duì)癥積極治療，因此，我們需要研究和尋找更為確切、有效的治療手段。

Abbreviations as in Figure 2.

圖5 HSG細(xì)胞中S1P1蛋白的表達(dá)水平

Figure5 Expression levels of S1P1 protein in HSG cells

S1P以μmol/L至nmol/L的相對(duì)較高的濃度存在于血液和淋巴循環(huán)中[7]，是一種獨(dú)特的細(xì)胞信號(hào)分子，具有生物學(xué)活性，可通過(guò)作用于細(xì)胞表面的S1P受體(S1P1～S1P5)激活一系列下游信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能，也可以作為第二信使，直接作用于胞內(nèi)靶標(biāo)。很多研究表明，S1P/S1P1信號(hào)與自身免疫性疾病密切相關(guān)。在免疫系統(tǒng)中，S1P與未成熟的和記憶T細(xì)胞膜上的S1P受體相互作用，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的發(fā)育。S1P1與全身各處淋巴細(xì)胞再循環(huán)密切相關(guān)，淋巴細(xì)胞表面S1P1的表達(dá)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢和從次級(jí)淋巴器官進(jìn)入血液。S1P1的激活導(dǎo)致細(xì)胞類(lèi)型特異性應(yīng)答，包括細(xì)胞遷移、侵襲、增殖及血管新生，也引起一些病理過(guò)程，如自身免疫性疾病、炎癥[7]。

表2 4組細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-17表達(dá)水平

*P=0.01, compared with the other three groups. IFN-γ, interfe-ron-γ; IL-17, interleukin-17; other abbreviations as in Figure 2.

最早被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的小分子藥物芬戈莫德(fingolimod，F(xiàn)TY720)為S1P受體拮抗劑，使淋巴細(xì)胞表面的S1P1長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)化，造成淋巴細(xì)胞表面暫時(shí)性低S1P1狀態(tài)，從而引起外周血淋巴細(xì)胞阻滯于次級(jí)淋巴器官，阻止淋巴細(xì)胞再循環(huán)以及直接抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，該藥已成功用于多發(fā)性硬化癥的治療[8]。作為免疫抑制劑發(fā)展起來(lái)的S1P1選擇性拮抗劑對(duì)其他自身免疫性疾病也有很好的療效，如處于臨床試驗(yàn)階段的KRP-203治療亞急性紅斑狼瘡，ACT-128800治療銀屑病，SAR-100842(Sanofi)治療系統(tǒng)性硬化癥及相關(guān)纖維化疾病[9]等。同時(shí)，S1P也被證明可以誘導(dǎo)COX2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PEG2的生成，而COX2和PEG2被認(rèn)為在原發(fā)性SS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。因此，針對(duì)S1P1的基因治療是治療原發(fā)性干躁綜合征的策略之一，S1P1成為越來(lái)越多疾病的治療靶點(diǎn)。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)作為一種基因治療手段已經(jīng)用于臨床疾病的治療，如癌癥[10]、人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)[11]和自身免疫性疾病[12]等。RNAi的作用機(jī)制是通過(guò)靶細(xì)胞中導(dǎo)入雙鏈RNA(double strands RNA, dsRNA)有效降解與其互補(bǔ)的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，調(diào)控基因的表達(dá)[13]。慢病毒載體遞送效率高且由其攜帶導(dǎo)入的目的基因可以有效地整合到宿主染色體上長(zhǎng)期、穩(wěn)定地表達(dá)，而且慢病毒免疫原性低，能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞，為基因功能研究提供了更強(qiáng)有力的工具。Lian等[14]為研究PTP4A3的siRNA對(duì)人肺癌細(xì)胞H1299生長(zhǎng)的影響，構(gòu)建了PTP4A3 siRNA慢病毒表達(dá)載體感染人肺癌H1299細(xì)胞，細(xì)胞中PTP4A3 mRNA和蛋白水平均下降，細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成也被抑制。Lu等[15]研究了三化湯對(duì)局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用，并通過(guò)構(gòu)建水通道蛋白(AQP4)siRNA慢病毒載體注射于成年雄性SD大鼠，探討此過(guò)程中的作用靶點(diǎn)是AQP4，結(jié)果大鼠腦組織含水量、AQP4的表達(dá)下降，注射AQP4 siRNA后，治療效果更明顯。本研究遵循siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了兩段siRNA序列并構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLL3.7-S1P1-siRNA，根據(jù)siRNA的作用機(jī)制，借助慢病毒載體將特異性靶向S1P1 siRNA遞送到HSG細(xì)胞，探討S1P1的siRNA治療干燥綜合征的可能性。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，S1P1-siRNA組HSG細(xì)胞中的S1P1 mRNA的表達(dá)與空白組、空載體組和scramble-siRNA組比較明顯下降，充分說(shuō)明S1P1的特異性siRNA能在基因水平上沉默其表達(dá)。本研究進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSG細(xì)胞中S1P1的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示S1P1-siRNA組S1P1的蛋白表達(dá)水平與空白組、空載體組和scramble-siRNA比較明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明S1P1 siRNA能抑制S1P1在蛋白水平的表達(dá)，提示本研究S1P1 siRNA序列具有更好的基因沉默效果。

輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)是根據(jù)功能分類(lèi)的一個(gè)T細(xì)胞亞群，依據(jù)其分泌細(xì)胞因子的不同，CD4+T可分為T(mén)h1、Th2、Th17等亞型，Th1分泌IFN-γ等，主要介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，輔助抗體生成，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生。Awada等[16]在研究IL-33-ST2軸對(duì)原發(fā)性SS的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)患者高表達(dá)IFN-γ。Wu等[17]在研究養(yǎng)陰益氣活血方對(duì)SS小鼠頜下腺和血清中Th1/Th2免疫平衡的影響中發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，SS組IFN-γ水平升高，養(yǎng)陰益氣活血方和羥氯喹治療后IFN-γ血清濃度和蛋白表達(dá)均下降。Bian等[1]研究發(fā)現(xiàn)，CD25-/-SS小鼠高表達(dá)IL-17、IFN-γ，IFN-γ對(duì)CD25-/-SS淚腺破壞和分泌功能障礙起著關(guān)鍵作用。一些動(dòng)物模型研究顯示，IFN-γ不僅在SS免疫后期起著關(guān)鍵作用，在早期免疫前階段也有影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，S1P1的siRNA作用于HSG細(xì)胞后，IFN-γ的濃度明顯下降，提示S1P1的siRNA可以降低Th1相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕SS的炎癥反應(yīng)。

Th17是一種新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17等促炎因子，IL-17能誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子促進(jìn)淋巴細(xì)胞募集、活化、遷移到靶組織，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織[18]或系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的腎組織[19]，在自身免疫性疾病中具有重要意義。有很多研究也表明IL-17在多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用，包括原發(fā)性SS[20]。Nguyen等[21]首次探討了IL-17、IL-23在SS小鼠和患者唾液腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL-17表達(dá)上調(diào)。Wang等[22]在研究環(huán)孢素(Cys) A抑制原發(fā)性SS患者Th17細(xì)胞激活的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性SS組的IL-17 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高，Cys A處理后，其表達(dá)明顯被抑制。Lu等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，SS組IL-17的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均升高，而治療后其水平均下降，Th17/IL-17免疫炎癥途徑可能與SS外分泌腺免疫炎性損傷的分子機(jī)制相關(guān)。本研究結(jié)果表明，S1P1的siRNA作用于HSG細(xì)胞后，IL-17的濃度明顯下降，提示S1P1的siRNA可以降低Th17細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕SS的炎癥反應(yīng)，為SS的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

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(2015-10-12收稿)

(本文編輯：任英慧)

Effect of type 1 sphingosine-1-phosphate receptor siRNA on human salivary gland cells

LI Qiong1, CHANG Zhi-fang1, YANG Guo-an2, PANG Chun-yan1,2, WANG Yong-fu1,2△

(1. Department of Rheumatology, the Fist Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China； 2. Key Autoimmunity Lab of Inner Mongolia Autonomous Region, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

Objective：To construct sphingosine 1-phosphate receptor-1 (S1P1)-small interfering RNA (siRNA) lentiviral vectors and infect human salivary gland cells (HSG), and to investigate its possible therapy on Sj?gren’s syndrome. Methods: HSG cells were divided into blank group, empty vector group, scramble-siRNA group and S1P1-siRNA group. The lentiviral vectors expressing siRNA againstS1P1 and the pLL3.7 were respectively transfected into 293T cells with pMD2.G, pMDL g/p RRE, pRSV-REV to produce virus, and then infect HSG cells. The efficiency was observed by flow cytometry after the transfection for 48 h. The expression levels ofS1P1 mRNA of HSG were detected by real-time RT-PCR and the expression of S1P1 protein was detected by immunohistochemistry method. The expression levels of interferon-γ (IFN-γ) and interleukin (IL)-17 in the supernatant of the cells were detected by ELISA method. Results:(1) The scramble-siRNA, S1P1-siRNA lentiviral vector was successfully constructed, and the lentivirus titer was about 3.5×108TU/mL. (2) The level ofS1P1 mRNA was lower in S1P1-siRNA group than those in the blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after infection, there were significant differences between them (P<0.05). (3) The expression of S1P1 protein was lower in S1P1-siRNA group than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). (4) The levels of IL-17 were lower in S1P1-siRNA group than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). (5) The levels of IFN-γ in S1P1-siRNA group were lower than those in blank group, empty vector group, and scramble-siRNA group 48 h after transfection, there were significant differences between them (P<0.05). Conclusion: The lentiviral vector targeting S1P1 was successfully constructed.S1P1 siRNA could suppress the levels ofS1P1 mRNA and protein, and decrease the expression of IL-17 and IFN-γ.S1P1 siRNA could infect HSG cells stably and inhibit the expression ofS1P1 gene specifically and efficiently, and reduce the levels of inflammatory cytokines.

Receptors, lysosphingolipid; RNA, small interfering; Salivary glands; Acinar cells; Genetic vectors

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20120403)和國(guó)家自然科學(xué)基金(81360463)資助 Supported by the Inner Mongolia Autonomous Region Science and Technology Plan Projects (20120403) and the National Natural Science Foundation of China (81360463)

時(shí)間：2016-3-7 13：08：09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160307.1308.012.html

R593.2

A

1671-167X(2016)06-0987-07

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.012

△ Corresponding author’s e-mail, wyf5168@hotmail.com