金銀姬，趙金霞，孫 琳，楊 麟，邢 瑞，劉湘源

(北京大學(xué)第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 北京 100191)

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·論著·

血清鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1蛋白的檢測與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

金銀姬，趙金霞，孫 琳，楊 麟，邢 瑞，劉湘源△

(北京大學(xué)第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 北京 100191)

目的：檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者血清中鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF)蛋白水平，探討該蛋白在RA診斷中的意義。方法： 納入RA患者78例、其他風(fēng)濕病患者96例、健康對照30例，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測所有患者血清中BRAF蛋白水平，分析BRAF蛋白與RA患者臨床與實驗室指標的關(guān)系。 結(jié)果： RA患者血清中BRAF蛋白水平明顯高于其他風(fēng)濕病組(P<0.01)及健康對照組(P<0.01),BRAF蛋白與類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)及免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與其他臨床、實驗室指標及細胞因子無相關(guān)性。將RA患者分為BRAF蛋白升高組及正常組，比較兩組之間的差異，結(jié)果顯示兩組在臨床及實驗室指標分布上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論： RA患者血清中BRAF蛋白水平顯著高于其他疾病組及健康對照組，提示BRAF蛋白可能參與RA的發(fā)病過程。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；危險因素；鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1；BRAF蛋白

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病,目前RA發(fā)病機制尚不明確，抗原抗體反應(yīng)在RA疾病發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用,近年來有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中可以檢測到抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF)蛋白抗體，提示其可能作為自身抗原參與RA發(fā)病,本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)BRAF蛋白在RA患者滑液及滑膜組織中表達增高，可能在RA病理過程中發(fā)揮作用[1]，但RA患者血清中BRAF蛋白表達情況及其在疾病中的意義尚不清楚，因此，本研究通過酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法，檢測了RA患者血清中BRAF蛋白水平，并評價其與其他臨床和實驗室指標之間的關(guān)系，為進一步了解BRAF蛋白在RA發(fā)病中的作用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究為回顧性研究，血清標本來自2008年1月至2013年12月北京大學(xué)第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院及門診患者，入選患者均符合各疾病的國際診斷或分類標準。RA患者組共78例，男性21例，女性57例，平均年齡(52±15)歲，平均病程96個月(1～480個月)；其他風(fēng)濕病患者組96例，其中骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者32例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者16例，痛風(fēng)患者16例，強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者16例，干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)16例；健康對照組30例，來自北京大學(xué)第三醫(yī)院健康查體者。本研究開始前經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會審查批準(IRB00006761-2012011)。

1.2 血清標本的采集

所有備選對象均空腹抽取靜脈血4 mL，室溫下放置30 min使其凝固，3 000r/min離心10 min，分離血漿約1.5 mL至-80 ℃冰箱保存。

1.3 血清中BRAF蛋白的檢測

采用BRAF ELISA試劑盒(購自武漢華美生物工程有限公司)檢測血清中的BRAF蛋白濃度，所有標本均行復(fù)孔檢測，具體操作按說明書進行,依據(jù)標準曲線檢測標本中BRAF蛋白(質(zhì)量)濃度(ng/L)。

1.4 血清中細胞因子的檢測

采用人TNF-α、人IL-1β、人IL-6、人IL-17A 的ELISA試劑盒(購自達科為生物技術(shù)有限公司)檢測血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A濃度，所有標本均行復(fù)孔檢測，具體操作按說明書進行,依據(jù)標準曲線檢測標本中細胞因子濃度。

1.5 臨床資料收集

回顧病歷，獲取RA患者的年齡、性別、病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、患者對病情的總體評價視覺評分(visual assessment scale，VAS，范圍0～10)、關(guān)節(jié)晨僵時間、關(guān)節(jié)畸形數(shù)以及關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，同時收集紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumotoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti cyclic citrullinated peptide antibody；anti-CCP antibo-dy)、抗角蛋白抗體(antikeratin antibody)、免疫球蛋白7項、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)等實驗室指標。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間率的比較采用卡方檢驗。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均值的比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(范圍)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩變量之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAF蛋白在RA和其他風(fēng)濕病中的表達水平

RA患者血清中BRAF蛋白的濃度顯著高于OA、SLE、AS、痛風(fēng)、SS及健康對照組(P均<0.01)，OA組BRAF蛋白濃度高于健康對照組(P=0.007，表1)。

2.2 BRAF蛋白與RA臨床及實驗室指標的相關(guān)性分析

在RA患者中，將BRAF蛋白水平與年齡、病程及實驗室檢查進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)BRAF蛋白與免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA，r=0.447，P=0.006)及RF(r=0.357，P=0.009)水平呈正相關(guān)，與年齡、病程、DAS28水平、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A及其他實驗室指標無相關(guān)性。

表1 BRAF蛋白在不同疾病組的濃度

RA, rheumatoid arthritis; OA, osteoarthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; AS, ankylosing spondylitis; SS, Sj?gren syndrome.

2.3 BRAF蛋白升高組和正常組中RA患者實驗室指標比較

健康對照組BRAF蛋白95%置信區(qū)間為1 152～1 963 ng/L，以1 963 ng/L為cut off值，根據(jù)RA患者血清BRAF蛋白水平分為升高組及正常組，其中BRAF蛋白水平升高組46例，BRAF蛋白水平正常組7例。比較兩組各臨床及實驗室指標的差異，結(jié)果顯示兩組在年齡、病程、DAS28、ESR、CRP等指標分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 BRAF蛋白正常組和升高組實驗室指標的比較

CRP, C reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; RF, rheumatoid factor; CCP, cyclic citrullinated peptide; TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-6, interleukin-6.

3 討論

BRAF基因定位于人染色體7q34，含18個外顯子，其編碼的B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶(ras associated factor, RAF)相對分子質(zhì)量為94 000，由783個氨基酸組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路的關(guān)鍵成分。該酶將信號從Ras 轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2, 從而參與調(diào)控細胞的生長、增殖和凋亡[2-4]。MAPK信號通路在RA發(fā)病機制中發(fā)揮作用，參與調(diào)控細胞因子和組織金屬蛋白酶的產(chǎn)生[5-6]，同時參與B細胞抗原受體、T細胞受體、Toll樣受體，以及IL-1、IL-17和TNF受體介導(dǎo)的信號通路，MAPK信號通路在TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子產(chǎn)生過程中也發(fā)揮重要作用[7]。2009年,Auger等[8]首次發(fā)現(xiàn)RA患者的血清中存在可特異性識別BRAF抗原的抗體，陽性率達47.4%，明顯高于其他風(fēng)濕病與健康對照組。Charpin等[9]進一步采用ELISA方法研究了RA患者血清中針對BRAF蛋白及其各個肽段的抗體水平，發(fā)現(xiàn)在35%的RA患者血清中可以檢測到抗BRAF抗體，而強直性脊柱炎和健康對照組的檢出率僅為4%和6%。這些研究提示抗BRAF抗體可能參與RA的發(fā)病過程。

本研究檢測了RA患者BRAF蛋白水平，顯示BRAF蛋白在RA患者血清中的水平顯著高于其他疾病組及健康對照組，另外，在RA患者中BRAF蛋白水平與類風(fēng)濕因子及IgA呈正相關(guān)，但與DAS28、ESR、CRP、TNF-α、IL-6無相關(guān)性，提示BRAF蛋白可能與類風(fēng)濕因子及免疫球蛋白的產(chǎn)生有關(guān)，可能參與B細胞活化以及抗體產(chǎn)生過程，而與RA疾病活動度無明顯相關(guān)性。目前已有報道[1]，RA患者滑液和滑膜組織中BRAF蛋白水平高于骨關(guān)節(jié)炎及正常對照組，以上結(jié)果提示BRAF可能參與RA的發(fā)病過程。BRAF作為RAF成員之一，其編碼的產(chǎn)物可激活MAPK通路，而MAPK通路在RA發(fā)病過程起到重要作用，提示BRAF可能通過激活MAPK通路參與促炎因子產(chǎn)生，從而參與RA發(fā)病。此外，RA患者BRAF蛋白水平增高，既往研究提示RA患者中抗BRAF抗體亦升高[9-11]，提示BRAF蛋白本身可能作為自身抗原產(chǎn)生抗BRAF抗體，通過抗原抗體反應(yīng)參與RA發(fā)病。

有研究提示，RA患者中存在BRAF基因突變[12]，且大部分抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體陽性的RA患者存在BRAF基因V600A突變[13]，但目前BRAF及其產(chǎn)物參與RA發(fā)病過程的確切機制尚不清楚，進一步研究其基因及相關(guān)產(chǎn)物在RA中的表達可能對揭示RA發(fā)病機制有幫助，從而對其進行干預(yù)，起到治療的作用。

綜上所述，BRAF蛋白在RA患者中顯著升高，提示BRAF蛋白可能是RA患者自身抗原之一，參與RA的發(fā)病過程。

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(2016-08-04收稿)

(本文編輯：王 蕾)

Significance of v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1 in rheumatoid arthritis

JIN Yin-ji， ZHAO Jin-xia， SUN Lin， YANG Lin， XING Rui， LIU Xiang-yuan△

(Department of Rheumatology and Immunology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

Objective： To detect serum v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1 (BRAF) protein levels and to investigate their clinical significance in rheumatoid arthritis (RA) patients. Me-thods: Serum samples were obtained from 78 RA patients, 32 osteoarthritis (OA) patients, 16 systemic lupus erythematosus (SLE) patients, 16 gout patients, 16 ankylosing spondylitis (AS) patients, 16 Sj?gren syndrome (SS) patients and 30 healthy controls. BRAF protein in the sera was examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The associations between BRAF levels and the clinical features including age, sex, disease duration, swelling joints, tenderness joints, duration of moning stiffness, joint deformity, visual assessment scale (VAS) and extra articular manifestations and laboratory parameters including erythrocyte sedimentation rate (ESR), C reactive protein (CRP), rheumatoid factor (RF), disease activity score in 28 joints (DAS28), anti cyclic citrullinated peptide (CCP) antibo-dy, antikeratin antibody, antnuclear antibody (ANA), immunoglobulin and cytokines, such as TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17A in RA patients were evaluated. Data analyses were performed by using SPSS 19.0 program. Results: The serum BRAF protein levels in the RA patients were significantly higher than those of other rheumatic diseases groups including OA, SLE, AS, SS, gout patients and healthy controls, thePvalue was 0.002, <0.001, <0.001, <0.001, 0.001 and <0.001 respectively. The level of serum BRAF protein in the RA patients showed a positive correlation with the rheumatoid factor (P=0.009) and IgA levels (P=0.006), but no correlation with clinical features, such as age and duration or other laboratory parameters, including CRP, ESR, anti-CCP antibody, IgM, IgG, TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17A. The RA patients were further divided into normal levels of BRAF protein group and elevated levels of BRAF protein group. Compared with the clinical features and laboratory indexes of normal and elevated levels of BRAF protein groups in the RA patients, there was no significant difference between the two groups in age, duration, DAS28, CRP, ESR, RF, anti-CCP, IgA, IgG, IgM, TNF-α or IL-6. Conclusion: The elevated level of BRAF protein in the RA patients showed that BRAF might play a role in the pathogenesis of RA. Further researches on BRAF gene expression may help to clarify the role of BRAF in RA.

Arthritis, rheumatoid; Risk-factors; v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF protein

國家自然科學(xué)基金(81273293)和北京大學(xué)第三醫(yī)院院種子基金(Y87473-01)資助 Supported by the Natural Science Foundation of China (81273293) and Seed Foundation of Peking University Third Hospital (Y87473-01)

時間：2016-11-25 16：35：51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161125.1635.020.html

R593

A

1671-167X(2016)06-0947-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.005

△Corresponding author’s e-mail, Liu-xiangyuan@263.net