丁曉彥，劉青，賈元印，趙渤年

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東省中藥質量標準研究重點實驗室，山東 濟南250014)

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【中藥與天然活性產物】

HPLC法測定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚的含量

丁曉彥，劉青，賈元印，趙渤年*

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東省中藥質量標準研究重點實驗室，山東 濟南250014)

建立了高效液相色譜法(HPLC)同時測定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚含量的方法。采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸水(82：18，V/V)為流動相，檢測波長為289 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。測得大黃素在0.019～0.19 μg(R=0.999 9，n=5)、大黃素甲醚在0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)線性關系良好；大黃素和大黃素甲醚的平均回收率分別為98.58%、100.01%，相對標準偏差分別為2.66%、1.15%。研究表明,該方法專屬性強、結果準確，可作為同時測定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚含量的方法。

首烏益智膠囊；大黃素；大黃素甲醚；高效液相色譜法；含量測定

首烏益智膠囊主要由制何首烏、益智、黃芪等10種中藥組成，具有補腎填精、化瘀通竅的功效，主要用于治療腎精虧虛、瘀血阻絡型血管性癡呆。制何首烏為方中君藥，而大黃素和大黃素甲醚是何首烏的主要成分，也是《中國藥典》[1]規(guī)定的制何首烏的含量測定檢測項之一?，F(xiàn)代藥理實驗研究證明，何首烏中蒽醌類成分(AGPMT)具有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[2]。其中，大黃素的藥理作用有抑制胰酶活性、抑菌、抗炎、免疫調節(jié)、保肝利膽、清除自由基、抗氧化、降低血液粘度、抑制血小板聚集、抗腫瘤及治療急性胰腺炎等[3-5]。

國內有大量關于大黃素含量測定的文獻報道，但采用高效液相色譜法測定大黃素和大黃素甲醚含量[6-7]的文獻并不多，該類報道中以測定中藥成方制劑中二者含量方法為多[8-11]，但因組方、劑型等不同，其測定方法也稍有不同。為了控制首烏益智膠囊的質量，使其在臨床使用中更加安全有效，本文采用高效液相色譜法對首烏益智膠囊中的大黃素和大黃素甲醚含量的測定方法進行研究，方法簡便、準確，重現(xiàn)性好，為控制本制劑質量提供了一種快速、便捷的科學方法。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國Waters， Waters e2695 )；Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；電子天平(德國Sartorius，BP211D)。

1.2 試劑

鹽酸、磷酸、甲醇(提取用)、三氯甲烷、無水硫酸鈉為分析純，甲醇(HPLC測定用)均為色譜純，水為超純水。

1.3 試藥

大黃素對照品(批號110756-200110)、大黃素甲醚對照品(批號110758-201415)均由中國食品藥品檢定研究院提供。制何首烏、益智、黃芪等中藥飲片購自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠，首烏益智膠囊樣品為自制3批樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長289 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。以甲醇-0.1%磷酸水溶液(82:18，V/V)為流動相，理論板數(shù)按大黃素峰計算不低于2 500。

2.2 混合對照品溶液制備

分別稱取大黃素及大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含大黃素、大黃素甲醚10 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

稱取裝量差異項下本膠囊內容物適量，研細，取約1 g，精密稱定，加硅藻土2 g，拌勻，置索氏提取器中，加甲醇100 mL，加熱回流3 h。將提取液蒸干，加8%鹽酸溶液40 mL使溶解，轉移至圓底燒瓶中，加三氯甲烷40 mL，水浴回流2 h，立即冷卻，轉移至分液漏斗中，分出三氯甲烷層，酸水液層用三氯甲烷提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，用水80 mL洗滌一次，三氯甲烷液加無水硫酸鈉15 g，振搖5 min，靜置30 min，濾過。用少量三氯甲烷洗滌殘渣及濾器，合并濾液、洗液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液制備

按處方組成及比例，剔除制何首烏，稱取方中其他藥味，按首烏益智膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備方法，制得不含制何首烏的陰性對照溶液。

2.5 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL,采用高效液相色譜法，按2.1項下的色譜條件進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，陰性樣品在大黃素和大黃素甲醚相同保留時間處無干擾，見圖1。

a 大黃素和大黃素甲醚混合對照品；b 首烏益智膠囊樣品；c 陰性樣品圖1 對照品、首烏益智膠囊、陰性樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Shouwuyizhi capsule，control and negative samples

2.6 線性關系考察

取大黃素濃度為9.58 μg/mL、大黃素甲醚濃度為10.26 μg/mL的對照品溶液，進樣量分別為 2、5、10、15、20 μL,按上述色譜條件進行測定。以峰面積值為縱坐標，以進樣量為橫坐標進行回歸分析,結果，大黃素進樣量在0.019～0.19 μg范圍內線性關系良好，回歸方程為，Y=6×106X-16 562，R=0.999 9；大黃素甲醚進樣量在0.021～0.21μg范圍內呈良好線性關系，回歸方程為，Y=8×10-7X+0.008 7，R=1.000 0。

2.7 精密度實驗

吸取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定大黃素和大黃素甲醚的峰面積，計算得相對標準偏差分別為0.46%和1.47%。

2.8 重現(xiàn)性實驗

取同一批(批號1)膠囊內容物，取樣6份，分別制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定。計算得到樣品中大黃素的平均含量為0.301 5毫克/粒，相對標準偏差為1.87%；大黃素甲醚的平均含量為0.474 9毫克/粒，相對標準偏差為1.98%。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取同一批號(批號1)膠囊內容物制成的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進樣，測定大黃素和大黃素甲醚的峰面積值，共測5次。結果，大黃素的相對標準偏差為2.33%，大黃素甲醚的相對標準偏差為0.89%，這表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率實驗

取已測定含量的供試品(批號1)適量，研細，稱取約0.5 g，精密稱定，共取6份，精密加入分別含大黃素0.41mg/mL、大黃素甲醚0.40 mg/mL的混合對照品溶液1 mL，按2.3項下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率。結果大黃素的平均回收率為98.58%，相對標準偏差為2.66%(n=6)；大黃素甲醚的平均回收率為100.01%，相對標準偏差為1.15%(n=6)，測定結果見表1～2。

表1 大黃素加樣回收率實驗結果Table 1 Experimental results of emondin recovery rate

表2 大黃素甲醚加樣回收率實驗結果Table 2 Experimental results of emondin monomenthyl ether recovery rate

2.11 樣品的測定

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，進樣，測定色譜峰面積，計算各樣品中大黃素和大黃素甲醚的含量，樣品測定結果見表3。

表3 樣品測定結果表Table 3 Determination results of samples

3 討論

供試品溶液制備方法的確定既參考了《中國藥典》何首烏總蒽醌含量測定的制備方法，又結合本樣品自身的特點，樣品前處理方法在完全提取目標成分的同時，盡量排除制劑輔料及其他成分，使樣品測定時免受雜質峰干擾。

在供試品溶液制備方法中，有研究采用不同濃度甲醇或乙醇提取的方法,該方法操作簡單。實驗前期，也曾考慮采用甲醇回流提取方法制備供試液，但結果顯示，沒經(jīng)過水解得到樣品的大黃素和大黃素甲醚提取率低，且測定圖譜中其他與測定無關成分較多，故最終采用2.3所述方法制備供試液。

實驗對大黃素和大黃素甲醚水解時間及溫度進行了考察，結果表明，沸水浴回流2 h可實現(xiàn)結合蒽醌完全水解，提取出大黃素和大黃素甲醚。實驗對樣品檢測進行了全波長掃描，發(fā)現(xiàn)大黃素和大黃素甲醚在289 nm附近有最大吸收，故選擇波長289 nm作為大黃素和大黃素甲醚含量測定的檢測波長。

本方法測定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚的含量，結果可靠，且處理方法簡便，流動相組成簡單，可用于控制其質量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：176-177.

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HPLC based content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule

DING Xiao-yan, LIU Qing, JIA Yuan-yin, ZHAO Bo-nian

(Shandong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Quality Standard Research, Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China)

∶We constructed a HPLC based content determination method for emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule. Samples were separated by C18(250 nm×4.6 nm, 5 μm) column with methanol-0.1% phosphoric acid water (82:18,V/V) as mobile phase. Determination conditions were determination wavelength of 289 nm, flow rate of 1.0 mL/min, and column temperature of 30 ℃. Better linear relationship exists in the range 0.019～0.19 μg(R=0.999 9,n=5) for emodin, and in the range 0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)for emodin monomenthyl ether. Their average recovery rates are respectively 98.58% and 100.01%, and RSDs are 2.66% and 1.15%. Results show that the method has strong specificity and accuracy, so it can be applied to simultaneous content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule.

∶Shouwuyizhi capsule; emodin; emodin monomenthyl ether; HPLC; content determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.006

2016-04-01

山東省自主創(chuàng)新及成果轉化專項(20140ZZCX2303)

丁曉彥(1983—)，女，助理研究員，研究方向為中藥質量控制。Email:kate-66@163.com

*通信作者，趙渤年，男，研究員，博士生導師。Email:bonianzh@163.com

R284.1

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