麻冬梅，秦楚，倪星，許興，郭伶娜

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

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高羊茅應(yīng)答鹽脅迫的AtSOS途徑基因的效應(yīng)分析

麻冬梅1*，秦楚2，倪星1，許興1，郭伶娜2

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

本研究在2015年采用基因工程技術(shù)改良高羊茅耐鹽性，通過種植轉(zhuǎn)基因耐鹽草坪草達到改良土壤改善生態(tài)環(huán)境的目的。以草坪草成熟種子誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為受體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥AtSOS途徑基因AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3和AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3分別導(dǎo)入高羊茅愛瑞3號中，經(jīng)PCR檢測、Southern blotting分析和RT-PCR鑒定，獲得了能穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因株系。以轉(zhuǎn)不同組合AtSOS基因的高羊茅植株和野生型植株為材料進行鹽處理，每次處理重復(fù)3次，測定其生理生化指標、株高、Na+、K+離子含量、葉綠素含量，結(jié)果顯示，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性都顯著高于對照植株，而丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量的增加幅度均顯著低于對照植株；鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片中的Na+、K+含量都增加；鹽脅迫下所有植株的株高均呈下降趨勢，各株系的葉綠素含量也減少，但是轉(zhuǎn)基因(AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3)植株的葉綠素含量增加。轉(zhuǎn)AtSOS基因的高羊茅通過發(fā)揮AtSOS途徑的作用，促進了植物體內(nèi)Na+的外排,減輕了鹽脅迫所導(dǎo)致的傷害，提高了植物的耐鹽性。

高羊茅；AtSOS基因；遺傳轉(zhuǎn)化；耐鹽性

土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)作物生產(chǎn)力的最大影響因素,已嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力,大約五分之一的灌溉農(nóng)業(yè)土地受鹽脅迫影響[1]。引起土壤鹽漬化的因素有很多，如灌溉水水質(zhì)差、輻射和溫室效應(yīng)等。隨著可耕地面積的日益減少，鹽堿地已成為土地資源的重要組成部分，因此，對鹽堿地進行改良利用具有重要的意義。目前為止，培育耐鹽性植株是開發(fā)鹽堿地的有效途徑。在鹽堿地上種植草坪草不僅具有綠化作用，還具有改良土壤的作用。

鹽脅迫影響著植物發(fā)育的各個方面，包括種子的發(fā)芽、植物的生長、產(chǎn)量及蛋白質(zhì)的合成和光合作用等[2]，給植物帶來離子毒害、滲透脅迫、營養(yǎng)虧缺和氧化應(yīng)激等危害，也間接地影響植物有益共生微生物的生長，從而限制了植物的生產(chǎn)力。離子毒害是生化反應(yīng)中的Na+置換K+以及Na+和Cl-引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的結(jié)果[3-4]。土壤中高濃度鹽導(dǎo)致滲透脅迫，限制了植物從土壤中吸收水分。引起Na+在細胞壁的積累，可迅速導(dǎo)致滲透脅迫和細胞死亡[5]。因此，離子毒害和滲透脅迫導(dǎo)致植物代謝失衡，從而導(dǎo)致氧化損傷[6]。

目前開展了大量草坪草抗逆性的研究[7-11]，其采用常規(guī)育種方法不僅周期長，而且難以提高性狀。采用基因工程技術(shù)改良高羊茅耐鹽性，避免了常規(guī)育種方法帶來的周期長、成效低等缺點，而且基因工程技術(shù)對保持草坪四季常綠，擴大建植區(qū)域和改善生態(tài)環(huán)境都具有十分重要的意義[12]。

AtSOS途徑是目前最深入研究植物調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答的機制之一。AtSOS1基因位于2號染色體上，含有22個內(nèi)含子和23個外顯子。其編碼一個分子量為127 kd、含有1146個氨基酸的多肽[13]，N端具有高度疏水性，含有12個跨膜區(qū)域；C端因其親水性而殘留在細胞質(zhì)中。無鹽脅迫時，AtSOS1 受C端的自我抑制區(qū)域作用，但當鹽脅迫時，AtSOS2-AtSOS3 復(fù)合體與該區(qū)域結(jié)合并磷酸化激活A(yù)tSOS1，促進鹽離子的外排[14-15]，AtSOS1基因編碼位于質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，介導(dǎo)Na+外排和控制遠程Na+從根部向地上部運輸，同時保護單個細胞免受Na+的毒性[16]。AtSOS2基因位于5號染色體上，編碼一個由446個氨基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶[17]，其N端為激酶的催化區(qū)域, 與哺乳動物AMPKs和酵母SNF1非常相似，但它們的調(diào)控功能明顯不同[18-19]；C端構(gòu)成它的調(diào)控區(qū)域，AtSOS2基因編碼的激酶在擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株的根和莖中都能表達且含量較低，但鹽脅迫下它在根中的表達明顯增加[17]。AtSOS2活性依賴于鈣結(jié)合蛋白AtSOS3的調(diào)節(jié)。AtSOS3基因也位于5號染色體上，編碼一個鈣結(jié)合蛋白，該蛋白含有3 個EF-臂且N端豆蔻酰化[20]。AtSOS3 激活A(yù)tSOS2蛋白激酶并與其相互作用[21]。AtSOS3-AtSOS2復(fù)合體磷酸化可激活A(yù)tSOS1蛋白，直接促進AtSOS1控制的Na+/H+交換[22]。此外也可能負調(diào)節(jié)Na+進入細胞內(nèi)的過程[23]。類似AtSOS3蛋白的SCaBP8也調(diào)節(jié)擬南芥AtSOS途徑[24]。SCaBP8 在嫩芽中對鹽高度敏感，與AtSOS3一起調(diào)控AtSOS2的活性，一起保護芽和根免受鹽脅迫[25]。本研究通過分析轉(zhuǎn)不同組合AtSOS基因草坪草的耐鹽性，進一步探究這些基因在信號傳導(dǎo)途徑中的相互作用，對植物抗逆基因工程新途徑的發(fā)展有著重要的學(xué)術(shù)參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子 實驗日期為2015年4月1日到2015年12月30日，材料為轉(zhuǎn)基因高羊茅(Festucaelata)愛瑞3號和未轉(zhuǎn)基因的野生型高羊茅愛瑞3號，種子購自北京中種草業(yè)有限公司。

1.1.2 載體 轉(zhuǎn)化的基因為AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3，均是與植物抗旱耐鹽相關(guān)的基因。載體由山東大學(xué)夏光敏實驗室構(gòu)建。

含有AtSOS1基因的表達載體pCAMBIA1300-AtSOS1的結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 AtSOS1載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The vector of AtSOS1 Super-pCAMBIA1300，Kan選自E.coli，Hyg選自植物。以上所示均為單一酶切位點， KpnⅠ和XbaⅠ中間為3.5 kb。Super-pCAMBIA1300, selection in E.coli: Kan, in plant: Hyg. All of the above shows that the single enzyme cutting site, KpnⅠ and XbaⅠ in the middle is 3.5 kb.

含有AtSOS2+AtSOS3基因的表達載體pCAMBIA3301-AtSOS2-AtSOS3的結(jié)構(gòu)如圖2。

圖2 AtSOS2+3載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The vector of AtSOS2+3 pCAMBIA3301，Kan選自大腸桿菌，basta選自植物。以上所示均為單一酶切位點，其中AtSOS2為1.3 kb，AtSOS3為0.6 kb，Hind Ⅲ和EcoRⅠ中間為5 kb左右。pCAMBIA3301, selection in E.coli: Kan，in plant: basta. All of the above shows a single enzyme cleavage site, where AtSOS2 is 1.3 kb, AtSOS3 is 0.6 kb, Hind Ⅲ and EcoRⅠ is about 5 kb.

含有AtSOS1+AtSOS2+AtSOS3基因的表達載體pCAMBIA33O1-AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3的結(jié)構(gòu)如圖3。

圖3 AtSOS1+2+3載體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The vector of AtSOS1+2+3 pCAMBIA3301，Kan選自大腸桿菌，basta選自植物。以上所示并不是單一酶切位點(除BstⅪ，MfuⅠ)，因為新連的AtSOS1中包含了EcoRⅠ，Hind Ⅲ，NcoⅠ和BstEⅡ。其中AtSOS1為3.5 kb，AtSOS2為1.3 kb，AtSOS3為0.6 kb，EcoRⅠ和Hind Ⅲ中間為4 kb左右，super promoter為1.1 kb。pCAMBIA3301, selection in E.coli: Kan and in plant: basta. The above is not a single enzyme cleavage site (in addition to BstⅪ，MfuⅠ), because the new link AtSOS1 contains the EcoRⅠ, Hind Ⅲ, NcoⅠ and BstEⅡ. Among them AtSOS1 for 3.5 kb, AtSOS2 for 1.3 kb, AtSOS3 for 0.6 kb, EcoRⅠ and Hind Ⅲ intermediate for 4 kb or so, super promoter for 1.1 kb.

1.1.3 引物AtSOS基因的PCR引用見表1。

表1AtSOS基因的PCR引物

Table 1 The PCR primers ofAtSOSgenes

基因Gene正向引物Forward反向引物ReverseAtSOS15'GTCGTTTATTTCGGCGTGTA3'5'CGCTTGGTAGGCAATCTTA3'AtSOS25'ACAAAGGGTAATATCGGGAAAC3'5'CGAAGGACTCGCCAACAC3'AtSOS35'CCGTAAAGACTGGCGAACA3'5'CTACCGTGAATGGCGTGA3'

1.2 高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化

以高羊茅愛瑞3號種子的胚性愈傷組織為實驗材料進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。侵染后共培養(yǎng)愈傷組織3 d。然后，愈傷組織在含有5 mg/L的草胺膦或100 mg/L潮霉素的MS+5.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L水解酪蛋白的培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)4周。抗性胚性愈傷組織為淡黃色，長芽，而非轉(zhuǎn)基因愈傷組織逐漸變成褐色。將抗性胚性愈傷組織接入MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT的分化培養(yǎng)基上。待愈傷分化出5 cm左右的芽時，移至生根培養(yǎng)基中，3周后，抗性植株長出大量根系。隨后，對抗性植株進行煉苗，移栽到盆中，在溫室培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

1.3.1 PCR檢測 提取未轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因高羊茅葉片的 DNA，并以 DNA 為模板對其進行PCR擴增。分別以重組質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)基因植株的DNA為陽性和陰性對照，取 5 μL 產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳。

AtSOS1基因PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；59 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

AtSOS2基因PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

AtSOS3基因PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.2 Southern blotting檢測 采用Roche公司的Kit試劑盒，Southern雜交以地高辛(digoxin)標記的AtSOS1基因、AtSOS2基因、AtSOS3基因酶切產(chǎn)物片段為探針，以質(zhì)粒DNA為陽性對照，以野生型高羊茅的DNA為陰性對照，對轉(zhuǎn)基因高羊茅進行Southern blotting檢測。首先制備探針；其次選擇合適的內(nèi)切酶對高質(zhì)量的基因組DNA進行酶切，酶切體系為ddH2O 12 μL，DNA 30 μL，10×EcoRⅠ buffer 5 μL，EcoRⅠ 3 μL的50 μL體系37 ℃孵育3 h后72 ℃ 滅火15 min；再次變性、中和、轉(zhuǎn)移、固定；繼而進行預(yù)雜交與雜交；最后進行洗膜與檢測。

1.3.3 RT-PCR檢測 采用TIANGEN植物總RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的總RNA后，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR06A(美國，Takara)獲得cDNA，繼而以cDNA為模板，進行AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。

1.4 鹽脅迫處理及耐鹽性檢測

在溫室條件下,分別取3種轉(zhuǎn)基因高羊茅植株和野生型植株各4盆，然后分別用0、150、250和350 mmol/L NaCl營養(yǎng)液澆灌野生型植株和3種不同類別轉(zhuǎn)基因植株21 d，每天澆1次200 mL的NaCl溶液。鹽處理期間每隔一天，測定0和350 mmol/L NaCl溶液處理下轉(zhuǎn)基因高羊茅植株和野生型植株的株高，記錄數(shù)據(jù)。收集處理前和處理結(jié)束后的植株葉片進行SOD、POD、CAT酶、MDA、Pro、葉綠素和Na+、K+離子含量的測定[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子鑒定

2.1.1 PCR檢測 為了驗證是否靶基因結(jié)合到高羊茅的基因組中，提取未轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因高羊茅葉片的 DNA，并以 DNA 為模板對其進行PCR擴增。分別以重組質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)基因植株的DNA為陽性和陰性對照，取 5 μL 產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳。依次擴增出AtSOS1，AtSOS2和AtSOS3基因的序列(圖4～6)。通過PCR鑒定，獲得了67株抗性植株，其中轉(zhuǎn)AtSOS1基因的植株為13株，AtSOS2-AtSOS3基因的植株為25株、AtSOS1+AtSOS2+AtSOS3的植株為31株。

圖4 AtSOS1基因PCR擴增電泳Fig.4 The electrophoresis PCR of AtSOS1 M:2000 bp；CK+：質(zhì)粒DNA作陽性對照；CK-：野生型DNA作陰性對照;1～5:PCR抗性轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA。CK+：Plasmid；CK-:Wild-type;1-5:The PCR of transgenic plants genome DNA.

2.1.2 Southern blotting檢測 分別以AtSOS1，AtSOS2和AtSOS3基因為探針進行Southern blotting，證實了靶基因?qū)氲搅烁哐蛎┗蚪M。在檢測的轉(zhuǎn)基因植株中，出現(xiàn)一到兩個雜交信號，然而在野生型植物中沒有檢測到雜交信號(圖7)。

圖5 轉(zhuǎn)AtSOS2-AtSOS3基因高羊茅PCR擴增電泳Fig.5 The electrophoresis PCR of transgenic tall fescue including AtSOS2-AtSOS3 a:AtSOS2基因PCR擴增電泳；b:AtSOS3基因PCR擴增電泳; M:2000 bp；CK+：質(zhì)粒DNA作陽性對照；CK-：野生型DNA作陰性對照;1～5:PCR抗性轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA。a:The electrophoresis PCR of AtSOS2 gene; b:The electrophoresis PCR of AtSOS3 gene;CK+：Plasmid；CK-:Wild-type; 1-5:The PCR of transgenic plants genome DNA.

圖6 轉(zhuǎn)AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因高羊茅PCR擴增電泳Fig.6 The electrophoresis PCR of transgenic tall fescue including AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3M:2000 bp；1～3:AtSOS1基因PCR擴增；4,5:AtSOS2基因PCR擴增；6～8：AtSOS3基因PCR擴增。 1-3:The electrophoresis PCR of AtSOS1 gene; 4,5: The electrophoresis PCR of AtSOS2 gene; 6-8: The electrophoresis PCR of AtSOS3 gene.

2.1.3 RT-PCR分析 對轉(zhuǎn)基因植株進行了RT-PCR分析，進一步確定了不同AtSOS基因組合的表達水平(圖8)。

2.2 耐鹽性檢測

2.2.1 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因高羊茅的表型變化 將轉(zhuǎn)基因高羊茅植株和野生型植株分別用不同濃度(0，150，250和350 mmol/L)的NaCl處理，分析耐鹽性。21 d后，觀察到轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株之間存在明顯的表型差異。轉(zhuǎn)基因植株在鹽濃度處理期間,葉片發(fā)黃的速度明顯小于野生型植株，且處理解除后，轉(zhuǎn)基因苗慢慢恢復(fù)綠葉，生長正常；而野生型高羊茅葉片發(fā)黃，生長遲緩(圖9)。所有植株都因鹽濃度的增加，生長更加緩慢。

2.2.2 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因高羊茅的株高變化

圖7 Southern雜交分析結(jié)果Fig.7 The analysis of transgenic tall fescue by southern blotting

圖8 RT-PCR分析結(jié)果Fig.8 The analysis of transgenic tall fescue by RT-PCR

a：AtSOS1基因的Southern雜交結(jié)果；b：AtSOS2基因的Southern雜交結(jié)果；c：AtSOS3基因的Southern雜交結(jié)果。a: The southern blotting ofAtSOS1 gene; b: The southern blotting ofAtSOS2 gene; c: The southern blotting ofAtSOS3 gene. M:Marker 2000 bp;1,2:AtSOS1基因的RT-PCR結(jié)果；3,4:AtSOS2基因的RT-PCR結(jié)果；5,6:AtSOS3基因的RT-PCR結(jié)果。1,2:The RT-PCR ofAtSOS1 gene;3,4:The RT-PCR ofAtSOS2 gene；5,6：The RT-PCR ofAtSOS3 gene.

圖9 不同鹽濃度處理轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株21 d后的生長情況Fig.9 The growth of transgenic plants and wild type plants by dealing with different salt concentration after 21 days a:處理前野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的生長情況；b：處理21 d后野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的生長情況;WT：野生型植株；TR-1、TR-2、TR-3分別代表轉(zhuǎn)AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3、AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的植株。a: The growth of wild type plants and transgenic plants before handling; b:The growth of wild type plants and transgenic plants after 21 days;WT: Wild-type plants;TR-1, TR-2,TR-3 represent the transgenic plants including AtSOS1, AtSOS2-AtSOS3, AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 gene respectively.

圖10 鹽脅迫下野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株株高的變化Fig.10 The changes of plant height of transgenic and wild-type plants under salt stress CK:野生型植株；1、2、3分別代表轉(zhuǎn)AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3、AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的轉(zhuǎn)基因植株。CK:Wild-type plants;1,2,3 represent the transgenic plants including AtSOS1, AtSOS2-AtSOS3, AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 gene respectively.

由圖10可知， 0 mmol/L NaCl處理下，野生型植株和3種轉(zhuǎn)基因植株的株高都增加。而在350 mmol/L NaCl處理下所有高羊茅植株的生長明顯受到抑制，均呈下降趨勢，且野生型植株株高的下降趨勢最為明顯。

圖11 鹽脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因型高羊茅的生理特性指標的變化Fig.11 Changes of physiological characteristic of transgenic and wild-type plants under salt stress CK:野生型植株；1、2、3分別代表轉(zhuǎn)AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3、AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的轉(zhuǎn)基因植株。 CK:Wild-type plants;1,2,3 represent the transgenic plants including AtSOS1, AtSOS2-AtSOS3, AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 gene respectively.

2.2.3 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因高羊茅生理生化指標的變化 在植物中鹽對細胞產(chǎn)生離子毒性，引起活性氧(ROS)和脯氨酸的積累。細胞活性氧的積累會抑制植物生長與發(fā)育。POD，SOD和CAT是重要的抗氧化酶，能降低活性氧的傷害和保持完整細胞膜的結(jié)構(gòu)。

0 mmol/L NaCl處理下，POD含量在這4種類型的高羊茅植株中幾乎相同。然而鹽脅迫后，轉(zhuǎn)AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的POD含量降低，但是其他轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的POD含量明顯增加，其中轉(zhuǎn)AtSOS2-AtSOS3基因的植株增加最為明顯(圖11)。轉(zhuǎn)基因和野生型植株之間SOD活性的變化有所差異。在鹽脅迫下，所有轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性僅略有減少，而在野生型中明顯減少(圖11)。鹽脅迫下，CAT活性在轉(zhuǎn)基因和野生型植株中同樣增加；但是，在野生型植物中CAT活性僅略有增加，而轉(zhuǎn)基因植株的CAT活性明顯增加，其中轉(zhuǎn)AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的植株增加最為明顯(圖11)。0 mmol/L NaCl處理下，Pro含量在這4種類型的植株中幾乎相同。鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因和野生型植物的脯氨酸含量都有增加。但除轉(zhuǎn)AtSOS1基因的植株葉片中脯氨酸的含量明顯高于野生型之外,其他類型轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量則低于野生型(圖11)。鹽脅迫后，MDA含量在野生型植物和轉(zhuǎn)基因植株中都有增加，然而350 mmol/L NaCl處理下野生型植株的MDA含量比轉(zhuǎn)基因植物顯著增加。其MDA含量增加可能是由于ROS氧化引起野生型植株膜破壞(圖11)。綜上所述，3類轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比更能抵抗鹽脅迫，這可能是因為轉(zhuǎn)基因植株中響應(yīng)鹽脅迫的AtSOS途徑基因發(fā)揮作用，促進了Na+的外排，使植株在高鹽環(huán)境中能維持正常的生命活動。

圖12 鹽脅迫下野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株葉綠素的變化Fig.12 The changes of chlorophyll content of transgenic and wild-type plants under salt stressCK:野生型植株；1、2、3分別代表轉(zhuǎn)AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3、AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的植株；0-1、350-1代表NaCl處理前葉綠素含量；0-21、350-21分別代表0和350 mmol/L NaCl處理21 d后的葉綠素含量。CK:Wild-type plants;1,2,3 represent the transgenic plants including AtSOS1, AtSOS2-AtSOS3, AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 gene respectively; 0-1 and 350-1 represent the chlorophyll content without salt stress;0-21 and 350-21 represent the chlorophyll content with 0 and 350 mmol/L NaCl treatment after 21 days respectively.

2.2.4 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因高羊茅葉綠素的變化 如圖12所示,鹽脅迫后，0 mmol/L NaCl處理下所有植株的葉綠素含量變化不顯著，隨著鹽濃度的增加，在350 mmol/L NaCl處理下各株系的葉綠素含量均下降，但是350 mmol/L NaCl處理下轉(zhuǎn)AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因株系的葉綠素含量有上升趨勢。2.2.5 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因高羊茅Na+和K+含量的變化 如圖13所示，沒有用NaCl處理過的轉(zhuǎn)基因和野生型植株的Na+含量相似。用350 mmol/L NaCl處理過的轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片中的Na+含量都增加。但是野生型植株葉片中的Na+含量明顯增加，比轉(zhuǎn)基因植株積累更多的鹽(圖13a)。

0 mmol/L NaCl處理下野生型植株葉片中K+的含量明顯高于轉(zhuǎn)基因植株，但隨著NaCl濃度的增加，在350 mmol/L NaCl處理下各轉(zhuǎn)基因植株的K+含量有所增加，而野生型植株的K+含量卻顯著減少(圖13b)。

3 討論

本實驗利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高羊茅愛瑞3號的胚性愈傷組織，并且成功地將外源AtSOS途徑基因轉(zhuǎn)入高羊茅中，以提高高羊茅的耐鹽性。

轉(zhuǎn)基因植株主要在DNA、 RNA和蛋白質(zhì)水平上進行分子檢測。在DNA水平上，PCR檢測技術(shù)最為普遍，具有簡單、快速的特點，但容易出現(xiàn)假陽性的問題，需經(jīng)過PCR和Southern blotting的雙重驗證，才能確保目的DNA是否真正整合在植物基因上。

圖13 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株中Na+ (a) 和K+ (b)含量的變化Fig.13 The changes of Na+ (a) and K+ (b) content of transgenic and wild-type plants under salt stress CK：野生型植株；1、2、3分別代表轉(zhuǎn)AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3、AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3基因的植株；0、350分別代表0和350 mmol/L NaCl處理。CK：Wild-type plants;1,2,3 represent the transgenic plants including AtSOS1, AtSOS2-AtSOS3, AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 gene respectively; 0 and 350 represent the salt stress with 0 and 350 mmol/L NaCl respectively.

通過比較鹽脅迫前后野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因高羊茅中過量的Na+可以誘導(dǎo)SOD，POD，CAT的活性，減少活性氧的積累，從而減輕離子毒害。然而活性氧不能被SOD，POD和CAT即時清除，引起的脯氨酸含量顯著上升。轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸的含量增加幅度明顯低于野生型植株(圖11)，這可能是因為鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株中AtSOS途徑基因?qū)a+敏感，加強Na+外排。而在沒有AtSOS途徑基因的野生型植株的細胞質(zhì)中，無法快速有效地外排Na+，抑制了SOD，POD，CAT的活性，造成脯氨酸的大量積累。除此之外，活性氧氧化引起植物膜破壞可以增加MDA含量。隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的MDA含量均增加(圖11)，但是相比較而言，野生型植株呈現(xiàn)大幅度的增加，尤其是在350 mmol/L NaCl處理下，說明轉(zhuǎn)基因植株細胞損傷隨鹽濃度增加變化較小。這些結(jié)果表明AtSOS途徑基因能加速大量Na+的外排，提高植物的耐鹽性。

鹽脅迫通過抑制葉片伸展，關(guān)閉氣孔等途徑使CO2攝取量下降，降低了光合作用過程中有關(guān)酶的活性，從而影響葉綠素的含量。而無機C、N是通過光合作用轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡CC、N，提供植物生長所需的營養(yǎng)。本實驗表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因高羊茅植株和野生型高羊茅植株的葉綠素含量大多呈下降趨勢，AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3共表達的轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量高于野生型(圖12)，表明轉(zhuǎn)基因高羊茅的耐鹽性高于野生型[26]。

鹽處理下，分別表達AtSOS1、AtSOS2-AtSOS3和AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3的轉(zhuǎn)基因植物中Na+的積累比野生型植株少，而K+的吸收多于野生型植株(圖13)。轉(zhuǎn)基因植株中AtSOS1的過表達明顯減少了Na+的積累，這是因為AtSOS1編碼質(zhì)膜的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白能有效地排除細胞質(zhì)中多余的Na+、保護K+通道AKT1，促進K+的內(nèi)流[19,27-28]。AtSOS1活性受AtSOS3-AtSOS2復(fù)合體的正調(diào)控，因此，AtSOS基因可以促進高羊茅根和葉片中Na+的排出，減輕Na+引起的離子毒性作用，提高植物的耐鹽性。

4 結(jié)論

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對草坪草進行AtSOS途徑的單基因以及多基因的遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，在相同鹽處理條件下，與野生型高羊茅相比，轉(zhuǎn)AtSOS基因的高羊茅通過發(fā)揮AtSOS途徑的作用，促進了植物體內(nèi)Na+的外排和區(qū)域化，減輕了鹽脅迫所導(dǎo)致的傷害，并且轉(zhuǎn)基因高羊茅可以在高達350 mmol/L (20.5‰)的鹽環(huán)境下生存，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于野生型植株。

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Introduction ofAtSOSpathway genes into tall fescue to improve salt tolerance

MA Dong-Mei1*, QIN Chu2, NI Xing1, XU Xing1, GUO Ling-Na2

1.SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China; 2.SchoolofLifeScience,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China

Our research group is aiming to genetically engineer tall fescue to improve its salt tolerance, so that it can be used as a salt-tolerant turf grass to improve the soil in salt-contaminated environments. To this end, a regeneration system was established for tall fescue. Using embryogenic calli as the experimental materials, three salt tolerance-relatedAtSOSpathway genes from Arabidopsis thaliana (AtSOS1,AtSOS2,AtSOS3) were introduced in different combinations into the genome of the tall fescue cultivar‘Arid3’ by Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants showed increased salt tolerance. Genomic DNA was extracted from the transgenic tall fescue plants, and PCR detection, Southern blotting, and RT-PCR analyses were conducted. The tall fescue plants transformed with different AtSOS gene combinations and wild-type plants were subjected to salt treatment, with three replicates for each line. The physiological and biochemical indexes, plant height, and Na+, K+, and chlorophyll contents were determined. Under salt stress, the superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), hydrogen peroxidase (CAT) activities were significantly higher in the transgenic plants than in the control plants, and the malondialdehyde (MDA) and proline (Pro) contents were lower than those in the control plants. In the NaCl treatment, the Na+and K+contents in leaves were increased in transgenic and in wild-type plants. Most of the transgenic plants and wild-type plants showed reduced plant height and chlorophyll content under salt treatment, however, the chlorophyll content of transgenic plants harboringAtSOS1-AtSOS2-AtSOS3 was higher than that in control plants. These results demonstrate that the introduction of AtSOS pathway genes into tall fescue can increase its Na+content under salt stress, alleviate the symptoms of salt stress, and improve its salt tolerance.

tall fescue;AtSOSgenes; genetic transformation; salt-resistance

10.11686/cyxb2016195

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-05-09；改回日期：2016-08-04

寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ15002)資助。

麻冬梅(1987-)，女，寧夏銀川人，副教授，博士。E-mail: 932505357@qq.com

麻冬梅, 秦楚, 倪星, 許興, 郭伶娜. 高羊茅應(yīng)答鹽脅迫的AtSOS途徑基因的效應(yīng)分析. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(12): 170-179.

MA Dong-Mei, QIN Chu, NI Xing, XU Xing, GUO Ling-Na. Introduction ofAtSOSpathway genes into tall fescue to improve salt tolerance. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 170-179.