章武,胡美姣,高兆銀,李敏,劉國道,南志標(biāo)

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.嶺南師范學(xué)院，廣東 湛江 524048；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口571101；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州571737)

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草坪草紅絲病與粉斑病病原菌生物學(xué)特性研究與殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定

章武1,2,胡美姣3,高兆銀3,李敏3,劉國道4,南志標(biāo)1*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.嶺南師范學(xué)院，廣東 湛江 524048；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口571101；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州571737)

草坪草紅絲病與粉斑病是發(fā)生于世界范圍內(nèi)可危害多個(gè)草種的重要草坪草病害。本研究對(duì)我國首次報(bào)道的紅絲病和粉斑病病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行了研究并在室內(nèi)測(cè)定了14種殺菌劑對(duì)該兩種病原菌的毒力。研究結(jié)果表明：紅絲病和粉斑病病原菌菌絲適宜生長pH為5～7，最適生長pH為6，菌絲的致死溫度為50 ℃水浴處理10 min。紅絲病和粉斑病病原菌能夠利用多種碳氮源，最適碳源和最適氮源分別為可溶性淀粉和L-谷氨酰胺。紅絲病病原菌最適培養(yǎng)基為燕麥片煎液瓊脂培養(yǎng)基(OMA)；粉斑病病原菌最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)。5%烯唑醇在14種供試殺菌劑中對(duì)紅絲病病原菌和粉斑病病原菌毒力最高，其EC50值分別為0.113和0.282 mg/L；然而，15%甲霜靈·10%霜霉威毒力最低，其EC50值分別為121.522和214.532 mg/L。研究結(jié)果為深入了解病原菌的基礎(chǔ)生物學(xué)及制定防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

紅絲病；粉斑??；生物學(xué)特性；室內(nèi)毒力測(cè)定

伴隨著我國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，城市化進(jìn)程的加快與城市綠化標(biāo)準(zhǔn)的提高，為草坪業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造了良好的條件。面積不斷增加的各類草坪不僅美化了人民生活環(huán)境，而且促進(jìn)了環(huán)境保護(hù)、體育運(yùn)動(dòng)和休閑娛樂等相關(guān)事業(yè)的發(fā)展，草坪業(yè)已成為一項(xiàng)新興產(chǎn)業(yè)，種植草坪是減少大氣污染、維護(hù)生態(tài)平衡、保護(hù)環(huán)境衛(wèi)生、美化城鄉(xiāng)面貌的有效措施之一[1]。然而，病害是造成草坪草早衰與毀滅的主要原因之一。草坪草真菌病害是草坪草上的主要病害，約占病害總數(shù)的80%。其降低草坪質(zhì)量，減少草坪使用年限，從而降低其應(yīng)用價(jià)值。隨著草坪業(yè)的迅猛發(fā)展，草坪草病害的種類和發(fā)生范圍呈逐年增加的趨勢(shì)。在《中國牧草真菌病害名錄》中，列出了包括草坪草在內(nèi)的禾本科草類植物病害1289種，占我國已知草類植物病害總數(shù)的45.5%[2]。我國草坪草病害科技工作者也多次發(fā)現(xiàn)包括草坪草紅絲病(Laetisariafuciformis)和粉斑病(Limonomycesroseipellis)等重要草坪草病害在內(nèi)的國內(nèi)、省內(nèi)新記錄種和已知種的新分布[3-5]。

草坪草紅絲病與粉斑病是發(fā)生于世界范圍內(nèi)的重要草坪草病害[6-7]。紅絲病主要分布在歐洲、北美、澳大利亞的冷濕地區(qū)[8]，該病害在一年的不同時(shí)間均可發(fā)生，尤其在春秋兩季為害最為嚴(yán)重[7-8]。草坪染病后，易形成圓形或不規(guī)則形狀的枯草斑，直徑可達(dá)0.6 m[9]。這時(shí)，紅褐色的病草斑塊，散亂地分布于健草之間，使草坪呈現(xiàn)一片衰敗的景象。在染病葉片尖端形成絲狀菌絲束和粉紅色的節(jié)孢子團(tuán)是紅絲病的主要危害特征[8]。紅絲病病原菌可危害剪股穎屬(Agrostisspp.)、羊茅屬(Festucaspp.)、黑麥草屬(Loliumspp.)、早熟禾屬(Poaspp.)、貓尾草屬(Phleumspp.)等多種的禾本科草坪草及牧草，其中對(duì)多年生黑麥草(Loliumperenne)及紫羊茅(Festucarubra)危害最為嚴(yán)重[9]。

粉斑病主要分布在英國、荷蘭[10]和意大利[11]等地。粉斑病因其危害癥狀、病害循環(huán)、寄主范圍與紅絲病十分相似，曾被誤認(rèn)為是紅絲病[12]。然而，粉斑病病菌不能產(chǎn)生紅絲狀菌核和棉絮狀節(jié)孢子團(tuán)，因此粉斑病傳播速度較慢。粉斑病癥狀與紅絲病十分相似，草坪染病后多形成直徑為5～10 cm粉紅色至淡黃褐色的圓形或不規(guī)則枯草斑。病原菌侵染草坪后不會(huì)顯著降低草坪草的生長速度，并且被病原菌侵染的葉片褪綠不明顯。粉斑病病原菌可侵染剪股穎屬、狗牙根屬(Cynodonspp.)、羊茅屬、黑麥草屬、早熟禾屬等草坪草[9]。

2012年，我國首次報(bào)道了紅絲病危害海南省高爾夫球場(chǎng)海濱雀稗草坪[13]，之后Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)了粉斑病可危害果嶺雜交狗牙根草坪。經(jīng)過為期4年的調(diào)查，Zhang等[15]研究表明紅絲病和粉斑病在我國海南省發(fā)生普遍且可危害多種暖季型草坪草，均為我國首次報(bào)道?，F(xiàn)階段，我國對(duì)草坪草紅絲病與粉斑病的研究較少。研究病原菌的生物學(xué)特性和室內(nèi)測(cè)定殺菌劑對(duì)病原菌的毒力，對(duì)揭示其所引致病害的發(fā)生規(guī)律和制定有效的防治措施具有重要的意義。因此，本研究對(duì)病原菌的生物學(xué)特性和14種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力進(jìn)行深入詳細(xì)的研究，以期為科學(xué)防治這兩種草坪草病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和接種菌餅的制備

2014年3-5月，選取分離自不同地區(qū)和寄主來源的7個(gè)紅絲病菌株(HK-ML136，HK-TD132，WN-KLY221，WC-WC01，QH-BAXC225，DZ-HD02，SY-LQG81)和3個(gè)粉斑病菌株(HK-TD121，SY-LXG101，WN-KLY531)用于生物學(xué)特性鑒定，其中紅絲病菌株HK-ML136和粉斑病菌株HK-TD121用于碳氮源、不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長影響以及殺菌劑對(duì)病原菌毒力的測(cè)定。菌株的詳細(xì)信息見表1。

表1 不同地區(qū)和寄主來源的紅絲病和粉斑病菌株

Table 1L.fuciformisandLi.roseipellisisolates from different locations and hosts

菌株編號(hào)Isolatesnumber寄主(品種)Hosts(Cultivars)地點(diǎn)Locations收集日期Collectiondate(年-月-日Year-month-day)紅絲病病原菌L.fuciformisHK-ML136‘Salam’SP?？贖aikou2011-08-06HK-TD132‘Tifton419’BD海口Haikou2012-07-05WN-KLY221‘SeaIsle2000’SP萬寧Wanning2012-03-13WC-WC01‘SeaIsle2000’SP文昌Wenchang2012-03-26QH-BAXC225‘Platinum’SP瓊海Qionghai2012-03-18DZ-HD02Mascarenegrass儋州Danzhou2012-07-11SY-LQG81‘SeaIsle2000’SP三亞Sanya2012-03-15粉斑病病原菌Li.roseipellisHK-TD121‘Tifton328’BD?？贖aikou2012-02-29SY-LQG101‘SeaIsle2000’SP三亞Sanya2012-03-15WN-KLY531‘Platinum’SP萬寧Wanning2012-03-11

SP：海濱雀稗 Seashore paspalum;BD：雜交狗牙根 Hybrid bermudagrass.

將各供試菌株接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，置于全黑暗25 ℃的條件下培養(yǎng)4 d。在生長良好的菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器圍繞同心圓打孔，將所得菌餅分別接種于如下處理的平板當(dāng)中。

1.2 pH值對(duì)菌絲生長的影響

PDA滅菌之后，在無菌條件下用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將pH值分別調(diào)節(jié)至4，5，6，7，8，9，10七個(gè)梯度。將菌餅分別接種于不同pH值的平板上，每皿為1個(gè)重復(fù)，每處理4次重復(fù)，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種96 h后量取菌落直徑，并計(jì)算菌落生長速率。

1.3 菌絲致死溫度的測(cè)定

挑取菌餅放入10 mL離心管中，加入1 mL無菌水，分別在35，40，45，50，55，60，65 ℃的恒溫水浴中處理10 min，以未經(jīng)水浴處理的菌餅作為對(duì)照。將菌餅取出后移至PDA平板培養(yǎng)基上，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每皿為1個(gè)重復(fù)，每處理4次重復(fù)。4 d后觀察各菌株的存活狀況。菌落可以生長視為存活，不能生長視為死亡。

1.4 碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響

以Czapek培養(yǎng)液(2.00 g KNO3, 1.00 g KH2PO4, 0.5 g KCl, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.01 g FeSO4, 30.0 g蔗糖, 1000 mL蒸餾水)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別用含相同摩爾質(zhì)量碳元素的12種不同碳源：乳糖、D-果糖、D-木糖、D-半乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、D-山梨醇、甘露醇、L-鼠李糖、麥芽糖、D-甘露醇、纖維二糖代替原培養(yǎng)基中的蔗糖，以不加葡萄糖的培養(yǎng)基作為對(duì)照，分別制成含有不同碳源的平板；分別用含相同摩爾質(zhì)量氮元素的11種不同氮源：NaNO3、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、H2NCONH2、(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COON、甘氨酸、蛋白胨、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺，代替原培養(yǎng)基中的KNO3，以不加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，分別制成含有不同氮源的平板。將菌餅分別接種于不同碳、氮源的平板上，每皿為1個(gè)重復(fù)，每處理4次重復(fù)，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種96 h后量取菌落直徑，并計(jì)算菌落生長速率。

1.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

將菌餅分別接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(corn meal agar, CMA)、查彼固體培養(yǎng)基(czapek)、營養(yǎng)牛肉瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar, NA)、燕麥片煎液瓊脂培養(yǎng)基(oat meal aga, OMA)、馬鈴薯胡蘿卜煎液培養(yǎng)基(potato carrot agar, PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(potato sucrose agar, PSA)、理查德固體培養(yǎng)基(richard)、海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(saltwater nutrient agar, SNA)、V-8培養(yǎng)基(V-8 agar, V-8)、結(jié)縷草煎液瓊脂培養(yǎng)基(zoysia grass decoction agar, ZDA)、海濱雀稗煎液瓊脂培養(yǎng)基(seashore paspalum decoction agar, SPDA)、水瓊脂培養(yǎng)基(water agar, WA)共13種培養(yǎng)基平板上。各種培養(yǎng)基的制備參照Li等[16]的方法。每皿為1個(gè)重復(fù)，每處理4次重復(fù)，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種96 h后量取菌落直徑，并計(jì)算菌落生長速率。

1.6 殺菌劑對(duì)病原菌室內(nèi)毒力測(cè)定

1.6.1 供試殺菌劑 供試殺菌劑為田間常用于防治草坪草病害的14種殺菌劑，如下：1)70%代森錳鋅可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化有限公司；2)70%甲基托布津可濕性粉劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司；3)64%精甲霜靈·4%代森錳鋅水分散粒劑，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；4)75%百菌清可濕性粉劑，利民化工股份有限公司；5)50%多菌靈可濕性粉劑，四川國光農(nóng)化有限公司；6)20%三唑酮乳油，四川國光農(nóng)化有限公司；7)40%氟硅唑，上海杜邦農(nóng)化有限公司；8)43%戊唑醇懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；9)15%甲霜靈·10%霜霉威可濕性粉劑，江蘇寶靈化工股份有限公司；10)12.5%腈菌唑乳油，華北制藥集團(tuán)愛諾制藥有限公司；11)50%異菌脲懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；12)12.5%烯唑醇可濕性粉劑，上海愛幫農(nóng)科技有限責(zé)任公司；13)50%咪酰胺錳鹽可濕性粉劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；14)70%惡霉靈可濕性粉劑，京博農(nóng)化科技股份有限公司。

1.6.2 室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長速率法進(jìn)行測(cè)定。在生長狀況良好培養(yǎng)了4 d的菌落邊緣打取菌餅并移至于預(yù)先配制好的含各濃度分別為0、0.1、1.0 和100.0 mg/L的殺菌劑PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長情況，然后測(cè)量菌落直徑，從而計(jì)算出抑菌率。根據(jù)菌株在不同濃度殺菌劑的抑菌率大小，設(shè)置各殺菌劑的濃度梯度用于毒力的測(cè)定，每種殺菌劑均設(shè)為5個(gè)不同的濃度梯度(表2)，每皿為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后量取菌落直徑，計(jì)算出各菌落的凈生長量和相對(duì)抑菌率，從而根據(jù)殺菌劑濃度的對(duì)數(shù)值(x)和相對(duì)抑菌率的概率值(y)得出回歸方程，計(jì)算得到相關(guān)系數(shù)和EC50值。

凈生長量(mm)=菌落直徑(mm)-菌餅直徑(mm)

相對(duì)抑制率=[(對(duì)照凈生長量-處理凈生長量)/對(duì)照凈生長量]×100

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2007軟件錄入制表，并統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖。采用SAS(version 9.0; SAS Institute, Cary, NC)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，并用最小顯著差數(shù)法(LSD)比較不同處理的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)菌絲生長的影響

表2 各殺菌劑的毒力測(cè)定濃度梯度

Table 2 Concentration gradient of fungicides for toxicity determination mg/L

藥劑名稱Fungicides有效成分濃度梯度Concentrationgradientofactiveingredients70%代森錳鋅70%mancozeb20,4,0.8,0.16,0.03270%甲基托布津70%thiophanate-methyl1000,200,40,8,1.664%精甲霜靈·4%代森錳鋅64%metalaxyl-M·4%mancozeb20,4,0.8,0.16,0.03275%百菌清75%chlorothalonil1000,200,40,8,1.650%多菌靈50%carbendazim50,10,2,0.4,0.0820%三唑酮20%triazolone100,20,4,0.8,0.1640%氟硅唑40%flusilazole50,10,2,0.4,0.0843%戊唑醇43%tebuconazole500,100,20,4,0.815%甲霜靈·10%霜霉威15%metal-axyl·10%propamocarb500,100,20,4,0.812.5%腈菌唑12.5%myclobutanil20,4,0.8,0.16,0.03250%異菌脲50%iprodione100,20,4,0.8,0.165%烯唑醇5%diniconazole4,0.8,0.16,0.032,0.006450%咪酰胺錳鹽50%prochloraz100,20,4,0.8,0.1670%惡霉靈70%hymexazol100,20,4,0.8,0.16

紅絲病和粉斑病病原菌各菌株菌絲在pH值為4～10時(shí)均可生長，pH值為5～7時(shí)各菌株生長狀況較好，其中pH值為6時(shí)生長狀況最佳。各菌株在各酸堿度條件生長速度一致，總體來看，偏酸性的環(huán)境條件下有利于菌絲的生長(表3)。

2.2 菌絲致死溫度的測(cè)定

35～45 ℃處理10 min后，紅絲病和粉斑病病原菌各菌落全部生長正常；在45 ℃處理后，有部分菌株的個(gè)別菌落不再生長，且能夠生長的菌落生長速率明顯小于低溫處理的菌株；50 ℃處理后，所有菌落均完全停止生長。結(jié)果說明，各菌株菌絲的致死溫度均為50 ℃/10 min (表4)。

表3 pH值對(duì)菌絲生長的影響

Table 3 Effect of pH on the hyphae growth mm/d

pHHK-ML136HK-TD132WN-KLY221WC-WC01QH-BAXC225DZ-HD02SY-LQG81HK-TD121SY-LXG101WN-KLY5314.06.8d7.9c6.4d5.7d7.3d6.4e5.6d9.1e7.3e8.6e5.011.6a11.4b11.3b11.1b11.6b11.7b10.1b18.6b15.3b17.4b6.012.2a12.6a12.1a11.7a12.4a12.5a11.9a20.3a16.3a18.9a7.010.7b11.2b11.1b10.8b10.9c10.5c9.8b18.7b15.2b17.3b8.07.6c8.4c7.2c6.9c7.6d8.1d6.7c15.9c13.8c15.4c9.04.0e4.3d3.8e3.9e4.1e4.3f3.7e11.6d9.6d10.8d10.00.9f1.2e0.7f0.8f1.1f1.2g0.6f3.3f2.2f2.8f

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different letters indicate significant differences (P<0.05).

表4 各菌株經(jīng)不同溫度水浴處理后的存活情況

Table 4 The survival situation of isolates under different water bath treatment

菌株Isolates水浴處理溫度Thesurvivalsituationofisolatesunderdifferentwaterbathtreatment35℃40℃45℃50℃55℃60℃65℃HK-ML1365/55/52/50/50/50/50/5HK-TD1325/55/55/50/50/50/50/5WN-KLY2215/55/53/50/50/50/50/5WC-WC015/55/55/50/50/50/50/5QH-BAXC2255/55/53/50/50/50/50/5DZ-HD025/55/52/50/50/50/50/5SY-LQG815/55/55/50/50/50/50/5HK-TD1215/55/53/50/50/50/50/5SY-LXG1015/55/55/50/50/50/50/5WN-KLY5315/55/55/50/50/50/50/5

注： 表中數(shù)據(jù)用+/-表示，“+”代表能夠生長的菌落數(shù)量，“-”代表不能生長的菌落數(shù)量。
Note：The data in the Table were shown as +/-，“+”show the number of colony can grow, “-”show the number of colony can’t grow.

2.3 碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響

在供試的13種碳源中，紅絲病和粉斑病病原菌各菌株能夠利用多種碳源，但是各菌株對(duì)碳源選擇存在差異，紅絲病病原菌對(duì)可溶性淀粉利用率最高，其次為D-山梨醇，而對(duì)纖維二糖的利用率較低。粉斑病病原菌對(duì)可溶性淀粉利用率最高，其次為甘露醇和麥芽糖，而對(duì)乳糖的利用率較低。在各供試的碳源中，紅絲病和粉斑病病原菌利用碳源的效果基本一致，然而，紅絲病病原菌利用乳糖、D-木糖、D-半乳糖比粉斑病病原菌的效果好(圖1)。

在供試的12種氮源中，以L-谷氨酰胺為氮源的培養(yǎng)基最適合紅絲病病原菌的生長，其次是磷酸氫二氨，紅絲病病原菌在以乙酸銨為氮源的培養(yǎng)基上不生長。粉斑病病原菌對(duì)L-谷氨酰胺利用率最高，其次為硝酸鈉、硝酸鉀、蛋白胨、L-亮氨酸，而對(duì)磷酸二氫銨、甘氨酸、乙酸銨的利用率較低(圖2)。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響

紅絲病病原菌在燕麥片煎液瓊脂培養(yǎng)基(OMA)上生長速率最快，其次為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)，而在查彼固體培養(yǎng)基(Czapek)和營養(yǎng)牛肉瓊脂培養(yǎng)基(NA)上的生長速率最慢。粉斑病病原菌在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上生長速率最快，其次為燕麥片煎液瓊脂培養(yǎng)基(OMA)、馬鈴薯胡蘿卜煎液培養(yǎng)基(PCA)，而在查彼固體培養(yǎng)基(Czapek)、理查固體培養(yǎng)基(Richard)、海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)這類用無機(jī)元素配制的培養(yǎng)基上生長速率較慢，在營養(yǎng)牛肉瓊脂培養(yǎng)基(NA)上的生長速率最慢(圖3)。

圖1 碳源對(duì)菌絲生長的影響Fig.1 Effect of carbon sources on the hyphae growth

圖2 氮源對(duì)菌絲生長的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on the hyphae growth

1:CK Control；2:蔗糖 Sucrose；3:乳糖 Lactose；4:D-果糖 D-fructose 5:D-木糖 D-xylose；6:D-半乳糖 D-galactose；7:可溶性淀粉 Soluble starch；8:葡萄糖 Glucose；9:D-山梨醇 D-sorbitol；10:甘露醇 Mannitol；11:L-鼠李糖 L-rhamnose;12:麥芽糖Maltose；13:D-甘露醇 D-Mannitol；14:纖維二糖 Cellobiose。不同大小寫字母分別表示同一病原菌不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Different letters indicate significant differences in the same pathogen of different treatments (P<0.05), the same below. 1:對(duì)照CK；2:硝酸鈉Sodium nitrate；3:硝酸鉀Potassium nitrate；4:磷酸二氫銨Ammonium dihydrogen phosphate；5:磷酸氫二氨Diammonium phosphate；6:脲Carbamide；7:硫酸銨 Ammonium sulfate；8:甘氨酸Glycine；9:蛋白胨Peptone；10:氯化銨 Ammonium chloride；11:乙酸銨 Ammonium acetate；12:L-亮氨酸L-aminocaproic acid；13:L-谷氨酰胺 L-glutamine.

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響Fig.3 Effect of different media on the hyphae growth CMA: 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基Corn meal agar; NA: 營養(yǎng)牛肉瓊脂培養(yǎng)基Nutrient agar; OMA: 燕麥片煎液瓊脂培養(yǎng)基Oat meal agar; PCA: 馬鈴薯胡蘿卜煎液培養(yǎng)基Potato carrot agar; PDA: 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基Potato dextrose agar; PSA: 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基Potato sucrose agar; SNA: 海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基Saltwater nutrient agar; V-8: V-8培養(yǎng)基V-8 agar; WA: 水瓊脂培養(yǎng)基Water agar; SPDA: 海濱雀稗煎液瓊脂培養(yǎng)基Seashore paspalum decoction agar; ZDA: 結(jié)縷草煎液瓊脂培養(yǎng)基Zoysia grass decoction agar.

2.5 殺菌劑對(duì)病原菌的毒力

應(yīng)用生長速率測(cè)定法在PDA平板上測(cè)定14種殺菌劑對(duì)L.fuciformis菌絲生長的抑制作用，結(jié)果表明，在供試的14種藥劑中以5%烯唑醇對(duì)紅絲病病原菌的毒力最高，其EC50值僅為0.113 mg/L，其次是64%精甲霜靈·4%代森錳鋅，其EC50值為0.161 mg/L，毒力最低的是15%甲霜靈·10%霜霉威，其EC50值為121.522 mg/L(表5)。

應(yīng)用生長速率測(cè)定法在PDA平板上測(cè)定14種殺菌劑對(duì)粉斑病病原菌的毒力，結(jié)果表明，在供試的14種藥劑中以5%烯唑醇對(duì)粉斑病病原菌的毒力最高，其EC50值僅為0.282 mg/L，其次是12.5%腈菌唑，其EC50值為0.328 mg/L，毒力最低的是15%甲霜靈·10%霜霉威，其EC50值為214.532 mg/L(表6)。

3 討論

紅絲病和粉斑病曾被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)冷暖地區(qū)危害冷季型草坪草的常見病害[9]。而Zhang等[15]調(diào)查發(fā)現(xiàn)L.fuciformis和Li.roseipellis廣泛地分布于我國熱帶地區(qū)(海南省)，紅絲病在海南省主要發(fā)展高爾夫產(chǎn)業(yè)的6個(gè)市縣當(dāng)中均有發(fā)現(xiàn)，粉斑病在其中3個(gè)市縣當(dāng)中有分布。紅絲病和粉斑病均可嚴(yán)重危害海濱雀稗、雜交狗牙根，這兩種草種因其優(yōu)良的坪用特性而被廣泛地運(yùn)用于海南高爾夫球場(chǎng)和城市綠化草坪建植。該兩種病原菌近期才在我國報(bào)道，因此對(duì)其生物學(xué)特性及化學(xué)防治方法進(jìn)行研究具有重要的意義。

表5 14種殺菌劑對(duì)紅絲病病菌的毒力

Table 5 Toxicity of 14 fungicide toL.fuciformis

藥劑名稱Fungicides毒力回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)EC50(mg/L)70%代森錳鋅70%mancozeby=1.109x+5.5370.9870.32870%甲基托布津70%thiophanate-methyly=0.436x+4.1360.99396.11664%精甲霜靈·4%代森錳鋅64%metalaxyl-M·4%mancozeby=1.527x+6.2100.9410.16175%百菌清75%chlorothalonily=0.724x+4.1350.95915.65950%多菌靈50%carbendazimy=1.027x+4.2460.9535.42220%三唑酮20%triazoloney=1.964x+4.2110.9452.52240%氟硅唑40%flusilazoley=0.988x+5.4490.9640.35143%戊唑醇43%tebuconazoley=0.601x+4.9250.9561.33315%甲霜靈·10%霜霉威15%metalaxyl·10%propamocarby=0.378x+4.2120.970121.52212.5%腈菌唑12.5%myclobutanily=1.342x+5.3580.9680.54150%異菌脲50%iprodioney=2.013x+4.7090.9641.3955%烯唑醇5%diniconazoley=0.774x+6.5210.9960.11350%咪酰胺錳鹽50%prochlorazy=1.137x+4.1480.9955.61570%惡霉靈70%hymexazoly=0.878x+4.9680.9891.088

EC50：抑制中濃度 Median effective concentration. 下同 The same below.

表6 14種殺菌劑對(duì)粉斑病病菌的毒力

Table 6 Toxicity of 14 fungicide toLi.roseipellis

藥劑名稱Fungicides毒力回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)EC50(mg/L)70%代森錳鋅70%mancozeby=0.895x+5.7040.9820.64370%甲基托布津70%thiophanate-methyly=0.471x+4.0430.998107.92864%精甲霜靈·4%代森錳鋅64%metalaxyl-M·4%mancozeby=0.831x+6.0040.9870.62275%百菌清75%chlorothalonily=0.244x+5.9170.98112.13550%多菌靈50%carbendazimy=1.330x+4.6220.99111.94220%三唑酮20%triazoloney=1.421x+5.2070.9830.72040%氟硅唑40%flusilazoley=1.286x+1.0580.9630.45043%戊唑醇43%tebuconazoley=0.467x+5.6720.9741.3615%甲霜靈·10%霜霉威15%metalaxyl·10%propamocarby=0.543x+3.7340.987214.53212.5%腈菌唑12.5%myclobutanily=0.741x+5.9530.9870.32850%異菌脲50%iprodioney=1.824x+4.7930.9861.2995%烯唑醇5%diniconazoley=0.793x+6.2280.9940.28250%咪酰胺錳鹽50%prochlorazy=0.879x+4.9660.9961.09370%惡霉靈70%hymexazoly=0.601x+5.4010.9822.152

本試驗(yàn)對(duì)病原菌生物學(xué)特性研究表明，L.fuciformis和Li.roseipellis對(duì)酸堿度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在pH值為4～10的條件下均能較好地生長，偏酸性的條件有利于菌絲的生長，這與海南省當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境為偏酸性相一致，因此改善土壤酸堿度可以有效預(yù)防病害的發(fā)生。碳氮源對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis菌絲生長影響的結(jié)果表明，這兩種病原菌可利用多種碳氮源，說明這兩種病原菌除了從寄主植物中獲取所需養(yǎng)分外也可利用大田環(huán)境中的各種碳氮源，從而增加對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。L.fuciformis和Li.roseipellis對(duì)供試的13種碳源和12種氮源有一定的選擇性，可溶性淀粉和硝酸銨分別是最佳碳源和最佳氮源，研究還發(fā)現(xiàn)，在不加碳源和氮源的培養(yǎng)基中，菌絲雖然能生長，但菌絲稀薄生長狀況不佳，說明碳源和氮源對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis的生長起著重要的作用。L.fuciformis的最適合生長培養(yǎng)基為OMA，而Li.roseipellis最適合生長的培養(yǎng)基為PSA和PDA。這兩種病原菌在PSA、PDA、OMA、PCA等植物性有機(jī)培養(yǎng)基上生長狀況良好，在Czapek、Richard、SNA等用無機(jī)元素配制的培養(yǎng)基上生長情況較差，說明這兩種病原菌利用的營養(yǎng)元素較為復(fù)雜，Li.roseipellis和L.fuciformis作為植物病原菌，菌絲的生長除了需要Czapek、Richard、SNA等培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素外，還需要植物中的一些微量元素。這與Li等[16]研究沙打旺黃矮根腐病病原埃里磚隔孢(Embellisiaastragali)的營養(yǎng)利用情況結(jié)果一致。

本研究測(cè)定了14種殺菌劑對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis的毒力，結(jié)果表明，供試的14種殺菌劑對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis均有一定的抑制作用，但是差異較大。5%烯唑醇，40%氟硅唑，12.5%腈菌唑和20%三唑酮等14-α-脫甲基反應(yīng)抑制劑有效抑制了L.fuciformis和Li.roseipellis的菌絲生長，其中，5%烯唑醇對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis的毒力最大，其EC50值最小，可作為防治紅絲病與粉斑病的有效殺菌劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，20%三唑酮對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis也具有較強(qiáng)的毒力，其EC50值分別為2.522和0.720 mg/L，這與Gould等[17]研究結(jié)果一致。14-α-脫甲基反應(yīng)抑制劑屬于多作用位點(diǎn)殺菌劑，屬于低等抗性風(fēng)險(xiǎn)藥劑，且抗性菌株環(huán)境適應(yīng)能力較差，因此只要田間合理施藥，不易形成抗性群體[18]。而甲基托布津?qū).fuciformis和Li.roseipellis菌絲生長的抑制效果較差，其EC50值分別為96.116和107.928 mg/L，同樣作為苯并咪唑類殺菌劑的多菌靈對(duì)兩種病原菌的抑制效果也較差，其EC50值分別為5.422和11.922 mg/L。說明分離自海南省的菌株可能已經(jīng)對(duì)苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性。包括甲基托布津和多菌靈在內(nèi)的苯并咪唑類殺菌劑因其殺菌效果好、范圍廣等特點(diǎn)已被廣泛用于草坪草真菌病害的防治當(dāng)中，然而因其作用位點(diǎn)單一，隨著長期、重復(fù)單一的使用同一種殺菌劑，抗性問題變得越來越嚴(yán)重。已有研究表明禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)[19-20]與禾草幣斑病菌(Sclerotiniahomoeocarpa)[21-24]等草坪草病原菌已對(duì)苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性問題。因此，還需進(jìn)一步對(duì)L.fuciformis和Li.roseipellis群體抗藥性進(jìn)行深入研究才能了解其對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗性水平。

本研究測(cè)定了草坪草紅絲病和粉斑病病原菌的生物學(xué)特性及多種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力。這些研究結(jié)果為深入了解病原菌的基礎(chǔ)生物學(xué)提供科學(xué)依據(jù)，并可幫助人們更好地制定防治策略。在實(shí)際管理中，農(nóng)藥對(duì)病害的防控能夠起到比較好的效果[25]，但是，同樣會(huì)給環(huán)境及人類的健康造成不良的影響。許多發(fā)達(dá)國家如美國和加拿大的許多地區(qū)已經(jīng)明令禁止草坪養(yǎng)護(hù)過程中過多使用化學(xué)藥劑，我國也已通過一系列的生物防治手段增加草坪草的抗逆性[26-27]。草坪草紅絲病與粉斑病的發(fā)生受環(huán)境[9]、寄主[28-29]和水肥[30-31]影響較大。因此，暖季型草坪草紅絲病和粉斑病需采用綜合防治策略。

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Biological characteristics ofLaetisariafuciformisandLimonomycesroseipellisand their responses to different fungicides

ZHANG Wu1,2, HU Mei-Jiao3, GAO Zhao-Yin3, LI Min3, LIU Guo-Dao4, NAN Zhi-Biao1*

1.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.LingnanNormalCollege,Zhanjiang524048,China; 3.EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,China; 4.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737,China

Red thread and pink patch, caused by the fungiLaetisariafuciformisandLimonomycesroseipellis, respectively, are important diseases of many turfgrass species worldwide. In this study, we analyzed the biological characteristics of these two pathogens and evaluated their responses to 14 different fungicides. The results showed thatL.fuciformisandLi.roseipellisgrew well at pHs ranging from 5 to 7, and the optimal pH value was 6. The hyphae of both pathogens lost viability in agar plugs that were incubated at 50 ℃ for 10 min. The optimal carbon and nitrogen sources forL.fuciformisandLi.roseipelliswere soluble starch and L-glutamine, respectively. The optimal medium forL.fuciformiswas oatmeal agar (OMA) and that forLi.roseipelliswas potato dextrose agar (PDA) or potato sucrose agar (PSA). Among the 14 fungicides, diniconazole had the strongest inhibitory effects onL.fuciformisandLi.roseipelliswith EC50values of 0.113 mg/L and 0.282 mg/L, respectively. The fungicide with the weakest inhibitory effects was 15% metalaxyl·10% propamocarb, with EC50values of 121.522 and 214.532 mg/L forL.fuciformisandLi.roseipellis, respectively. The results provide a scientific basis for understanding the basic biology of these pathogens, and may be useful for the development of new management strategies.

Laetisariafuciformis;Limonomycesroseipellis; charactertistic; toxicity response

10.11686/cyxb2016058

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-02-01；改回日期：2016-06-06

國家公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)(201303057)，國家自然科學(xué)基金(31602002)和廣東省教育廳重點(diǎn)平臺(tái)及科研項(xiàng)目——青年創(chuàng)新人才類項(xiàng)目(2015KQNCX093)資助。

章武(1987-)，男，江西撫州人，講師。E-mail：ldzw1987@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：zhibiao@lzu.edu.cn

章武, 胡美姣, 高兆銀, 李敏, 劉國道, 南志標(biāo). 草坪草紅絲病與粉斑病病原菌生物學(xué)特性研究與殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(12): 140-149.

ZHANG Wu, HU Mei-Jiao, GAO Zhao-Yin, LI Min, LIU Guo-Dao, NAN Zhi-Biao. Biological characteristics ofLaetisariafuciformisandLimonomycesroseipellisand their responses to different fungicides. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 140-149.