李慶華， 任永強， 祖紅旭， 王肖蓉△

(河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院 1燒傷整形外科， 2整形美容科，河南 洛陽 471003)

烏司他丁聯(lián)合黃連素對燒傷膿毒癥的療效分析

李慶華1， 任永強2， 祖紅旭1， 王肖蓉1△

(河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院1燒傷整形外科，2整形美容科，河南 洛陽 471003)

目的： 觀察烏司他丁聯(lián)合黃連素對燒傷膿毒癥大鼠的療效。方法:采用蒸燙機熨燙并注射銅綠假單胞菌菌液的方法建立燒傷膿毒癥大鼠模型。分別給予燒傷膿毒癥大鼠烏司他丁、黃連素以及烏司他丁和黃連素合劑，記錄大鼠存活率與體重，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清中細胞因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量，蘇木精-伊紅染色法檢測肝臟組織形態(tài)學，對肝臟、肺臟和脾臟組織進行細菌定量。結(jié)果:烏司他丁聯(lián)合黃連素能顯著提高燒傷膿毒癥大鼠的存活率與體重，抑制血清中IL-6和TNF-α含量的升高，上調(diào)IL-10的含量，抑制肝細胞萎縮以及肝臟細胞凋亡，并降低肝臟、肺臟和脾臟的細菌含量。結(jié)論:烏司他丁聯(lián)合黃連素能夠緩解燒傷膿毒癥的癥狀，可能與其調(diào)節(jié)細胞因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量，以及降低器臟細菌含量有關。

烏司他?。?黃連素； 燒傷膿毒癥； 細菌含量

膿毒癥是由感染導致機體引起的一種難以控制的，瀑布式的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。創(chuàng)傷感染是引發(fā)膿毒癥的主要原因，當作為天然屏障的皮膚燒傷后，大量細菌與毒素通過燒傷創(chuàng)面入侵。創(chuàng)面越大，感染發(fā)生率越高，膿毒癥的病死率越高[1]。普遍公認有效的創(chuàng)面處理是防治燒傷膿毒癥的最根本的措施[2]，但在皮膚屏障重新建立之前，始終存在著感染的危險，一旦感染，可發(fā)展為燒傷膿毒癥，當進一步發(fā)展為膿毒癥休克或嚴重膿毒癥，目前尚無有效的治療手段，對燒傷患者具有嚴重的生命威脅。全球約有1 800萬患有嚴重膿毒癥的病人，并且每年呈逐漸上升的趨勢[3]。

黃連素又稱小檗堿(berberine，Ber)，是傳統(tǒng)清熱解毒中藥黃連的主要生物堿活性成分[4]，研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有抗病原微生物的功效，如上呼吸道感染、腸炎、細菌性痢疾等，具有良好的療效。烏司他丁(ulinastatin，Uli)是炎癥過程中體內(nèi)伴生的一種抗炎分子，能夠抑制炎癥過程中炎性因子的釋放[5]。本實驗建立燒傷膿毒癥大鼠模型，分別觀察烏司他丁、黃連素及聯(lián)用時對燒傷膿毒癥的療效。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠50只，體重200～230 g， 8～10周齡，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(滬)2012-0002，自由飲水進食，進行適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑 ATCC27853銅綠假單胞菌購自ATCC；黃連素購自大連美侖生物科技有限公司；烏司他丁購自上海酶聯(lián)實業(yè)有限公司；IL-6、IL-10和TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自上海西唐生物科技公司。

2 實驗方法

2.1 分組和燒傷膿毒癥模型的建立 采用隨機方法將大鼠分為對照(control)組、模型(model)組、Uli組、Ber組與聯(lián)合(combination，Com)組，每組10只大鼠；肌肉注射10%水合氯醛麻醉，剪去大鼠背部的毛，用8%硫化鈉水溶液脫去殘余細毛，除對照組外其余各組大鼠均用蒸燙機(96～98 ℃)充分持續(xù)接觸背部脫毛處8 s，至II～III級燙傷，待創(chuàng)面溫度下降后，于創(chuàng)面中心注射50 μL的銅綠假單胞菌菌液(2.0×105CFU)。造模后，烏司他丁組尾腹腔注射烏司他丁(100 U·g-1·d-1)，共給藥7 d；黃連素組以黃連素灌胃(100 mg·kg-1·d-1)，共給藥7 d；聯(lián)合組同時給予腹腔注射烏司他丁100 U·g-1·d-1，黃連素灌胃100 mg·kg-1·d-1，共給藥7 d，模型組大鼠給予相同劑量的生理鹽水

2.2 大鼠體重與存活率 造模成功后每天記錄大鼠體重，觀察大鼠的活動狀態(tài)。

2.3 ELISA檢測細胞因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量 給藥完成后，尾靜脈取血，離心分離得到血清。嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書進行，預包被酶標版上加入標準品和樣品，加入生物素化標記的抗體，加入底物工作液顯色，20 min后加入硫酸終止反應，于450 nm波長處檢測吸光度(A)值，計算各細胞因子的含量。

2.4 蘇木精-伊紅染色法 給藥完成后，過度麻醉大鼠后，處死，分離肝臟組織，制作石蠟切片，分別浸入二甲苯I、II，各10 min，分別依次浸入梯度乙醇溶液(100%、95%、80%、70%)，蒸餾水洗滌，蘇木精染色5～10 min，自來水洗去殘液，放入1%鹽酸乙醇30 s，1%氨水返藍，0.5%伊紅復染，再次依次浸入梯度乙醇溶液(70%、80%、95%、100%)，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.5 組織細菌定量 給藥完成后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定四肢，暴露腹主動脈，插入置留針，固定，連接上1%肝素氯化鈉溶液，暴露心臟，剪開右心耳，當右心耳流出液體清亮后，切取肝臟、肺臟和脾臟組織，用氯化鈉溶液清洗，置于無菌凍存管中，4 ℃暫存。在無菌條件下，用PBS以0.1 g/mL比例勻漿組織，研磨，將勻漿液離心10 min，取上清液，稀釋10倍后接種于瓊脂板，37 ℃孵育過夜，觀察菌落形成單位并記錄。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的存活率及體重

觀察各組大鼠7 d的存活率，對照組和聯(lián)合組無大鼠死亡；模型組在24 h存活率為80%，72 h存活率僅為50%，并趨于穩(wěn)定，低于其它各組；烏司他丁組48 h存活率為90%，并趨于穩(wěn)定，黃連素組36 h存活率為90%，48 h存活率為80%，并趨于穩(wěn)定(圖1)。對照組大鼠體重無顯著變化，模型組大鼠在24 h平均體重下降約10%，持續(xù)下降，于72 h平均體重下降約25%；烏司他丁組與黃連素組24 h平均體重下降約10%，持續(xù)穩(wěn)定(圖2)。

2 血清中IL-6、IL-10和TNF-α的含量

實驗教學和理論教學應該是相輔相成的。但實際上，由于教師更注重理論知識的教授，使得實驗教學成為理論教學的輔助手段,導致了實驗教學相對薄弱。

與對照組相比，模型組的大鼠血清中IL-6和TNF-α含量顯著升高，IL-10含量無明顯變化；與模型組相比，烏司他丁組、黃連素組和聯(lián)合組的大鼠血清中IL-6和TNF-α含量明顯降低，IL-10含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學顯著性，其中以聯(lián)合組的變化最明顯，見圖3。

3 肝臟的組織形態(tài)學

對照組的肝組織結(jié)構(gòu)正常，可見肝小葉結(jié)構(gòu)；模型組肝細胞透明變性，空泡狀，無明顯肝小葉的放射狀結(jié)構(gòu)；烏司他丁組和黃連素組可見部分肝細胞萎縮，偶見空泡狀，可見肝小葉放射狀結(jié)構(gòu)；聯(lián)合組干細胞偶見干細胞萎縮，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，見圖4。

4 肝臟、肺臟和脾臟細菌定量

Figure 1.The change of survival rate in each group. Mean±SD.n=10.

圖1 各組大鼠存活率的變化

Figure 2.The change of body weight in each group. Mean±SD.n=10.

圖2 各組大鼠體重的變化

Figure 3.The serum contents of IL-6, IL-10 and TNF-α in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖3 各組血清中IL-6、IL-10和TNF-α含量的變化

討 論

微生物入侵機體感染后導致全身炎癥反應綜合征是膿毒癥，由于創(chuàng)傷等因素導致過度炎癥反應一旦失控，隨即可誘發(fā)機體產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)呈瀑布樣釋放，機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，使得免疫防御功能下降，產(chǎn)生過量炎性介質(zhì)，加重組織細胞的損傷，導致多器官功能障礙[6]。大量研究表明在嚴重燒傷后，細菌激活巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6和IL-8等促炎細胞因子，并進一步導致炎癥反應失控，同時抑制巨噬細胞分泌IL-10[7-8]。TNF-α是主要的炎性細胞因子，能激活細胞因子的級聯(lián)反應，誘發(fā)IL-1、IL-8、NO和前列腺素的生成，造成一系列炎癥反應。IL-6是機體存在持續(xù)炎性反應的潛在標志，當機體受到嚴重損傷時，血液中的IL-6含量顯著升高。IL-6通過抑制內(nèi)毒素，從而抑制內(nèi)毒素誘導的TNF-α合成，進一步抑制IL-1的合成。IL-6會促使肝臟急性反應蛋白的合成，并刺激抗體的生成[9]。本實驗中模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量顯著高于其它各組，烏司他丁聯(lián)合黃連素處理后，血清中TNF-α和IL-6的含量明顯降低，可能是烏司他丁抑制蛋白水解酶的活性，從而減少由于組織細胞破壞所產(chǎn)生的炎癥刺激因子對巨噬細胞的激活有關，同時黃連素對細菌、真菌等致病微生物的抑制作用，進一步降低炎性因子的生成。IL-10由Th2細胞產(chǎn)生，是機體內(nèi)重要的抗感染細胞因子。本實驗中，烏司他丁聯(lián)合黃連素處理后，顯著增加血清中IL-10的含量，提示機體的抗感染因子增加，烏司他丁和黃連素聯(lián)用后可能增加機體抗感染能力。由此我們推測烏司他丁聯(lián)合黃連素通過抑制TNF-α誘導中性顆粒細胞抑制因子降解，進而減弱中性粒細胞的活性，從而抑制炎癥的產(chǎn)生。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用烏司他丁和黃連素能夠顯著提高燒傷膿毒癥大鼠的存活率，并降低臟器的細菌含量，且效果顯著優(yōu)于單獨應用的效果，可能是由于烏司他丁可抑制炎癥介質(zhì)釋放，同時聯(lián)合黃連素的抗病原微生物作用，二者起協(xié)同作用，進一步降低機體的感染，從而提高燒傷膿毒癥大鼠的存活率。此外，黃連素是常用的中藥單體，具有易獲得性，更適用于廣泛的臨床推廣。

Figure 4.The morphological changes of the liver in each group (×200).

圖4 各組肝臟組織形態(tài)學的變化

Figure 5.The bacterial quantitation of liver, lung and spleen in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖5 肝臟、肺臟和脾臟的細菌定量檢測

綜上所述，烏司他丁聯(lián)合黃連素具有改善燒傷膿毒癥大鼠癥狀的療效，為臨床的應用提供了理論依據(jù)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Therapeutic effect of ulinastatin and berberine on burn sepsis in rats

LI Qing-hua1, REN Yong-qiang2, ZU Hong-xu1, WANG Xiao-rong1

(1DepartmentofBurnandPlasticSurgery,2DepartmentofPlasticSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,ClinicalMedicalCollege,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China.E-mail:wangxiaoronghaust@163.com)

AIM: To investigate the combination therapeutic effect of ulinastatin and berberine on burn sepsis in the rats.METHODS: The rats with burn sepsis were administrated with ulinastatin or berberine or combination therapy. The survival rate and body weight of the rats were measured. The levels of IL-6, IL-10 and TNF-α were examined by ELISA. The morphological changes of the lung were observed by hematoxylin and eosin staining. The content of bacteria in the liver, lung and spleen tissues was detected.RESULTS: Combination of ulinastatin and berberine significantly increased the survival rate and body weight in the rats with burn sepsis. Moreover, combination therapy inhibited the elevation of IL-6 and TNF-α levels, whereas increased the IL-10 level. Combination therapy protected the structure of hepatic lobule, and further reduced the bacterial content in the liver, lung and spleen.CONCLUSION: Combination of ulinastatin and berberine improves the symptoms of burn sepsis by regulating the levels of IL-6, IL-10 and TNF-α and inhibiting the content of bacteria.

Ulinastatin; Berberine; Burn sepsis; Bacterial content

1000- 4718(2016)12- 2272- 04

2016- 06- 23

2016- 09- 05

R363； R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.025

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0379-64830646； E-mail: wangxiaoronghaust@163.com