楊淑娟， 何英利， 馬曉華， 姜 娜

(1西安市第八醫(yī)院肝病二病科, 2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科, 3西安市第八醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 陜西 西安 710061)

碧蘿芷通過(guò)下調(diào)ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化

楊淑娟1△， 何英利2， 馬曉華3， 姜 娜1

(1西安市第八醫(yī)院肝病二病科,2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科,3西安市第八醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 陜西 西安 710061)

目的： 探究碧蘿芷對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的影響。方法：5 μg/L TGF-β1和不同濃度碧蘿芷(0、10、25、50 mg/L)分別作用于LX-2細(xì)胞，在有或無(wú)自噬抑制劑3-MA和ERK抑制劑PD98059的情況下，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，5 μg/L TGF-β1組的LX-2細(xì)胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明顯增加(P<0.05)。而碧蘿芷預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著(P<0.05)。而且，與TGF-β1組相比較，50 mg/L碧蘿芷、5 mmol/L 3-MA或者20 μmol/L PD98059預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：碧蘿芷通過(guò)下調(diào)ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化。

碧蘿芷； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 自噬； 肝星狀細(xì)胞； 細(xì)胞活力

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由多種因素引起的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成和降解不平衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織的過(guò)度沉積，被視為各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)階段[1-2]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是形成HF的主要細(xì)胞，其過(guò)度活化增殖是HF進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)，以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)增多為最顯著的活化標(biāo)志。有研究認(rèn)為，阻止HSC的活化有可能阻斷HF的進(jìn)程[3]，因此，尋找合適的藥物阻止HSC活化增殖是抗HF的重要途徑。

碧蘿芷(Pycnogenol，PYC)是法國(guó)海岸松樹(shù)皮的提取物，主要由低聚前花青素和其它生物類黃酮及有機(jī)酸等生物活性的水溶性成分組成[4]。它是一種較強(qiáng)的天然抗氧化劑，可通過(guò)多種途徑清除氧自由基，抑制炎癥因子生成。有研究表明，碧蘿芷可明顯減輕非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型的肝損傷反應(yīng)[5]。HF是繼發(fā)于各種原因引起的肝臟炎癥或肝損傷修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)[1]，因此我們推測(cè)碧蘿芷可能在HF發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮改善作用?；罨腍SC可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)被認(rèn)為是最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子[6]。目前，有關(guān)碧蘿芷是否影響HF病理進(jìn)程的研究尚未報(bào)道，因此有必要首先探討碧蘿芷是否在外源性TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)以人肝星狀細(xì)胞株LX-2為研究對(duì)象，探究碧蘿芷對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化的影響以及相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床抗肝纖維化預(yù)防和治療提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人肝星狀細(xì)胞株LX-2(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；碧蘿芷粉末(Henkel)；DMEM和胎牛血清(Gibco)；TGF-β1、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、PD98059、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和抗α-SMA鼠單抗(Sigma)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo)；抗ERK1/2鼠單抗、抗p-ERK1/2羊多抗和抗β-actin兔多抗(Santa Cruz)；抗beclin 1兔多抗、抗LC3兔多抗、抗ColⅠ鼠單抗和抗TIMP-1兔單抗(Abcam)；PVDF膜(Millipore)；ECL、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG II抗、山羊抗兔IgG II 抗和驢抗山羊 IgG II 抗(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LX-2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。融合度約為80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，更換培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞處理 碧蘿芷溶解于DMSO中，-20 ℃保存。所有含10、25、50 mg/L 等濃度碧蘿芷，20 μmol/L PD98059和5 mmol/L 3-MA的培養(yǎng)液均由含0.2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制。細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h后，加入含不同濃度碧蘿芷的培養(yǎng)基，預(yù)孵育1 h后，加入終濃度為5 μg/L TGF-β1，孵育24 h后，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。含20 μmol/L PD98059或者5 mmol/L 3-MA的培養(yǎng)基預(yù)處理30 min。各組細(xì)胞用相應(yīng)處理的培養(yǎng)基孵育時(shí)間一致。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 按每孔1×104個(gè)的密度將LX-2細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL培養(yǎng)基，24 h后換液，無(wú)血清培養(yǎng)24 h。隨后分5組，對(duì)照組，5 μg/L TGF-β1+碧蘿芷(0、10、25、50 mg/L)組，分別加180 μL相應(yīng)處理的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。作用24 h后，向待測(cè)孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO，溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度(A)，則各組細(xì)胞相對(duì)活力(%)=處理組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白的水平 按每孔4×105個(gè)的密度將LX-2細(xì)胞接種于6孔板，24 h后換液，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)。24 h后，分別加相應(yīng)處理的培養(yǎng)基孵育。作用24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后，加入RAPI細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞全蛋白。經(jīng)BCA定量、上樣、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、 I抗孵育、 II 抗孵育和ECL顯影等步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin蛋白水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活力

MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞處理24 h后，與對(duì)照組相比，5 μg/L TGF-β1組的相對(duì)細(xì)胞活力明顯增加。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見(jiàn)圖1。

2 碧蘿芷下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞處理24 h后，與對(duì)照組相比，5 μg/L TGF-β1組肝星狀LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA、ColⅠ和TIMP-1等蛋白表達(dá)明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced viability of the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖1 碧蘿芷處理對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein expression of α-SMA, ColⅠand TIMP-1 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖2 碧蘿芷處理對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞α-SMA、ColⅠ和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

3 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞自噬

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞處理24 h后，與對(duì)照組相比，5 μg/L TGF-β1組LX-2細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin1的蛋白表達(dá)明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平均降低，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見(jiàn)圖3。

4 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞ERK磷酸化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞處理24 h后，與對(duì)照組相比，5 μg/L TGF-β1組LX-2細(xì)胞p-ERK1/2的蛋白水平明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)均降低，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein expression of LC3-Ⅱ/Ⅰand beclin 1 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖3 碧蘿芷處理對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin 1蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein levels of p-ERK1/2 and ERK1/2 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖4 碧蘿芷處理對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的影響

5 碧蘿芷通過(guò)下調(diào)ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞處理24 h后，與5 μg/L TGF-β1組相比較，50 mg/L碧蘿芷、20 μmol/L PD98059或者5 mmol/L 3-MA預(yù)處理下，TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活力以及p-ERK1/2、α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平均明顯下調(diào)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effects of Pycnogenol (PYC), 3-MA or PD98059 on TGF-β1-induced cell viability (A) and protein levels of p-ERK1/2 (B), α-SMA and LC3-Ⅱ/Ⅰ (C) in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖5 碧蘿芷、3-MA和PD98059處理對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活力以及p-ERK1/2、α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平的影響

討 論

目前，我國(guó)各種肝病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，HF是各種肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，如果得不到有效的治療，最終發(fā)展成肝硬化，甚至引起肝功能衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，并導(dǎo)致死亡。HF形成是由各種致病因子引起肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)ECM過(guò)度沉淀的極為復(fù)雜的生理病理過(guò)程。由于肝纖維化發(fā)生的機(jī)制極其復(fù)雜，目前臨床上實(shí)用的藥物療效并不理想。TGF-β1是促進(jìn)HF形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它通過(guò)促進(jìn)HSC活化，使其失去脂質(zhì)液滴及其向肌成纖維樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致大量ECM合成，加重并最終導(dǎo)致HF。因此，肝纖維化發(fā)生的最終途徑是HSC活化，如何抑制HSC活化是HF治療的重要研究方向。

碧蘿芷是法國(guó)西南部沿海森林中生長(zhǎng)的松樹(shù)的提取物，是一種水溶性復(fù)合抗氧化劑。它含有包括生物類黃酮、有機(jī)酸及其他有生物活性在內(nèi)的40多種成分，其中以前花青素為主。原花青素注射的大鼠的血清代謝物可降低HepG2細(xì)胞脂類合成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，碧蘿芷具有清除自由基、皮膚保健、抗炎和防治心血管疾病等多種保健功能。碧蘿芷可改善免疫缺陷小鼠的肝氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]，有效減輕Ⅱ型糖尿病大鼠中高血糖誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷[8]和Ⅰ型糖尿病大鼠模型的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，并抑制TNF-α和IL-1β等炎癥因子表達(dá)[9]。大量文獻(xiàn)顯示，碧蘿芷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷[10]以及四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝氧化損傷和急性肝損傷均有明顯的抑制作用[11-12]。而且，碧蘿芷能顯著抑制非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型中的肝脂肪變性和和纖維化等肝損傷病理進(jìn)程[5]。文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1在人體HF組織中高表達(dá)，可在HF過(guò)程中誘導(dǎo)α-SMA和ColⅠ的表達(dá)[13]，并促進(jìn)HSC的活化增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，碧蘿芷能下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、ColⅠ和TIMP-1等蛋白表達(dá)，從而抑制LX-2細(xì)胞的活化。

自噬是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及細(xì)胞器參與自我更新及能量代謝的重要生物學(xué)過(guò)程，在促進(jìn)HSC能量代謝并維持HSC活化狀態(tài)過(guò)程中具有重要作用。HSC活化伴隨著自噬流升高，下調(diào)HSC自噬則顯著抑制其活化[15]。自噬抑制劑3-MA通過(guò)降低細(xì)胞增殖，并下調(diào)α-SMA、ColⅠ和LC3-Ⅱ/Ⅰ等蛋白表達(dá)，抑制HSC的活化增殖[16]。而且，TGF-β1可通過(guò)誘導(dǎo)自噬降低HSC凋亡[17]，碧蘿芷能降低萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)的凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，碧蘿芷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞自噬。此外，ERK信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖分化、穩(wěn)態(tài)維持、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)反應(yīng)，最近發(fā)現(xiàn)不同處理因素下ERK磷酸化的增強(qiáng)是自噬發(fā)生的一個(gè)重要因素[19]。TGF-β1促進(jìn)ERK磷酸化[20]，并刺激上調(diào)HSC中α-SMA和TIMP-1蛋白的表達(dá)[21]。另外，有研究表明，ERK磷酸化水平的下降和ECM沉積的減少能夠有效抑制HF過(guò)程中HSC活化[22-23]。ERK抑制劑PD98059可有效抑制HSC中α-SMA的表達(dá)[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碧蘿芷通過(guò)下調(diào)ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化。結(jié)合參考文獻(xiàn)，我們推測(cè)，碧蘿芷可能通過(guò)下調(diào)ERK介導(dǎo)的自噬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Pycnogenol suppresses TGF-β1-induced hepatic stellate cell activation via ERK-mediated autophagy inhibition

YANG Shu-juan1, HE Ying-li2, MA Xiao-hua3, JIANG Na1

(1DepartmentofHepatologySectionII,TheEighthHospitalofXi’an,2DepartmentofInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,3DepartmentofIntensiveCareMedicine,TheEighthHospitalofXi’an,Xi’an710061,China.E-mail:pingxuqingdao@163.com)

AIM: To explore the effect of Pycnogenol on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced hepatic stellate cell activation. METHODS: Cultured LX-2 cells were treated with 5 μg/L TGF-β1 and different concentrations (0, 10, 25 and 50 mg/L) of Pycnogenol. The viability of the LX-2 cells under the conditions with or without autophagy inhibitor 3-MA and ERK inhibitor PD98059 was determined by MTT assay. The protein levels of α-SMA, ColⅠ, TIMP-1, LC3-Ⅱ/Ⅰ, beclin 1, p-ERK1/2 and ERK1/2 were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, 5 μg/L TGF-β1 treatment elevated the cell viability, and increased the protein levels of α-SMA, ColⅠ, TIMP-1, LC3-Ⅱ/Ⅰ, beclin 1, p-ERK1/2, and ERK1/2 in the LX-2 cells (P<0.05). However, these effects were reversed by Pycnogenol pretreatment in a dose-dependent manner and the inhibitory effect of 50 mg/L Pycnogenol was the most significant in the LX-2 cells (P<0.05). Furthermore, compared with TGF-β1 group, pretreatment with 50 mg/L Pycnogenol, 5 mmol/L 3-MA or 20 μmol/L PD98059 downregulated TGF-β1-induced cell viability and the protein levels of α-SMA and LC3-Ⅱ/Ⅰ in the LX-2 cells (P<0.05). CONCLUSION: Pycnogenol suppresses TGF-β1-induced hepatic stellate cell activation via p-ERK and autophagy inhibition.

Pycnogenol; Transforming growth factor-β1; Autophagy; Hepatic stellate cells; Cell viability

1000- 4718(2016)12- 2261- 05

2016- 06- 22

2016- 09- 20

R575.2; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.023

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