李 楓， 姚 麗， 張喜紅， 夏玉紅， 程 劼， 婁雪玲， 姜秋慧

(鄭州人民醫(yī)院婦科， 河南 鄭州 450000)

miRNA-22在卵巢癌組織的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

李 楓△， 姚 麗， 張喜紅， 夏玉紅， 程 劼， 婁雪玲， 姜秋慧

(鄭州人民醫(yī)院婦科， 河南 鄭州 450000)

目的： 觀察在不同卵巢組織中miRNA-22的表達(dá)，并研究上調(diào)miRNA-22表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3增殖、遷移與侵襲的影響。方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測不同卵巢組織樣本miRNA-22的表達(dá)；隨機(jī)將SKOV-3細(xì)胞分為正常對(duì)照組(control組)、空白載體組(miRNA-22-NC組)和轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic組(miRNA-22-m組)，qPCR檢測各組細(xì)胞miRNA-22的表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室法分別檢測細(xì)胞的遷移與侵襲能力，Western blot法檢測VEGF和P53蛋白表達(dá)。結(jié)果:卵巢癌組織中miRNA-22的水平顯著低于正常卵巢組織；與control組相比，miRNA-22-m組細(xì)胞miRNA-22的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)下降，VEGF和P53的蛋白表達(dá)水平顯著下降。結(jié)論:miRNA-22的低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。過表達(dá)miRNA-22能夠抑制卵巢癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)VEGF和P53的蛋白表達(dá)有關(guān)。

miRNA-22； 卵巢癌； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲

卵巢上皮性癌(簡稱卵巢癌)是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，死亡率極高，轉(zhuǎn)移快，侵襲能力強(qiáng)，復(fù)發(fā)性高，晚期患者五年生存率不及30%[1]。由于早期卵巢癌發(fā)病時(shí)無明顯癥狀，臨床上缺乏特異性高且敏感的診斷方法，70%以上的患者確診時(shí)已經(jīng)到達(dá)晚期[2]。

在人類癌癥中，miRNA的功能可根據(jù)靶基因的作用不同調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展，具有癌基因或抑癌基因的作用[3]。miRNA通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解，抑制蛋白質(zhì)翻譯[4]。miRNA-22在多種腫瘤中表達(dá)異常，研究表明，miRNA-22在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌組織中低表達(dá)，在白血病和前列腺癌中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬分析卵巢癌組織中miRNA-22的水平，并通過研究過表達(dá)miRNA-22對(duì)卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV-3增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討miRNA-22的表達(dá)是否能為卵巢癌的臨床治療具有指導(dǎo)意義。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV-3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；miRNA-22-mimic購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；VEGF、P53和β-actin抗體購自Santa Cruz。

2 實(shí)驗(yàn)樣本

組織樣本來自鄭州人民醫(yī)院2010年8月～2015年8月的正常卵巢組織40例，卵巢癌旁組織42例，卵巢癌卵巢組織41例，病例平均年齡(40.43±2.57)歲。各組織樣本均由本院病理學(xué)專家檢查并確認(rèn)，經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意。各樣本提取后立刻置于-80℃液氮中保存。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測miRNA-22 mRNA表達(dá)水平 嚴(yán)格按照TRIzol試劑說明書要求，提取相應(yīng)組織的總RNA，蛋白定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增， miRNA-22引物購于ABI PRISM。擴(kuò)增條件：93 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，73 ℃ 40 s，共34個(gè)循環(huán);72 ℃8 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對(duì)比，采用2-ΔΔCt對(duì)目標(biāo)基因miRNA-22的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將SKOV-3細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞融合約80%左右，進(jìn)行傳代。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(control組)、空白載體組(miRNA-22-NC組)和轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic組(miRNA-22-m組)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×105的密度接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育至約60%，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，更換含血清的正常生長培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。

3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 收集處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)整為細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)，加入48孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h、24 h、36 h和48 h后，分別取各階段的細(xì)胞，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，利用酶標(biāo)儀測定于450 nm波長處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值×100%。

3.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，以2×108/L接種于48孔板中，待細(xì)胞融合到80%～90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞遷移軌跡，記錄細(xì)胞影像數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)。

3.5 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 Transwell小室的上室加入50 μL稀釋的Matrigel，孵育1 h使凝固。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，吸盡培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，胰酶消化，制成密度為2×108/L的細(xì)胞懸液。上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，棉簽擦除上室上面的非侵襲細(xì)胞，另一面用5 mL甲醇/醋酸(3∶1)固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min，倒置于顯微鏡下觀察小室面的細(xì)胞個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6 免疫印跡法 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白后定量，調(diào)整蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，孵育相應(yīng)Ⅰ抗，4 ℃搖床過夜，室溫孵育相應(yīng)Ⅱ抗1 h， 化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的積分吸光度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組間均數(shù)比較時(shí)采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均在SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 正常卵巢組織、卵巢癌旁組織與卵巢癌卵巢組織miRNA-22的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，正常卵巢組織中miRNA-22的表達(dá)顯著高于卵巢癌卵巢組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卵巢癌旁組織與正常卵巢組織miRNA-22的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of miRNA-22 in normal ovarian tissues (40 cases), para-carcinoma tissues (42 cases) and ovarian cancer tissues (41 cases). Mean±SD.*P<0.05vsnormal ovarian tissue.

圖1 各卵巢組織中miRNA-22的表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后各組細(xì)胞miRNA-22的表達(dá)

轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后，miRNA-22-m組miRNA-22的表達(dá)顯著上升(P<0.05)，miRNA-22-NC組miRNA-22的表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，提示miRNA-22轉(zhuǎn)染成功，見圖2。

Figure 2.The expression of miRNA-22 after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

圖2 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后各組SKOV-3細(xì)胞miRNA-22的表達(dá)水平

3 過表達(dá)miRNA-22對(duì)SKOV-3細(xì)胞存活率的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，control組和miRNA-22-NC組的細(xì)胞存活率隨時(shí)間推移迅速增長，與control組相比，miRNA-22-m組的細(xì)胞存活率隨時(shí)間增長的幅度明顯減少(P<0.05),見圖3。

Figure 3.Survival rate of SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后各組SKOV-3細(xì)胞存活率變化

4 過表達(dá)miRNA-22對(duì)SKOV-3細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SKOV-3細(xì)胞的遷移能力，與control組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后，SKOV-3細(xì)胞的遷移速率顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control組和miRNA-22-NC之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

5 過表達(dá)miRNA-22對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后，SKOV-3細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control組和miRNA-22-NC之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

6 過表達(dá)miRNA-22對(duì)VEGF和P53蛋白表達(dá)的影響

Western blot法結(jié)果顯示，與control組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后，VEGF和P53的蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control組和miRNA-22-NC之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖6。

討 論

miRNA是長度約為22個(gè)堿基大小的非編碼RNA，通過抑制靶基因的功能或降解靶基因，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明miRNA參與多種復(fù)雜的生物過程，如胚胎發(fā)育、器官形成等。miRNA具有組織特異性，可以準(zhǔn)確地界定分化腫瘤[5]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-22具有抑癌基因的作用效果，對(duì)多種腫瘤具有調(diào)控作用。我們研究結(jié)果顯示，miRNA-22在卵巢癌卵巢組織中表達(dá)顯著低于正常卵巢組織，表明miRNA-22在卵巢組織的低表達(dá)提示有卵巢癌的可能性。miRNA-22通過轉(zhuǎn)錄后修飾ErbB3，抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299的增殖和侵襲能力[6]。此外，報(bào)道指出miRNA-22通過阻止雌激素信號(hào)通路來抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[3，7]，通過調(diào)控EVI-1癌基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[8]。miRNA-22通過抑制肝癌細(xì)胞的HDAC4基因，從而抑制HCC細(xì)胞系的增殖，通過抑制NF-κB的表達(dá)從而抑制肝癌生成[10]。我們研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-22后，SKOV-3細(xì)胞的存活率、遷移能力和侵襲能力降低，提示miRNA-22過表達(dá)具有抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。

Figure 4. The number of migratory SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后各組SKOV-3細(xì)胞遷移數(shù)變化

Figure 5. Invasive ability of SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后各組SKOV-3細(xì)胞侵襲能力變化

Figure 6.Protein expression of VEGF and P53 after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖6 轉(zhuǎn)染miRNA-22-mimic后VEGF和P53蛋白表達(dá)變化

VEGF是高度特異的血管生長因子，能夠增加血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，進(jìn)一步促進(jìn)血管的形成[11]，另一方面增加血管通透性導(dǎo)致腫瘤患者形成腹水。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[12]，測定血清中VEGF的含量水平有助于斷定卵巢腫瘤的良性與惡性。國內(nèi)報(bào)道指出卵巢上皮性癌組織中VEGF呈高表達(dá)，惡化速度快，在腫瘤發(fā)生后迅速進(jìn)入晚期，生存率低[13]。P53基因野生型為抑癌基因，對(duì)細(xì)胞生長具有抑制作用，突變型具有致癌的活性，是腫瘤形成的原因之一。報(bào)道指出卵巢上皮性癌中P53突變型達(dá)到44%～62%[14-15]。我們研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-22后，SKOV-3細(xì)胞的VEGF和P53蛋白表達(dá)顯著降低，提示過表達(dá)miRNA-22后，可能與VEGF和P53的3’端UTR結(jié)合，從而促進(jìn)VEGF和P53的降解，從而抑制癌癥細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，從而具有抑制卵巢癌的作用。當(dāng)然，進(jìn)一步具體的詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

本研究表明，miRNA-22的表達(dá)對(duì)卵巢癌的診斷具有提示作用，在指導(dǎo)臨床治療方面具有重要意義。

[1] Sankaranarayanan R, Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological cancer: the size of the problem[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2006, 20(2): 207-225.

[2] Liu CG, Calin GA, Meloon B, et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(26):9740-9744.

[3] Xiong J, Yu D, Wei N, et al. An estrogen receptor alpha suppressor, microRNA-22, is downregulated in estrogen receptor alpha-positive human breast cancer cell lines and clinical samples[J]. FEBS J, 2010, 277(7):1684-1694.

[4] Farazi TA, Spitzer JI, Morozov P, et al. miRNAs in human cancer[J]. J Pathol, 2011, 223(2):102-115.

[5] Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers[J]. Nature, 2005, 435(7043): 834-838.

[6] Ling B, Wang GX, Long G, et al. Tumor suppressor miR-22 suppresses lung cancer cell progression through post-transcriptional regulation of ErbB3[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138(8):1355-1361.

[7] Pandey DP, Picard D. miR-22 inhibits estrogen signaling by directly targeting the estrogen receptor alpha mRNA[J]. Mol Cell Biol, 2009, 29(13): 3783-3790.

[8] Patel JB, Appaiah HN, Burnett RM, et al. Control of EVI-1 oncogene expression in metastatic breast cancer cells through microRNA miR-22[J]. Oncogene, 2011, 30(11):1290-1301.

[9] Takata A, Otsuka M, Kojima K, et al. MicroRNA-22 and microRNA-140 suppress NF-κB activity by regulating the expression of NF-κB coactivators[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 411(4):826-831.

[10]殷建瑞, 張 波, 譚麗華, 等.丁苯酞對(duì)缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和HIF-1α表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志, 2011, 27(4):643-647.

[11]Cooper BC, Ritchie JM, Broghammer CL, et al. Preope-rative serum vascular endothelial growth factor levels: significance in ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(10):3193-3197.

[12]申桂華, 張 毅.卵巢上皮性癌中p53和VEGF表達(dá)的相互關(guān)系及其臨床意義[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2006, 13(3)：209-211.

[13]Fallow S, Price J, Atkinson RJ, et al. p53 mutation does not affect prognosis in ovarian epithelial malignancies[J]. J Pathol, 2001, 194(1):68-75.

[14]陳 默, 殷嘯俊, 堯良清, 等. 缺氧誘導(dǎo)上皮卵巢癌細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國病理生理雜志,2011, 27(5)：848-852.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression of miRNA-22 in ovarian cancer and effect of miRNA-22 over-expression on SKOV-3 ovarian cancer cell proliferation, migration and invasion

LI Feng, YAO Li, ZHANG Xi-hong, XIA Yu-hong, CHENG Jie, LOU Xue-ling, JIANG Qiu-hui

(DepartmentofGynaecology,ZhengzhouPeople’sHospital,Zhengzhou450000,China.E-mail:lifeng198104@163.com)

AIM: To examine the expression of miRNA-22 in the ovarian tissues and the effect of miRNA-22 over-expression on the proliferation, migration and invasion in SKOV-3 cells. METHODS: The expression levels of miRNA-22 in different ovarian tissues and SKOV-3 cells were determined by qPCR. miRNA-22 was over-expressed by transfection of miRNA-22 mimic. The cell viability was examined by CCK-8 assay. The cell migration was measured by wound healing test. The cell invasion was analyzed by Transwell assay. The protein expression levels of VEGF and P53 were determined by Western blot. RESULTS: Compared with the normal ovarian tissue, the expression level of miRNA-22 was remarkably decreased in the ovarian tumor tissues. After transfection with miRNA-22 mimic, the expression level of miRNA-22 in the SKOV-3 cells was significantly increased, while the cell viability, migration and invasion were obviously decreased. Moreover, the protein expression of VEGF and P53 was dramatically inhibited after over-expression of miRNA-22. CONCLUSION: The decreased miRNA-22 expression may be correlated with the development of ovarian can-cer. Over-expression of miRNA-22 decreases the cell viability, migration and invasion by reducing the protein expression of VEGF and P53.

miRNA-22; Ovarian cancer; Cell proliferation; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2016)12- 2251- 05

2016- 05- 23

2016- 09- 26

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.021

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△通訊作者 Tel: 0371-67077037; E-mail: lifeng 198104@163.com