梁 敏， 陳 欣

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)危重醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310018； 2杭州市腫瘤醫(yī)院ICU，浙江 杭州 310002)

熊果酸通過調(diào)節(jié)miRNA-133a抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲

梁 敏1△， 陳 欣2

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)危重醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310018；2杭州市腫瘤醫(yī)院ICU，浙江 杭州 310002)

目的： 探討熊果酸(ursolic acid，UA)是否通過調(diào)節(jié)miRNA-133a影響肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力。方法:MTT法檢測細胞活力；real-time PCR法檢測UA干預(yù)和轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics及inhibitor后細胞中miRNA-133a的表達；劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力；Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力。結(jié)果:UA可顯著抑制肺癌A549細胞的活力(P<0.05)，隨著給藥劑量的增加，UA對肺癌細胞的生長抑制率顯著上升，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，UA作用于肺癌A549細胞24 h后的IC50為31.04 μmol/L。在不同濃度的UA作用下，肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力也受到明顯抑制(P<0.01)。Real-time PCR實驗結(jié)果顯示，在10、20 μmol/L UA作用24 h后，A549細胞內(nèi)miRNA-133a的表達顯著高于溶劑對照組(P<0.01)；細胞瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics后可上調(diào)A549細胞中miRNA-133a的表達，而轉(zhuǎn)染miRNA-133a inhibitor后下調(diào)A549細胞中miRNA-133a的表達(P<0.01)。 肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics后，細胞活力、遷移和侵襲能力也受到明顯抑制(P<0.01)；相反，轉(zhuǎn)染miRNA-133a inhibitor后，細胞活力、遷移和侵襲能力明顯增強(P<0.01)。結(jié)論:UA能抑制肺癌A549細胞活力、遷移和侵襲，其作用機制可能是通過上調(diào)miRNA-133a介導(dǎo)來實現(xiàn)的。

熊果酸; miRNA-133a; 細胞遷移; 細胞侵襲

熊果酸(ursolic acid，UA)是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，最近研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸能抑制多種腫瘤細胞的生長，包括乳腺癌、肺癌、白血病、肝癌、結(jié)腸癌、皮膚癌等[1]。目前，肺癌已成為我國發(fā)病率最高的癌癥之一，在肺癌的許多分類中，非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%，而且侵襲和轉(zhuǎn)移是其死亡最常見的原因[2]。miRNA 是一類機體內(nèi)源性表達的非編碼小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，從而影響多種生物學(xué)過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡、發(fā)育等。越來越多的研究報道表明，miRNA與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。如Lin等[3]發(fā)現(xiàn)miR-154能通過靶向ZEB2抑制非小細胞肺癌的遷移和侵襲；Lai等[4]報道m(xù)iR-133a能抑制胃癌的增殖、遷移和誘導(dǎo)凋亡；Liao等[5]研究發(fā)現(xiàn)在H-1299細胞中苦參堿能通過調(diào)節(jié)miR-133a的表達，從而抑制細胞的遷移和侵襲。文獻已報道熊果酸能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。但其機制是否與肺癌A549細胞內(nèi)的miR-133a有關(guān)，尚無文獻報道。因此，本研究觀察熊果酸是否通過調(diào)節(jié)miR-133a影響肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平為熊果酸治療肺癌提供可能的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

UA和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；Has-miR-133a mimics和inhibitor引物序列購自上海吉瑪公司；非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于碧云天生物公司；胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco；Lipofectamine 2000購自Invitrogen。iMARK型全自動酶標(biāo)儀、分光光度計和熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；倒置熒光顯微鏡(Leica)。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長良好，每3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 細胞的瞬時轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，接種適量的細胞于不含抗生素的培養(yǎng)基中，根據(jù)脂質(zhì)體Lipo2000的說明書進行細胞的轉(zhuǎn)染。分別用適量的Opti-MEM無血清培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和miR-133a mimics和inhibitor，室溫孵育5 min后混合，靜置20 min，將混合液加入到每孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板混勻液體。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)籍中，待6 h后替換為原培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，加入不同濃度的UA(5、10、20、30和40 μmol/L)，以DMSO溶劑組為對照組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)；對于miRNA-133a mimics和inhibitor細胞瞬時轉(zhuǎn)染，按上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。最后，吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每個濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，重復(fù)實驗3次。

2.4 Real-time PCR檢測miR-133a的表達 各組A549細胞經(jīng)UA處理和細胞瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics和inhibitor后，按照TRIzol說明書中步驟抽提細胞總RNA，按miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄試劑，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將合成的cDNA按real-time PCR說明書配制反應(yīng)體系，所有反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)步驟為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。反應(yīng)以U6為內(nèi)參照。miRNA-133a 引物序列為5’-TTTGGTCCCCTTCAACCAGC-3’。記錄每個反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值，實驗結(jié)果采用相對定量法進行分析，以2-ΔΔCt表示。

2.5 劃痕愈合實驗 將A549細胞接種6孔板，待細胞鋪滿孔底，用10 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS清洗3次，加入含有2.5%低血清的新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。然后加入不同濃度的UA及轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics和inhibitor，24 h后繼續(xù)拍照，在相同觀察點測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.6 Transwell小室實驗 取對數(shù)生長期A549細胞，消化細胞于無血清培養(yǎng)基，制成8×107/L密度的細胞懸液，在Transwell 小室的上室中加入含有不同濃度UA及轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics和inhibitor的細胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細胞，甲醇固定10 min，0.1% 結(jié)晶紫染色40 min。100倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熊果酸抑制肺癌A549細胞的活力

隨著給藥劑量的增加，UA對肺癌細胞的生長抑制率顯著上升，且呈一定的劑量依賴關(guān)系，在給藥24 h后，UA的IC50為31.04 μmol/L。結(jié)果表明UA可以顯著抑制肺癌A549細胞的活力，見圖1。

Figure 1.The effect of ursolic acid on cell viability in different groups after 24 h treatment. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1 不同濃度的熊果酸對肺癌A549細胞活力的影響

2 熊果酸抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示:與溶劑對照DMSO組相比，在5、10和20 μmol/L濃度的UA作用24 h后，劃痕愈合率呈現(xiàn)不同程度地降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Transwell小室實驗結(jié)果顯示：與溶劑對照DMSO組相比，5、10和20 μmol/L的UA作用組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)分別為332±10、296±8和262±10，明顯低于溶劑對照組(373±10)。這些結(jié)果表明UA可以顯著抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲,見圖2。

3 熊果酸上調(diào)肺癌A549細胞miRNA-133a的表達

如圖3所示，與溶劑對照DMSO組相比，在5 μmol/L的UA作用24 h后A549細胞的miRNA-133a表達的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。在10、20 μmol/L的UA作用24 h后，A549細胞的miRNA-133a表達顯著高于溶劑DMSO對照組，表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明UA能上調(diào)A549細胞內(nèi)miRNA-133a的表達。

Figure 2.The effect of ursolic acid on the migratory and invasive abilities of A549 cells (×100). A: the result of wound healing assay; B: the result of Transwell assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2 劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測熊果酸對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 3.The expression of miRNA-133a in the lung cancer A549 cells after treated with ursolic acid. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3 定量PCR方法檢測熊果酸作用后A549細胞內(nèi)mi-RNA-133a表達量的變化

4 miRNA-133a在肺癌A549細胞中轉(zhuǎn)染效率的測定

與轉(zhuǎn)染的陰性對照(negative control, NC)組相比，肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics 48 h后，細胞中miRNA-133a的表達水平是陰性對照組的(2.12±0.11)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miRNA-133a inhibitor 48 h后，與NC組相比，可明顯抑制細胞中miRNA-133a的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這說明肺癌A549細胞瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics后可顯著提高細胞中miRNA-133a的表達，而inhibitor可顯著抑制細胞中miRNA-133a的表達，見圖4。

5 miRNA-133a對肺癌A549細胞活力的影響

miRNA-133a轉(zhuǎn)染肺癌A549細胞48 h后，與NC組相比，miRNA-133a mimics能明顯抑制A549的細胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相反，與NC組相比，miRNA-133a inhibitor能明顯增加A549的細胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這說明上調(diào)miRNA-133a表達后能明顯抑制肺癌A549細胞的活力，而下調(diào)miRNA-133a表達后能明顯增加A549細胞活力，見圖5。

Figure 4.The expression of miRNA-133a in the lung cancer A549 cells after transfected with miRNA-133a mimics or inhibitor. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖4 定量PCR方法檢測瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-133a mimics或inhibitor后A549細胞中miRNA-133a表達量的變化

Figure 5.The viability of lung cancer A549 cells after transfection with miRNA-133a mimics or inhibitor detected by MTT assay. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖5 MTT 法檢測 miRNA-133a mimics或inhibitor對肺癌 A549 細胞活力的影響

6 miRNA-133a對肺癌A549細胞遷移和侵襲的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示:miRNA-133a mimics組的劃痕愈合率較NC組明顯下降，而miRNA-133a inhibitor組的劃痕愈合率較NC組明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Transwell小室實驗結(jié)果顯示:miRNA-133a mimics組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)較NC組明顯減少，而miRNA-133a inhibitor組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)較NC組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

討 論

肺癌是當(dāng)今全球危害性最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因[7]。盡管治療腫瘤的方法不斷發(fā)展與更新，新的抗腫瘤藥物層出不窮，但肺癌患者長期生存率并沒有明顯提高[8]。因此尋找一種抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法和策略已成為醫(yī)藥界的一個重要課題。熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物[9]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸具有抗炎、抗微生物、降血糖、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗?jié)?、抗腫瘤等多種藥理作用，具有極其重要的研究價值和應(yīng)用前景[10]。

miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的長度約為22個核昔酸的非編碼單鏈小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用生物芯片技術(shù)，在多種腫瘤組織中篩選出表達異常miRNA，并對其功能和作用靶點進行了一系列的研究。miRNA-133a是近年來研究比較集中的miRNA之一。最近的研究表明，miRNA-133a通過對靶基因的調(diào)控參與了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程，如miRNA-150-5p和miRNA-133a抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移通過靶向膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1[11]；miRNA-133a通過影響靶基因IGF-1R抑制了骨肉瘤細胞增殖和侵襲[12]；miRNA-133a可通過fascin 1抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲[13]。

Figure 6.The effect of miRNA-133a mimics or inhibitor on the migratory and invasive abilities of the A549 cells (×100). A: the results of wound healing assay; B: the results of Transwell assay. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖6 劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測miRNA-133a mimics或inhibitor對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響

文獻表明，熊果酸具有非常廣泛的轉(zhuǎn)錄抑制活性。Wang等[14]體外實驗表明，熊果酸能下調(diào)三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(adenosine triphosphate-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2)的表達，從而抑制卵巢癌細胞的增殖和逆轉(zhuǎn)耐藥。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)熊果酸在肺癌細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用靶向于牛痘苗相關(guān)激酶1(vaccinia-related kinase 1，VRK1)。Li等[16]報道熊果酸在誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，ROCK/PTEN信號通路起了關(guān)鍵作用。Wang等[17]的研究表明熊果酸抑制結(jié)腸癌細胞的生長通過STAT3信號通路。然而，熊果酸是否能夠抑制人RNA 組中另外一個重要組成部分miRNA的轉(zhuǎn)錄，遺憾的是國內(nèi)外關(guān)于這個問題的研究報道較少。熊果酸抑制肺癌細胞的遷移和侵襲是否通過調(diào)控miRNA分子來實現(xiàn)，我們在本實驗中進行了初步探討。在本研究中，熊果酸可以顯著抑制肺癌A549細胞的增殖，其抑制率呈一定的劑量依賴關(guān)系，同時熊果酸也能抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力。Real-time PCR結(jié)果顯示，經(jīng)熊果酸作用后，肺癌A549細胞miRNA-133a表達量顯著升高。因此，我們猜測熊果酸抑制肺癌的增殖、遷移和侵襲極有可能是通過上調(diào)miRNA-133a發(fā)揮抗腫瘤的作用。為了驗證我們的猜想，我們在肺癌A549細胞中轉(zhuǎn)染了miRNA-133a的模擬物和抑制物，結(jié)果顯示miRNA-133a的模擬物能抑制肺癌細胞的活力、遷移和侵襲，而miRNA-133a的抑制物能促進肺癌細胞的活力、遷移和侵襲。

綜上所述，本實驗初步研究表明熊果酸作為一種天然存在的化合物能明顯抑制肺癌A549細胞的活力、遷移和侵襲，其作用機制可能是通過上調(diào)miRNA-133a表達來發(fā)揮抗遷移和侵襲的作用，為熊果酸應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Ursolic acid inhibits migration and invasion of human lung cancer A549 cells by targeting mi

RNA-133aLIANG Min1, CHEN Xin2

(1DepartmentofIntensiveCareUnit,XiashaCampus,SirRunRunShawHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310018,China;2DepartmentofIntensiveCareUnit,HangzhouTumorHospital,Hangzhou310002,China.E-mail:minl012@163.com)

AIM: To investigate the effects of ursolic acid (UA) on the migration and invasion of human lung cancer cell line A549, and to explore its mechanism. METHODS: The cell viability was detected by MTT assay. The expression of miRNA-133a was detected in the A549 cells treated with UA by real-time PCR. The miRNA-133a mimics and inhibitor were transfected into the A549 cells, and the transfection efficiency was analyzed by real-time PCR. The cell migratory and invasive abilities were determined by wound healing and Transwell methods, respectively. RESULTS: The viability of the human lung cancer A549 cells was significantly inhibited by UA in a dose-dependent manner (P<0.05). IC50of UA (24 h) for lung cancer A549 cells was 31.04 μmol/L. UA treatment significantly inhibited the migratory and invasive abilities of A549 cells in a concentration-dependent manner, accompanied by significantly elevation of miRNA-133a expression. The mimics and inhibitor of miRNA-133a significantly upregulated and downregulated the expression of miRNA-133a in the transfected A549 cells, respectively. In addition, the viability of the A549 cells was decreased extremely after tansfected with the miRNA-133a mimics (P<0.01), so did the results of the cell migration and invasion test. The A549 cells tansfected with the miRNA-133a inhibitor showed an opposite changes of the cell viability, migration and invasion. CONCLUSION: UA inhibited the viability, migration and invasion of lung cancer A549 cells by elevating the expression of miRNA-133a.

Ursolic acid; miRNA-133a; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2016)12- 2239- 06

2016- 08- 30

2016- 00- 00

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.019

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△通訊作者 Tel: 0571-87887109; E-mail: minl012@163.com