蘇 華， 謝睿彬， 羅高湖， 張 彤， 凃 鈴

(1賀州市人民醫(yī)院心血管二科，廣西 賀州 542899； 2華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430000)

蛻皮甾酮減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損傷*

蘇 華1△， 謝睿彬1， 羅高湖1， 張 彤1， 凃 鈴2

(1賀州市人民醫(yī)院心血管二科，廣西 賀州 542899；2華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430000)

目的： 研究蛻皮甾酮對心肌細胞氧化損傷的作用。方法：H9c2細胞常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)過氧化氫(H2O2)處理后建立損傷模型，分為:對照組，蛻皮甾酮高劑量(2 μmol/L)、中劑量(1.5 μmol/L)和低劑量(1 μmol/L)組，H2O2組。CCK-8法檢測蛻皮甾酮對H9c2細胞活力的影響；流式細胞術(shù)檢測H9c2細胞的凋亡率；用分光光度法檢測乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶的活性以及丙二醛、超氧化物歧化酶含量；激光共聚焦聯(lián)合流式細胞術(shù)觀察細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生和線粒體膜電位的變化；用Western blot法檢測H9c2細胞內(nèi)Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白水平。結(jié)果：在所選濃度范圍內(nèi)，蛻皮甾酮對H9c2細胞的活力無明顯影響。與對照組比較，H2O2組H9c2細胞的LDH、CK-MB、ROS、MDA 及凋亡率明顯增加，通過不同濃度的蛻皮甾酮作用后，H9c2細胞的LDH、CK-MB、ROS、MDA 及凋亡率顯著下降，與H2O2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。與對照組比較，H2O2組H9c2細胞的SOD和線粒體膜電位明顯下降；與H2O2組比較，蛻皮甾酮高、中、低劑量組H9c2細胞的SOD和線粒體膜電位明顯提高。對比對照組，H2O2組中H9c2細胞Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平明顯升高，Bcl-2的表達水平明顯下降；與H2O2組比較，蛻皮甾酮高、中、低劑量組中H9c2心肌細胞表達Bcl-2蛋白上升， Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平下降。結(jié)論：蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激條件下的H9c2細胞具有保護功能，其機制可能和減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物，增強抗氧化酶功能，調(diào)節(jié)線粒體功能和抑制細胞凋亡相關(guān)。

蛻皮甾酮； H9c2細胞； 氧化應(yīng)激； 細胞凋亡

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔變窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟疾患。隨著溶栓、動脈搭橋術(shù)等技術(shù)的應(yīng)用，缺血再灌注損傷備受關(guān)注[1]。氧化應(yīng)激損傷或者來自缺血組織再灌注，或由于長期缺氧條件下過量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[2]。過量的 ROS 會損傷心肌細胞，破壞心肌組織。所以，盡可能縮小缺血再灌注時間的同時，積極尋找抗氧化應(yīng)激損傷的藥物尤為重要。蛻皮甾酮(ecdysterone，EDS)是中藥牛膝中主要活性成分之一[3]，目前已證實其有多種藥理活性[4-5]。本研究觀察了蛻皮甾酮在氧化應(yīng)激損傷條件下對H9c2心肌細胞凋亡、線粒體功能及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響，探討其減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

H9c2心肌細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和小牛血清(Gibco)；蛻皮甾酮(中國藥品生物制品檢定所)；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及肌酸激酶同工酶 (MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ROS探針DCFH-DA(Invitrogen)；JC-1 試劑(Enzo Life Sciences)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；抗Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3抗體(Cell Signal Technology)；辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG抗體和辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標記的β-actin抗體(上海興悠生物科技有限公司)；ECL試劑盒(Amersham Biosciences)。Multiskan MS-353型分光光度儀(Labsystems)；3111型細胞培養(yǎng)箱(Thermo)；BD FACSCanto II型流式細胞儀(BD FACScan)。

2 方法

2.1 H9c2細胞的培養(yǎng)和氧化應(yīng)激模型的建立 常規(guī)培養(yǎng)H9c2細胞，密度達80%～90%后用于研究。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)用無血清 DMEM 稀釋，并制備為200 μmol/L 處理溶液，處理H9c2細胞6 h建立氧化應(yīng)激模型。二甲基亞砜(DMSO)稀釋制備蛻皮甾酮工作溶液，低中高濃度依次為1.0、1.5、2.0 μmol/L，于H2O2干預(yù)前2 h分別處理H9c2細胞。

2.2 分組及處理 對照組：正常細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，實驗前換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；H2O2組：H2O2干預(yù)前，換無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞12 h，再加入200 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)6 h；蛻皮甾酮高、中、低劑量組(2、1.5、1 μmol/L EDS+200 μmol/L H2O2組)：于H2O2干預(yù)前2 h加入高、中、低劑量蛻皮甾酮處理，余同H2O2組。

2.3 不同濃度蛻皮甾酮對H9c2細胞存活率的影響 實驗分為正常對照組、蛻皮甾酮1 μmol/L組、蛻皮甾酮1.5 μmol/L組和蛻皮甾酮2 μmol/L組、培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8 10 μL，待培養(yǎng)液顯色后用酶標儀檢測各孔450 nm 波長的吸光度(absorbance，A)，以細胞的存活率表示細胞的活力。

2.4 LDH、CK-MB、MDA和SOD水平的檢測 嚴格按照LDH和CK-MB試劑盒說明書進行操作，應(yīng)用分光光度計測量各組A值，檢測各組上清中LDH和CK-MB水平。分組處理后取各組細胞，裂解，離心，取上清液，嚴格根據(jù)SOD和 MDA試劑盒說明書進行操作，各組細胞內(nèi)SOD 和 MDA水平應(yīng)用分光光度計測A值，各組培養(yǎng)液蛋白濃度用BCA蛋白濃度試劑盒測定。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)的ROS水平、細胞凋亡率和線粒體膜電位 分組，處理同2.2。干預(yù)后，洗滌，消化，收集，重懸細胞，各組加入ROS探針DCFH-DA 10 μmol/L，孵育60 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，消化后收集細胞，重懸細胞，上流式細胞儀觀察，記錄平均熒光值。細胞干預(yù)后，經(jīng)洗滌，消化，收集，重懸細胞，各組加入Annexin V和PI，混勻，避光靜置15 min，重懸細胞，上流式細胞儀測定凋亡率。分組，細胞干預(yù)后，經(jīng)洗滌，消化，收集，重懸細胞，加入JC-1探針 10 mg/L，孵育20 min，重懸細胞，上流式細胞儀觀察線粒體膜電位變化。

2.6 Western blot法檢測蛋白水平 分組，處理同2.2，收集細胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉；PBS洗膜后加入 I 抗，4 ℃過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗孵育0.5 h；洗膜；用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。結(jié)果掃描后，圖像分析軟件分析光密度，β-actin為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度H2O2對 H9c2心肌細胞存活率的影響

與對照組存活率(100.39±2.15)%比較，50、100、200和400 μmol/L 的H2O2處理心肌細胞6 h后存活率分別為(93.08±1.92)%、(72.52±2.85)%、(53.51±3.02)%和(34.95±3.22)%，可見隨著H2O2濃度的升高，細胞存活率降低 (P<0.05)，200 μmol/L濃度的H2O2能夠體現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，又能保證適當(dāng)?shù)募毎盍?，因此選擇200 μmol/L 濃度的H2O2作為建立氧化應(yīng)激模型的工作劑量。

2 蛻皮甾酮對H9c2心肌細胞的細胞毒性

實驗中將H9c2細胞分別用1、1.5、2、4和8 μmol/L的蛻皮甾酮處理， 培養(yǎng)24 h后檢測細胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1、1.5和2 μmol/L蛻皮甾酮對存活率無明顯影響，其存活率分別為(97.53±1.12)%、(97.19±1.39)%和(96.85±1.70)%。 當(dāng)蛻皮甾酮濃度為4和8 μmol/L時， 比較對照組，細胞存活率顯著下降 (P<0.01)，存活率分別為(91.53±1.62)%和(82.69±2.51)%。因此選定蛻皮甾酮的工作濃度為1、1.5和2 μmol/L。

3 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下LDH和CK-MB 活性的影響

與對照組比較，H2O2組上清中LDH和CK-MB的水平明顯增高(P<0.01)。 與H2O2組比較，高、中、低劑量EDS+H2O2組上清中LDH 和CK-MB的活性均顯著下降(P<0.01)，見表1。

4 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞內(nèi)SOD和MDA的影響

比較對照組，H2O2組 H9c2細胞中MDA水平顯著增高，同時SOD水平顯著減少(P<0.01)。 與H2O2組比較，低、中、高劑量EDS+H2O2組能夠明顯降低氧化應(yīng)激損傷引起H9c2細胞中MDA水平的升高(P<0.01)，且能夠提高細胞中的SOD水平(P<0.01)，見表1。

表1 各組H9c2細胞LDH、CK-MB、SOD和MDA水平的變化

H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

5 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下線粒體膜電位、細胞ROS水平及細胞凋亡的影響

與對照組比較，H2O2組 ROS的熒光增強，提示H2O2作用下ROS生成增加；與H2O2組比較，低、中、高劑量EDS+H2O2組的ROS熒光減弱，提示蛻皮甾酮可減少氧化應(yīng)激損傷條件下ROS的生成(P<0.01)，見圖1。

與對照組比較，H2O2組H9c2細胞的線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)。與H2O2組比較,低、中、高劑量EDS+H2O2組能夠明顯升高H9c2 心肌細胞中線粒體膜電位(P<0.01),見圖2。

H2O2組的細胞凋亡率為(31.26±0.52)%，明顯高于對照組的(7.03±0.29)% (P<0.01)；與H2O2組比較，低、中和高劑量EDS+H2O2組的細胞凋亡率分別為(26.11±0.27)%、(19.91±0.31)%和(12.55±0.26)%，提示蛻皮甾酮可減少氧化應(yīng)激損傷條件下的細胞凋亡(P<0.01)，見圖3。

Figure 1.The effect of ecdysterone (EDS) on intracellular ROS level of H9c2 cardiomyocytes injured by oxidative stress. H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

圖1 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞ROS水平的影響

Figure 2.The effect of ecdysterone (EDS) on mitochondrial membrane potential of H9c2 cardiomyocytes injured by oxidative stress (×400). H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

圖2 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞線粒體膜電位的影響

Figure 3.The effect of ecdysterone (EDS) on oxidative stress-induced apoptosis of H9c2 cells. H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

圖3 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞凋亡的影響

6 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

如圖4、表2所示，與對照組比較，H2O2組H9c2心肌細胞的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著增高(P<0.01)；與H2O2組比較，低、中、高劑量EDS+H2O2組H9c2心肌細胞的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平逐漸降低，且3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。與對照組比較，H2O2組H9c2細胞Bcl-2的蛋白表達顯著下降(P<0.01)；與H2O2組比較，低、中、高劑量EDS+H2O2組H9c2心肌細胞Bcl-2蛋白表達逐漸增高，3組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

中藥牛膝來源于莧科植物牛膝的干燥根[6]，具有補肝腎、抗衰老的作用[7-8]。蛻皮甾酮是中藥牛膝的有效單體，具有抗氧化損傷的作用[9]，通過對蛻皮甾酮各組對H9c2細胞活力的檢測，結(jié)果說明在一定濃度范圍內(nèi)，蛻皮甾酮對心肌細胞生長無明顯毒性。

Figure 4.The effect of ecdysterone (EDS) on expression of Bax, Bcl-2, and cleaved caspase-3 of H9c2 cardiomyocytes injured by oxidative stress. H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS.

圖4 蛻皮甾酮對氧化應(yīng)激損傷條件下細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表2 各組H9c2細胞Bax、Bcl-2 和 cleaved caspase-3蛋白水平的變化

H-EDS: high dose of EDS; M-EDS: middle dose of EDS; L-EDS: low dose of EDS.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

氧化應(yīng)激在冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程中，發(fā)揮非常重要的作用[10]。氧化應(yīng)激的產(chǎn)物ROS 的作用是多方面的，正常范圍內(nèi)ROS 是線粒體呼吸作用的副產(chǎn)物[11]，參與維持細胞正常機能與氧化還原狀態(tài)[12]。但同時，ROS 又在心肌細胞的氧化應(yīng)激損傷中扮演重要角色。過量的ROS 會損傷心肌細胞，加重心肌組織的損傷[13]。ROS 和 MDA 是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，它們反映了細胞受自由基損傷的水平[14]。H2O2處理導(dǎo)致心肌細胞ROS和MDA增加，SOD降低。蛻皮甾酮能夠減輕H2O2組H9c2 細胞的氧化應(yīng)激損傷，抑制心肌細胞內(nèi)ROS和 MDA產(chǎn)生，改善細胞內(nèi)SOD水平。說明蛻皮甾酮具有對抗H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷作用。

LDH和CK-MB 為心肌細胞損傷的重要生物標志物。本研究檢測了細胞培養(yǎng)液中LDH和CK-MB的水平。 結(jié)果顯示，蛻皮甾酮能夠明顯降低氧化應(yīng)激條件下H9c2心肌細胞LDH和CK-MB的水平，表明蛻皮甾酮能夠減輕氧化應(yīng)激條件下心肌細胞的損傷，具有保護心肌細胞的作用。

心肌細胞的凋亡是心肌損傷的原因之一。過量的ROS可以損傷線粒體[15]，造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，引起線粒體凋亡通路活化，并導(dǎo)致細胞凋亡。此外，Bax/Bcl-2的比例失衡會導(dǎo)致細胞線粒體膜電位改變，細胞色素釋放，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[16-17]。通過細胞凋亡檢測，在H9c2細胞給予H2O2處理后，細胞凋亡率明顯上升，促進線粒體膜電位去極化，Bcl-2 的表達下調(diào)與Bax 表達上調(diào)，caspase-3活化。說明H2O2處理可以誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生凋亡。在給予蛻皮甾酮處理后，H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡下降，且呈濃度依賴性，進而證實蛻皮甾酮能夠作用于心肌細胞的線粒體凋亡途徑，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。以上研究為蛻皮甾酮防治心血管疾病提供了一定的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effect of ecdysterone on H9c2 cells against oxidative stress

SU Hua1, XIE Rui-bin1, LUO Gao-hu1, ZHANG Tong1, TU Ling2

(1SecondDepartmentofCardiovascularMedicine,HezhouPeople’sHospital,Hezhou542899,China;2DepartmentofGeneralInternalMedicine,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430000,China.E-mail:suhuahz@yeah.net)

AIM: To investigate the effect of ecdysterone (EDS) on H9c2 cardiomyocytes after oxidative stress. METHODS: H9c2 cells were culturedinvitroand divided into control group, high dose (2 μmol/L) of EDS group, middle dose (1.5 μmol/L) of EDS group, low dose (1 μmol/L) of EDS group, and H2O2group. H9c2 cardiomyocytes in H2O2group and high, middle and low doses of EDS groups were exposed to H2O2for 6 h to establish the model of oxidative stress. The viability of the H9c2 cells was detected by CCK-8 assay. The apoptosis of H9c2 cells was analyzed by flow cytometry. The levels of lactate dehydogenase (LDH) and creatine kinase-MB (CK-MB) in the culture medium, and the levels of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the H9c2 cells were measured by colorimetry. The generation of reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy. The protein levels of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in the H9c2 cells were determined by Western blot. RESULTS: Ecdysterone at the selected concentrations had no effect on the viability of H9c2 cells. Compared with control group, the levels of LDH, CK-MB, ROS and MDA, and the apoptotic rates of the H9c2 cells were significantly increased after treated with H2O2, but were decreased by EDS treatment in a dose-dependent manner. The levels of SOD and mitochondrial membrane potential of the H9c2 cells in H2O2group were reduced significantly compared with control group, but high, middle and low doses of EDS treatments up-regulated the levels of SOD and mitochondrial membrane potential in H2O2-treated H9c2 cells. The protein levels of Bax and cleaved caspase-3 in the H9c2 cells in H2O2group showed significant elevation in comparison with control group, and the protein expression of Bcl-2 declined in H2O2group compared with control group, but high, middle and low doses of ecdysterone treatments down-regulated the protein levels of Bax, cleaved caspase-3 and up-regulated the expression of Bcl-2 in H2O2-treated H9c2 cells. CONCLUSION: Ecdysterone attenuates the effect of H2O2-induced oxidative stress on H9c2 cardiomyocytes. The mechanism may be involved in scavenging oxidative stress products, increasing antioxidant enzyme activity and improving mitochondrial function.

Ecdysterone; H9c2 cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2016)12- 2222- 06

2016- 06- 24

2016- 09- 05

湖北省衛(wèi)生計生委員會西醫(yī)一般項目(No. WJ2015-MB-006)

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.016

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