劉 培， 安勝軍， 邵鐵梅

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院，河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發(fā)應用技術研發(fā)中心，河北 石家莊 050026)

血管緊張素II對血管外膜成纖維細胞亞群轉化的影響*

劉 培， 安勝軍△， 邵鐵梅

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術學院，河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發(fā)應用技術研發(fā)中心，河北 石家莊 050026)

目的： 探討血管緊張素II(Ang II)對大鼠胸主動脈血管外膜成纖維細胞亞群轉化的影響。方法:采用克隆環(huán)法進行血管外膜成纖維細胞的單克隆培養(yǎng)，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫熒光染色方法鑒定細胞純度；隨機分為對照組和Ang II(10～1 000 nmol/L)組，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)、免疫熒光染色和Western blot法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達情況。結果:克隆環(huán)法獲得血管外膜成纖維細胞2個亞群:圓形細胞亞群和紡錘形細胞亞群。自分型后，從第3代至第8代，紡錘形細胞亞群的α-SMA表達量有減少趨勢，而圓形細胞亞群的α-SMA表達量顯著增多。在Ang II誘導下，紡錘形細胞亞群和圓形細胞亞群的α-SMA表達量均增多，且圓形細胞亞群隨Ang II濃度(10～1 000 nmol/L)的增加，α-SMA的表達量顯著增多(P<0.01)。Western blot實驗結果顯示，Ang II能刺激圓形細胞亞群更多地轉化為肌成纖維細胞。結論:Ang II能不同程度地影響外膜成纖維細胞亞群的分化能力，進一步揭示出2個細胞亞群在血管重構過程中扮演不同角色。

成纖維細胞亞群； α-平滑肌肌動蛋白； 血管緊張素II

血管在受到損傷時，其結構和功能會相應地發(fā)生改變，這種變化稱之為血管重塑，是高血壓、心肌梗死、血管再狹窄等多種心血管疾病發(fā)病的共同病理基礎[1]。有研究指出血管外膜的功能除了基本的支撐作用外，在血管受損后亦扮演重要角色。尤其是在受到某些因子刺激下，成纖維細胞表型會轉化成肌成纖維細胞，表達α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，并繼續(xù)增殖遷移至內膜，從而形成新生內膜，促進膠原蛋白的合成，最終導致血管重塑的發(fā)生[2-3]。由此可知，成纖維細胞的增殖、遷移及轉化等一系列改變在血管重塑的中發(fā)揮著不可替代的作用。An等[4]曾報道在血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)刺激作用下，血管外膜成纖維細胞會合成和釋放內皮素1(endothelin-1，ET-1)，膠原蛋白的生成也有所增加。深入研究發(fā)現(xiàn)血管外膜成纖維細胞不僅在形態(tài)上有顯著的異質性，在增殖及遷移能力等方面亦存在較大差異[5-7]。本實驗旨在比較在沒有刺激因子存在時，α-SMA蛋白在細胞亞群中的表達是否有差異；以及在Ang II刺激下，細胞亞群轉化能力的異同，以期為臨床研究血管外膜在血管重塑中的作用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物和細胞分離

SPF級SD大鼠，雄性，6～8周齡，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(冀) 2013-1-003。大鼠成纖維細胞由大鼠血管胸主動脈外膜分離所得，再經(jīng)克隆環(huán)法進行單克隆細胞培養(yǎng)，最終得到成纖維細胞亞群。方法同參考文獻[4]。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Lonza BioWhittaker；TRIzol購自Invitrogen；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、Ang II和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液購自Sigma；兔抗鼠α-SMA單克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP 購自Epitomics；ECL顯色液購自博彩；dNTP和TaqDNA聚合酶購自Promega；所用引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列見表1。

3 主要方法

3.1 成纖維細胞亞群的純度鑒定 實驗用大鼠胸主動脈含有成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和白細胞，無菌條件下去除內膜和中膜，將外膜切成小塊兒使其爬出成纖維細胞，為了確定爬出細胞為純的成纖維細胞，首先采用免疫熒光染色法進行純度試驗，分別以結蛋白(desmin)和第Ⅷ因子(von Willebrand factor，vWF)為平滑肌細胞和內皮細胞標志物，以波形蛋白(vimentin)為非特異性細胞標志物，進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察結果。如無污染，再通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)進一步從分子水平鑒定細胞純度[5,8]。根據(jù)DNAman軟件設計并合成相關引物，引物序列如表1所示。提取大鼠胸主動脈外膜和成纖維細胞RNA，經(jīng)反復試驗摸索出引物合適的循環(huán)體系和最佳退火溫度，PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳后染色，最后通過凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。

表1 引物序列

3.2 熒光定量PCR(fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測α-SMA mRNA的表達 采用TRIzol法提取第3代(passage 3，P3)至P8成纖維細胞亞群RNA，經(jīng)反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板、β-肌動蛋白(β-actin)為內參照進行FQ-PCR，設計并合成α-SMA引物，引物序列見表1。循環(huán)體系為SYBR Green、1.25 U Taq聚合酶、0.2 mmol/L dNTP、20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、1.5 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl和20 nmol/L的上、下游引物。以看家基因β-actin為內參照，采用Rotor-Gene 6000軟件對數(shù)據(jù)進行分析，獲得各個α-SMA/β-actin的比值，其中以處理前細胞α-SMA和β-actin的比值是1為基準。

3.3 免疫熒光染色法檢測α-SMA的蛋白表達 將細胞亞群以1.0×106/L接種于直徑30 mm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，饑餓24 h，加入Ang II濃度為100 nmol/L的新鮮培養(yǎng)液，對照組更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗滌3次，每次5 min，棄液用4%多聚甲醛固定30 min后，PBST洗滌3次，每次2 min，棄液后加入0.1% Triton X-100孵育10 min以增加細胞膜的抗原通透性，PBST洗滌2次，每次3 min，棄液后加入1% BSA溶液封閉30 min，棄液后加入兔抗鼠α-SMA單克隆抗體(1∶500)，對照組加PBS，4 ℃孵育過夜，次日再用PBST洗滌3次，每次5 min，加入熒光素標記的羊抗兔IgG-FITC抗體(1∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，DAPI (1∶1 000)室溫避光孵育5 min，PBST洗滌3次，每次5 min，棄液后置熒光顯微鏡下觀察。

3.4 Western blot[7,9]檢測α-SMA蛋白的表達 將細胞傳代至培養(yǎng)瓶中，待長至80%融合后進行實驗，分為實驗組和對照組。實驗組Ang II濃度依次為10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L，對照組不加Ang II，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取蛋白。用4 ℃預冷的細胞裂解液[1 mol/L Tris-HCl， pH 8.0，0.15 mol/L NaCl，1%Triton X-100, 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)]，于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，上清液即為蛋白。將上清液分裝到離心管中于-20 ℃保存。以BCA法測得蛋白含量后，計算出含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。將樣品與上樣緩沖液混勻，煮沸變性后跑電泳。采用半干式轉膜儀(20 mA，40 min)轉于PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜，搖床上輕搖1 h，TBST漂洗15 min×3次后，加 I 抗(含兔抗鼠α-SMA單克隆抗體和兔抗鼠β-actin單克隆抗體的5%脫脂奶粉液)，4 ℃輕搖過夜。次日取出膜用TBST漂洗15 min 3次，加入 II 抗(含羊抗兔IgG-HRP的5%脫脂奶粉液)，室溫輕搖1 h，TBST洗膜15 min 3次，滴加ECL顯色液于膜上，反應3 min，壓片2 min，將膠片先后置于顯影液和定影液各5 min后觀察結果。

4 統(tǒng)計學處理

圖形處理及統(tǒng)計學分析使用GraphPad Prism 5.0 軟件，實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。FQ-PCR數(shù)據(jù)分析中采用Rotor-Gene 6000軟件進行數(shù)據(jù)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 成纖維細胞亞群形態(tài)學觀察及純度分析

本實驗采用克隆環(huán)法成功獲得不同細胞亞群，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，這些細胞從形態(tài)上分為圓形細胞亞群和紡錘形細胞亞群，見圖1。免疫熒光染色結果顯示實驗用成纖維細胞不混有平滑肌細胞和內皮細胞，見圖2。圖3中RT-PCR結果顯示成纖維細胞中提取的RNA未見CD8、vWF、desmin和MHC的表達，說明本實驗經(jīng)體外分離的成纖維細胞無白細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的污染，為純的成纖維細胞。

Figure 1.Fibroblast subpopulations isolated from adventitia by the method of cloning rings. A: spindle cells; B: round cells.

圖1 克隆環(huán)法獲得外膜成纖維細胞亞群

Figure 2.Identification of the cell purity by immunofluorescence staining. Immunofluorescence staining of fibroblasts were shown for desmin (a marker for vascular smooth muscle cells), vWF (a marker for endothelial cells) and vimentin (a nonspecific marker for many cell types). No dense staining for desmin or vWF, but strong staining for vimentin in the SD rat aortic adventitial cells was observed. The nuclei were stained by DAPI.

圖2 免疫熒光染色鑒定細胞純度結果

2 Ang II對不同代數(shù)成纖維細胞亞群 α-SMA mRNA表達的影響

在100 nmol/L Ang II刺激下，從P3細胞開始至P8，紡錘形細胞和圓形細胞α-SMA在mRNA水平表達情況存在顯著性差異：紡錘形細胞α-SMA的mRNA表達量有減少趨勢，而圓形細胞α-SMA的mRNA表達量顯著增多。單因素方差分析結果顯示，從P3到P8，2個細胞亞群α-SMA mRNA表達量的差異存在統(tǒng)計學顯著性，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與自身P3相比，P5～P8圓形細胞α-SMA的mRNA表達量顯著增高(P<0.05)，見圖4。

3 免疫熒光染色法檢測Ang II對成纖維細胞亞群 α-SMA蛋白表達的影響

通過上述FQ-PCR實驗，我們知道正常情況下，在mRNA水平紡錘形細胞和圓形細胞均可表達少量α-SMA。進一步從蛋白水平證實，在無因子刺激條件下，2個細胞亞群可表達少量α-SMA蛋白，而在100 nmol/L Ang II刺激下，2個細胞亞群α-SMA的蛋白表達量顯著增多，且圓形細胞α-SMA的蛋白表達量高于紡錘形細胞。在高倍免疫熒光顯微鏡下可見胞質內大量向細胞兩極放射的條絲狀蛋白且與細胞長軸平行，即為α-SMA，見圖5。

Figure 3. Identification of the cell purity by RT-PCR. The fibroblasts showed no expression for vWF, CD8, desmin and MHC. In contrast, the aorta had strong positive staining for them. Both fibroblasts and aorta tissue expressed β-actin.

圖3 RT-PCR鑒定細胞純度結果

Figure 4.The expression of α-SMA from different passages of the fibroblast subpopulations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsP3.

圖4 不同代數(shù)成纖維細胞亞群 α-SMA的表達

Figure 5.Immunofluorescence staining was performed using monoclonal antibody against α-SMA (green for α-SMA, and blue for nuclei).

圖5 α-SMA蛋白的免疫熒光染色結果

4 Western blot檢測Ang II對成纖維細胞亞群 α-SMA蛋白表達的影響

Western blot實驗結果表明，紡錘形細胞和圓形細胞均表達少量α-SMA，Ang II刺激后2個細胞亞群的α-SMA表達量均增多。不同的是，隨著Ang II濃度的增加，紡錘形細胞α-SMA的蛋白表達量沒有明顯增多的趨勢，而圓形細胞α-SMA的蛋白表達量隨Ang II濃度的增加顯著增多，尤其是Ang II濃度為1 000 nmol/L時，α-SMA的蛋白表達量最高，見圖6。

討 論

血管中的主要細胞成分，如內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞以及其它血管壁細胞均參與血管再狹窄的修復工作。之前血管平滑肌細胞在內膜增厚和血管再狹窄中占主導地位的觀點已有所動搖。大量證據(jù)表明，血管外膜的成纖維細胞才是血管新生內膜形成、血管再狹窄和不良血管重塑的真正病理基礎，而且在血管性疾病的病變中扮演著重要角色[8,10]。

Figure 6.The expression of α-SMA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖6 Western blot檢測 α-SMA蛋白的表達

經(jīng)過早期研究我們已成功從體外分離并培養(yǎng)了紡錘形細胞亞群和圓形細胞亞群[5]，首先從形態(tài)上說明了成纖維細胞亞群的異質性，紡錘形細胞形狀類似紡錘體，故名為紡錘形，圓形細胞呈圓形，命名為圓形，進一步對細胞亞群的增殖[7]及遷移[6]等能力進行了比較，發(fā)現(xiàn)在無外界因子刺激下，圓形細胞的增殖速度略快于紡錘形細胞，而在Ang II(10～1 000 nmol/L)刺激下，這種作用被進一步放大，Ang II不僅促進了成纖維細胞亞群的增殖和遷移，對圓形細胞亞群的這種促進作用更顯著。 Ang II 是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要效應物質，也是血管緊張素最重要的組成部分，人體多個器官的細胞上存在血管緊張素受體，當Ang II與受體結合時，可引起血管收縮、血壓增高、還可促進細胞增殖以及其它相關生長因子和生物活性物質釋放，在心腦血管疾病的病理性過程中發(fā)揮關鍵性作用[11]。

本研究對2個細胞亞群的分化能力進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)在從P3代至P8代的傳代過程中，紡錘形細胞亞群的α-SMA表達量有逐漸減少趨勢，而圓形細胞亞群的α-SMA表達量則逐漸增多。進一步用不同濃度Ang II刺激細胞，發(fā)現(xiàn)紡錘形細胞亞群的α-SMA表達量無明顯增多，而圓形細胞亞群的α-SMA表達量隨Ang II濃度增加而顯著增多，即Ang II能刺激圓形細胞亞群更多地轉化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞的識別特征是胞漿內出現(xiàn)α-SMA[12]。Sartore等[13]采用豬冠狀動脈球囊損傷模型觀察外膜變化，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的增殖先于其它細胞，并能轉化為肌成纖維細胞。本課題研究結果與相關研究報道吻合，而且進一步從細胞水平揭示兩細胞亞群的作用機制不同，推測細胞亞群在組織水平，如參與血管重構等過程中，以圓形細胞亞群的增殖、遷移、分化為主，紡錘形細胞則主要負責自身組織的增殖等功能。本實驗只在離體細胞水平進行了細胞亞群功能的比較，整體病理生理情況下的作用特點還有待進一步證實。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of angiotensin II on phenotypic transformation in vascular adventitial fibroblast subpopulations

LIU Pei, AN Sheng-jun, SHAO Tie-mei

(BioreactorandProteinDrugResearchandDevelopmentCenterofHebeiUniversities,HebeiChemicalandPharmaceuticalCollege,Shijiazhuang050026,China.E-mail:shengjunan@yahoo.com)

AIM: To explore the effect of angiotensin II (Ang II) on phenotypic transformation in adventitial fibroblast subpopulations isolated from rat thoracic aorta. METHODS: Vascular adventitial fibroblasts were individually expanded by the method of cloning rings. The isolated cells were identified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence staining. The rat vascular adventitial fibroblasts were culturedinvitroand incubated with or without Ang II. Using the methods of fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), immunofluorescence staining and Western blot, the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) was detected.RESULTS: The spindle cells and round cells were isolated by the method of cloning rings. From passage 3 to passage 8, α-SMA expression was decreased in the spindle cells, and increased significantly in the round cells. Induced by Ang II, the expression of α-SMA was increased in the 2 cell subpopulations, and that in the round cells was significantly increased (P<0.01). The results of Western blot indicated that Ang II stimulated the subpopulation of the round cells to transfer to myofibroblasts. CONCLUSION: Ang II promotes the phenotypic transformation of adventitial fibroblast subpopulations, and the 2 subpopulations may play an important role in vascular remodeling and reparative process.

Fibroblast subpopulations; α-Smooth muscle actin; Angiotensin II

1000- 4718(2016)12- 2211- 05

2016- 09- 02

2016- 10- 24

國家自然科學基金資助項目(No. 81473578)；河北省高等學校科學技術研究青年基金資助項目(No. QN2015049)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.014

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