陶潞淵， 吳少澤， 王嬌妮， 王國(guó)強(qiáng)， 薛楊靜， 徐志強(qiáng)， 汪 潔， 唐疾飛， 季亢挺

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325027)

阿米福汀對(duì)苯并[a]芘誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成的作用*

陶潞淵， 吳少澤， 王嬌妮， 王國(guó)強(qiáng)， 薛楊靜， 徐志強(qiáng)， 汪 潔， 唐疾飛， 季亢挺△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325027)

目的： 研究阿米福汀對(duì)苯并[a]芘(BaP)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠腹主動(dòng)脈瘤(AAA)形成的作用，并探討相關(guān)機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)RAW264.7單核巨噬細(xì)胞，分為正常對(duì)照組，溶劑對(duì)照組(即DMSO組)，BaP組，低劑量(1 μmol/L)阿米福汀組，中劑量(5 μmol/L)阿米福汀組及高劑量(25 μmol/L)阿米福汀組，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)體外培養(yǎng)的RAW264.7單核巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB表達(dá)。48只C57BL/6J小鼠(8月齡，雄性)隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(AngⅡ+BaP組)、低劑量(50 mg/kg)阿米福汀組、高劑量(100 mg/kg)阿米福汀組。6周后取腹主動(dòng)脈察看標(biāo)本形態(tài)；行HE、 Masson染色觀察血管形態(tài)結(jié)構(gòu)；測(cè)定腹主動(dòng)脈的血管周長(zhǎng)。Western blot、免疫組化法評(píng)價(jià)腹主動(dòng)脈組織中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及MMP-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB的表達(dá)。結(jié)果:Western blot發(fā)現(xiàn) BaP刺激使巨噬細(xì)胞MMP-9、MMP-12、TNF-α、NF-κB的表達(dá)升高，而阿米福汀對(duì)此有顯著抑制作用，且呈劑量依賴性(P<0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)對(duì)照組成瘤率為0，高劑量阿米福汀組成瘤率為16.67%，與模型組(58.33%)和低劑量阿米福汀組(33.33%)相比顯著降低(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示高劑量阿米福汀組腹主動(dòng)脈壁的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度及TNF-α、MMP-9、MMP-12、NF-κB的表達(dá)較模型組和低劑量阿米福汀組相比顯著下降(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)高劑量阿米福汀組腹主動(dòng)脈壁TNF-α、MMP-9、MMP-12、NF-κB的表達(dá)較模型組和低劑量阿米福汀組相比顯著下降(P<0.05)。結(jié)論:阿米福汀可以抑制BaP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活化，同時(shí)可以抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能跟抑制NF-κB途徑、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及MMPs、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

阿米福??； 腹主動(dòng)脈瘤； 苯并[a]芘； 巨噬細(xì)胞； 基質(zhì)金屬蛋白酶

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是各致病因素下，腹主動(dòng)脈中層彈性纖維退化斷裂，血管壁變薄，在長(zhǎng)期血壓壓力沖擊下局部向外擴(kuò)張，形成的瘤體，其破裂后死亡率高達(dá)90%。目前針對(duì)AAA的治療主要為手術(shù)和介入治療，但費(fèi)用高并發(fā)癥多，因此對(duì)腹主動(dòng)脈的藥物治療需求日益迫切。

AAA的主要病理特征是腹主動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、彈性纖維及膠原蛋白的降解和血管平滑肌細(xì)胞的凋亡[1]。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為是動(dòng)脈壁上的炎癥反應(yīng)啟動(dòng)AAA的整個(gè)病理過(guò)程[2]，而巨噬細(xì)胞在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用[3]，炎癥發(fā)生后，隨之而來(lái)的是彈性纖維和膠原蛋白的降解[4]，主要原因是血管壁中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)活性增加。

吸煙是腹主動(dòng)脈瘤的高危因素[5]。吸煙者患AAA的風(fēng)險(xiǎn)比不吸煙者高8倍，戒煙后患AAA的風(fēng)險(xiǎn)降低4倍[6]。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，BaP)是香煙煙霧的重要組成部分[7]。研究表明，BaP可使正常血管發(fā)生病理改變[8]，使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加、MMPs的表達(dá)升高、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB) 活化[9-10]。BaP誘導(dǎo)的病理學(xué)改變與AAA發(fā)展中的病理改變極其相似。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[11]，在BaP協(xié)同血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)作用下，C57BL/6J小鼠AAA的發(fā)生率顯著高于單獨(dú)AngII處理的小鼠。

阿米福汀(amifostine)是一種放化療輔助用藥，能夠減輕放、化療對(duì)正常組織的損傷，在堿性磷酸酶作用下，阿米福汀轉(zhuǎn)化為WR-1065，能夠抑制過(guò)氧化從而使得細(xì)胞氧化損傷減輕。 Chok等[12]在腎臟的缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)阿米福汀可以通過(guò)清除氧自由基、抗炎、減少細(xì)胞凋亡來(lái)減輕再灌注損傷。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子的表達(dá)。故設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)研究阿米福汀對(duì)腹主動(dòng)脈瘤形成的作用及其相關(guān)機(jī)制，為腹主動(dòng)脈瘤的藥物治療提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞為小鼠白血病單核細(xì)胞，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)C57BL/6J雄性小鼠(購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，8月齡，體重28～32 g。放置于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心SPF級(jí)動(dòng)物房中飼料喂養(yǎng)。飲用無(wú)菌純凈水，無(wú)菌飼料喂養(yǎng)，自由飲食。晝夜變化規(guī)律，室內(nèi)恒溫、恒濕。

2 主要材料、藥物和試劑

藥物微量滲透泵(0.15 μL/h)購(gòu)自Alzet；阿米福汀注射液購(gòu)自大連美羅大藥廠；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、血管緊張素Ⅱ和苯并[a]芘均購(gòu)自Sigma；中鏈甘油三酯購(gòu)自GATTEFOSSE；抗MMP-12、MMP-9、CD68、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和NF-κB p65抗體購(gòu)自Abcam；蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE staining)試劑盒和馬松染色(Masson staining)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞培養(yǎng)： RAW264.7細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)于10% DMEM培養(yǎng)液中并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)瓶底面積的80%時(shí)，使用吸管吹下。待90%以上細(xì)胞脫落時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。吸取9 mL 10% DMEM完全培養(yǎng)液至上述含有細(xì)胞沉淀的離心管中，吹打成細(xì)胞懸液。分別吸取3 mL細(xì)胞懸液至預(yù)先裝好1 mL 10% DMEM完全培養(yǎng)液的25 cm3的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻。將培養(yǎng)瓶重新置于飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。(2)實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照(control)組不做任何處理；溶劑對(duì)照組(即DMSO組)的DMSO終濃度為0.01%；BaP組的BaP終濃度為20 μmol/L，BaP先溶于DMSO；低(1 μmol/L)、中(5 μmol/L)、高(25 μmol/L)劑量阿米福汀組：先分別將1 、5、25 μmol/L的阿米福汀作用細(xì)胞2 h后，再用20 μmol/L的BaP作用細(xì)胞24 h。(3)取材：將各組RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后提取總蛋白，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和模型建立 C57BL/6J小鼠共分為對(duì)照(control)組、模型組(即Ang II+BaP組)、低劑量阿米福汀組、高劑量阿米福汀組，每組12只。對(duì)照組的動(dòng)物接受腹腔注射中鏈甘油三酯5 mL/kg,每周1次，給藥6周。Ang II+BaP組：戊巴比妥鈉(2%，40 mg/kg)腹腔注射麻醉，在背部切一長(zhǎng)約1 cm的切口，將灌注Ang II溶液的ALZET泵通過(guò)切口埋入皮下(Ang Ⅱ溶于生理鹽水，每只泵注入168 μL的Ang II溶液，微量緩釋泵持續(xù)釋放Ang II 0.9 mg·kg-1·d-1，釋放速度為0.15 μL/h,持續(xù)6周，植入前，先將藥物緩釋泵放置于37 ℃水浴箱中12 h，腹腔注射BaP(10 mg/kg)，將BaP溶解于中鏈甘油三酯中，制成濃度為2 g/L的溶液，以5 mL/kg腹腔注射，每周1次，共給藥6周。低劑量阿米福汀組：植入Ang II微量滲透泵，腹腔注射阿米福汀注射液(50 mg/kg)，30 min后腹腔注射BaP，每周1次。高劑量阿米福汀組：植入Ang II微量滲透泵，腹腔注射阿米福汀注射液(100 mg/kg)，30 min后腹腔注射BaP，每周1次。

3.3 腹主動(dòng)脈標(biāo)本制備 各組小鼠處理6周后，用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉致死，取腹主動(dòng)脈，部分存于液氮中行Western blot檢測(cè)，部分存于4%多聚甲醛中行HE染色、Masson染色和免疫組化檢測(cè)。

3.4 組織包埋、切片 取小鼠腹主動(dòng)脈標(biāo)本，常規(guī)二甲苯透明、浸蠟、脫水、包埋，以4 μm為厚度切片。

3.5 HE染色 常規(guī)烤片、脫蠟。染色：蘇木素染色液滴于玻片組織上2 min，自來(lái)水沖洗，PBS溶液浸泡5 s返藍(lán)，清水沖洗，伊紅染色液滴于玻片組織上5 min，清水沖洗。再脫水、透明、封片、鏡下觀察。

3.6 Masson染色 常規(guī)烤片、脫蠟、染色(具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行);再脫水、透明、封片、鏡下觀察。

3.7 免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)烤片、脫蠟、水合。用MMP-12、MMP-9、CD68、TNF-α和NF-κB p65各抗體行免疫組化染色，采用SP法，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.8 Western blot測(cè)定目的蛋白 檢測(cè)各組TNF-α、NF-κB、MMP-9、MMP-12和GAPDH蛋白的表達(dá)情況。上樣總蛋白量為40 μg, 室溫下SDS-PAGE分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)目的蛋白到PVDF膜上，常規(guī)洗膜封閉，分別孵育Ⅰ抗(TNF-α抗體1∶1 000稀釋，NF-κB抗體1∶1 000稀釋，MMP-9抗體1∶1 000稀釋，MMP-12抗體1∶1 000稀釋，GAPDH抗體1∶10 000稀釋)和Ⅱ抗(1∶10 000),然后化學(xué)發(fā)光，Bio-Rad凝膠成像儀曝光。圖像處理軟件 AlphaEaseFC對(duì)Western blot圖像進(jìn)行分析。

3.9 動(dòng)脈瘤形成的判定 首先肉眼判定瘤體形成情況，再取染色切片，在顯微鏡下，每張切片均以相同的設(shè)置拍照。觀察血管切片染色情況(細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，彈力蛋白纖維呈亮粉紅色)。在每只小鼠腹主動(dòng)脈取不同位置的12張切片，運(yùn)用ImageJ圖像分析軟件檢測(cè)每張切片腹主動(dòng)脈周長(zhǎng)，繼而算出各組小鼠腹主動(dòng)脈的平均周長(zhǎng)；只要小鼠的腹主動(dòng)脈的最大周長(zhǎng)大于對(duì)照組小鼠平均周長(zhǎng)的50%，就可以認(rèn)為此只小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)資料采用SPSS 21.0軟件處理。經(jīng)處理后得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述。使用單因素方差分析、SNK-q法檢驗(yàn)各組資料。實(shí)驗(yàn)中成瘤率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB的表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組單核巨噬細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BaP組TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05);阿米福汀組上述蛋白表達(dá)受到顯著抑制；高劑量阿米福汀組巨噬細(xì)胞TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB的表達(dá)較BaP組、低劑量阿米福汀組和中劑量阿米福汀組有顯著的下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成

各組小鼠處理6周后解剖，分離腹主動(dòng)脈觀察形態(tài)，見(jiàn)模型組腹主動(dòng)脈局部有瘤樣突出，視為肉眼瘤體形成。行HE染色，運(yùn)用ImageJ圖像分析軟件檢測(cè)各組小鼠的腹主動(dòng)脈平均周長(zhǎng)，腹主動(dòng)脈瘤形成標(biāo)準(zhǔn)為血管最大周長(zhǎng)大于對(duì)照組動(dòng)脈平均周長(zhǎng)的50%。對(duì)照組的腹主動(dòng)脈平均周長(zhǎng)為(954±103)μm，各實(shí)驗(yàn)組小鼠腹主動(dòng)脈的最大周長(zhǎng)只要大于1 431 μm，即可視為動(dòng)脈瘤的形成。結(jié)果顯示模型組的AAA形成率為58.33%，動(dòng)脈平均血管周長(zhǎng)為(1 401±230)μm；低劑量阿米福汀組的AAA形成率為33.33%，平均血管周長(zhǎng)為(1 322±211)μm；高劑量阿米福汀組的AAA形成率為16.67%，腹主動(dòng)脈平均血管周長(zhǎng)為(1 023±102)μm。高劑量阿米福汀組的AAA形成率與模型組和低劑量阿米福汀組相比顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Amifostine attenuated BaP-induced expression of TNF-α, MMP-9, MMP-12 and NF-κB in the RAW246.7 macrophages. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBaP group;$P<0.05vsamifostine (1 μmol/L) group;&P<0.05vsamifostine (5 μmol/L) group.

圖1 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB 表達(dá)

3 腹主動(dòng)脈組織學(xué)的改變

HE染色和Masson染色切片可見(jiàn)模型組腹主動(dòng)脈壁中膜彈力纖維有顯著降解、斷裂；膠原蛋白溶解、丟失，血管中膜彈力層斷裂，血管正常結(jié)構(gòu)破壞，符合典型的動(dòng)脈瘤組織病理學(xué)特征，高劑量阿米福汀組血管結(jié)構(gòu)破壞程度較模型組、低劑量阿米福汀組有顯著改善，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Amifostine reduced BaP-induced abdominal aortic circumference in mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ+BaP group;$P<0.05vsamifostine (50 mg/kg) group.

圖2 阿米福汀降低BaP刺激小鼠的腹主動(dòng)脈周長(zhǎng)

Figure 3.Amifostine inhibited BaP-induced abdominal aortic damage in mice (×400).

圖3 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的破壞

4 阿米福汀減輕BaP誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈血管壁巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

運(yùn)用羊抗鼠CD68抗體對(duì)各組血管切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察血管壁巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況(圖4)。與對(duì)照組相比，模型組腹主動(dòng)脈血管壁巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加(P<0.05)，阿米福汀呈劑量依賴性減輕BaP誘導(dǎo)的血管壁巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表1。

Figure 4.Amifostine inhibited BaP-induced abdominal aortic augment on CD68, TNF-α, MMP-9, MMP-12 and NF-κB expression in abdominal aorta wall of each group (×400).

圖4 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈壁CD68、TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB的表達(dá)

5 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的血管壁NF-κB、TNF-α、MMP-9和MMP-12的表達(dá)

我們對(duì)小鼠腹主動(dòng)脈切片進(jìn)行NF-κB、MMP-9、MMP-12和TNF-α免疫組化染色(圖4)，同時(shí)對(duì)各組腹主動(dòng)脈組織行Western blot檢測(cè)。免疫組化染色可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組腹主動(dòng)脈壁NF-κB、TNF-α、MMP-9和MMP-12的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而阿米福汀對(duì)腹主動(dòng)脈壁NF-κB、TNF-α、MMP-9和MMP-12的表達(dá)有顯著抑制作用，并呈劑量依賴性(P<0.05)，見(jiàn)表1。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，高劑量阿米福汀組腹主動(dòng)脈壁NF-κB、TNF-α、MMP-9和MMP-12的表達(dá)較低劑量阿米福汀組和模型組均顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

表1 各組小鼠腹主動(dòng)脈壁MMPs、TNF-α和NF-κB表達(dá)的免疫組化結(jié)果

Table 1.The expression of MMPs, TNF-α and NF-κB in abdominal aorta of each group detected by immunohistochemisty (Mean±SD.n=12)

GroupCD68TNF-αMMP-9MMP-12NF-κBControl0.14±0.050.12±0.030.13±0.040.12±0.040.11±0.05AngⅡ+BaP0.61±0.11*0.45±0.12*0.51±0.12*0.48±0.13*0.45±0.13*Amifostine(50mg)0.48±0.09#0.29±0.06#0.35±0.09#0.35±0.06#0.38±0.09#Amifostine(100mg)0.31±0.07#$0.19±0.04#$0.23±0.06#$0.21±0.05#$0.25±0.07#$

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ+BaP group;$P<0.05vsamifostine (50 mg/kg) group.

Figure 5.The results of Western blot showed that amifostine attenuated BaP-induced TNF-α, MMP-9, MMP-12 and NF-κB expression of mice abdominal aorta. Mean±SD.n=12.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ+BaP group;$P<0.05vsamifostine (50 mg/kg) group.

圖5 阿米福汀抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈壁TNF-α、MMP-9、MMP-12和NF-κB 表達(dá)

討 論

腹主動(dòng)脈瘤目前有效的主流治療方法包括外科手術(shù)治療和血管介入治療，兩者的圍術(shù)期并發(fā)癥和手術(shù)死亡率均較高。在腹主動(dòng)脈瘤瘤體較小的時(shí)候，早期應(yīng)用藥物抑制腹主動(dòng)脈瘤體的增大可以避免手術(shù)和介入治療，對(duì)于腹主動(dòng)脈瘤患者有重要的臨床意義。

腹主動(dòng)脈瘤的早期病理特征為炎癥反應(yīng)[13-15]，局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，彈性纖維降解斷裂，彈力蛋白和膠原退變[16-19]等。主動(dòng)脈壁上血管平滑肌細(xì)胞減少，腹主動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)是腹主動(dòng)脈瘤病理過(guò)程關(guān)鍵因素。大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示吸煙是腹主動(dòng)脈瘤的高危因素，而B(niǎo)aP是吸煙煙霧中重要成分，炎癥細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞的活化在吸煙誘發(fā)AAA中起重要作用，我們前期實(shí)驗(yàn)[11]也發(fā)現(xiàn)BaP促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的AAA發(fā)展 。抑制炎癥反應(yīng)可顯著抑制瘤體的生長(zhǎng)速度，Lawrenece等[20]報(bào)道雷帕霉素可顯著降低瘤體的直徑。阿米福汀是一種細(xì)胞保護(hù)劑，廣泛用于放化療的輔助治療，減輕正常組織細(xì)胞的損傷，相關(guān)研究[12]表明阿米福汀能夠抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基。在本次實(shí)驗(yàn)研究阿米福汀對(duì)BaP誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈瘤的作用中顯示：低劑量、高劑量阿米福汀組AAA的形成分別為33.33%、16.67%，都小于模型組AAA的形成率(58.33%)，高劑量阿米福汀組AAA的形成率更低。各組小鼠HE、Masson染色示：高劑量阿米福汀組小鼠腹主動(dòng)脈壁彈性纖維斷裂，膠原蛋白的缺失情況較模型組和低劑量阿米福汀組顯著改善。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿米福汀顯著抑制BaP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NF-κB和TNF-α細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-κB和TNF-α細(xì)胞因子在AAA的血管壁的炎癥反應(yīng)中起重要作用，Ren等[21]在穿心蓮內(nèi)酯抑制AAA作用的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制AAA的發(fā)生、發(fā)展，且伴隨著TNF-α表達(dá)下調(diào)和NF-κB活化的抑制。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增生、凋亡等多種病理生理過(guò)程密切相關(guān)，在許多疾病中發(fā)揮著著重要作用。血管壁細(xì)胞外基質(zhì)彈性纖維和膠原蛋白退化降解的過(guò)程中，MMPs的激活和表達(dá)增加被認(rèn)為是主要因素。在人類腹主動(dòng)脈瘤標(biāo)本中檢測(cè)到MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-12和 MMP-13的表達(dá)均增加[16-19]。有研究顯示在AAA的病理過(guò)程中，NF-κB是巨噬細(xì)胞遷移和MMPs表達(dá)重要的調(diào)節(jié)介質(zhì)。吡咯烷二巰基氨甲酸具有抑制NF-κB活力的作用，在其作用下，AAA發(fā)生率降低，表明NF-κB途徑與AAA顯著相關(guān)[13]。有研究設(shè)計(jì)用嵌合體誘導(dǎo)寡核苷酸來(lái)阻止NF-κB發(fā)揮作用，腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展受到抑制，同時(shí)觀察到巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少和MMPs表達(dá)下降[22]。Chase等[23]通過(guò)體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，以重組腺病毒介導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，抑制NF-κB活性能使MMP-9及MMP-1的表達(dá)下降，這進(jìn)一步說(shuō)明NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞及MMPs的表達(dá)起著調(diào)控作用。在我們前期實(shí)驗(yàn)中[11]，我們也觀測(cè)到在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，NF-κB活化的同時(shí)，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及MMP表達(dá)均增加。相關(guān)研究表明對(duì)血管壁炎癥反應(yīng)的控制可減少M(fèi)MP-2、MMP-9、MMP-12的表達(dá)并抑制AAA的發(fā)生、發(fā)展[24]。巨噬細(xì)胞可以分泌NF-κB、TNF-α,作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，兩者可以相互作用，增加血管壁巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及血管壁MMP-9、MMP-12的表達(dá)，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的退化降解，促進(jìn)腹主動(dòng)脈的形成。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用阿米福汀預(yù)保護(hù)后可以顯著減輕BaP刺激引起的巨噬細(xì)胞NF-κB、TNF-α、MMP-9、MMP-12的表達(dá)。同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，NF-κB的表達(dá)在模型組顯著增加，同時(shí)伴隨巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、MMP-9/-12及TNF-α表達(dá)增加，高劑量阿米福汀可顯著逆轉(zhuǎn)上述作用。由此，我們推測(cè)阿米福汀可能通過(guò)抑制NF-κB途徑，從而抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、MMP、TNF-α的表達(dá)，最終抑制腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。

本次實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)阿米福汀可以抑制BaP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活化，并且可以抑制BaP誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能跟抑制NF-κB途徑、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、MMPs及TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of amifostine on formation of abdominal aortic aneurysm in mice induced by benzo[a]pyrene

TAO Lu-yuan, WU Shao-ze, WANG Jiao-ni, WANG Guo-qiang, XUE Yang-jing, XU Zhi-qiang, WANG Jie, TANG Ji-fei, JI Kang-ting

(DepartmentofGardiology,TheSecondHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:jikt@wzmc.edu.cn)

AIM: To study the role of amifostine on the formation of benzo[a]pyrene (BaP)-induced abdominal aortic aneurysm (AAA) in C57BL/6J mice and the underlying mechanism. METHODS: RAW246.7 mononuclear macrophageinvitrowere divided into control group, DMSO group, BaP group, low dose (1 μmol/L) amfostine treated group, middle dose (5 μmol/L) amfostine treated group and high dose (25μmol/L) amfostine treated group. The influence of BaP on the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-9, MMP-12, TNF-α, NF-κB in the RAW246.7 mononuclear macrophagesinvitrowas determined by Western blot. Male C57BL/6J mice (8 months old) were divided into control group, model group (AngII+BaP group), low dose (50 mg/kg) amfostine treated group and high dose (100 mg/kg) amfostine treated group. After 6 weeks, the abdominal aorta were isolated. The aortic tissues were subjected to HE and Masson staining. The vascular wall structure, infiltration of macrophage, the expression of MMP-9, MMP-12, TNF-α, NF-κB were evaluated by Western blot and immunochemistry staining. RESULTS: Amifostine attenuated BaP-induced expression of TNF-α, MMP-9, MMP-12, NF-κB in the RAW246.7 mononuclear macrophages (P<0.05). The results of animal experiments showed that the incidence of AAA in high dose amifostine treated group were significantly lower than that in low dose amifostine treated group and model group (P<0.05). Immunohistochemistry staining observation showed that amifostine inhibited the aortic macrophage infiltration more obviously in high amifostine treated group compared with model group and low dose amifostine treated group (P<0.05). Compared with model group and low dose amifostine treated group, the MMP-9, MMP-12, TNF-α and NF-κB expression of abdominal aorta in high amifostine treated group was reduced significantly (P<0.05).CONCLUSION: Amifostine inhibits BaP-induced activation of macrophages, and also prevents the formation of abdominal aortic aneurysm in C57BL/6J mice induced by BaP by inhibition of the NF-κB pathway, macrophage infiltration and the expression of TNF-α and MMPs.

Amifostine; Abdominal aortic aneurysm; Benzo[a]pyrene; Macrophage; Matrix metalloproteinases

1000- 4718(2016)12- 2168- 09

2016- 06- 20

2016- 10- 21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81573185)；浙江省科技廳項(xiàng)目(No. 2014C33163)；溫州科技局項(xiàng)目(No. Y20140678)

R363； R543.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.008

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