靳曉飛， 張 穎， 李愛英， 武密山， 周曉紅， 趙艷萌， 高維娟△

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000； 2河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200)

缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系*

靳曉飛1， 張 穎2， 李愛英2， 武密山2， 周曉紅2， 趙艷萌2， 高維娟2△

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200)

目的： 觀察缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)變化及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討自噬對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組、自噬抑制劑組和自噬激活劑組。其中缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組、自噬抑制劑組和自噬激活劑組進(jìn)行缺氧缺糖3 h后再?gòu)?fù)氧復(fù)糖12 h，自噬抑制劑組和自噬激活劑組于復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)分別給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤和自噬激活劑雷帕霉素。用透射電子顯微鏡和單丹磺酰尸胺熒光染色檢測(cè)自噬小體的變化，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組的自噬小體增多(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)升高(P<0.05)。與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比，自噬抑制劑組的自噬小體明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而自噬激活劑組自噬小體變大，數(shù)量明顯增多(P<0.05)，并偶見自噬溶酶體，細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)。結(jié)論:缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬，且細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖； 自噬； 細(xì)胞凋亡； PC12細(xì)胞

自噬(autophagy)是細(xì)胞的一種自我吞噬現(xiàn)象，具有高度保守和精確調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)機(jī)體遇到饑餓、感染、藥物等因素刺激時(shí)，自噬可被大量激活，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，并通過自噬溶酶體途徑降解胞內(nèi)的長(zhǎng)壽命蛋白或老化損傷的細(xì)胞器，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝的需要和細(xì)胞器的更新[1-2]。大量研究證實(shí)，自噬和凋亡在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用[3-4]，且貫穿于整個(gè)病變過程。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，輕度缺氧缺血情況下，細(xì)胞自噬可發(fā)揮一定保護(hù)作用，而抑制自噬可加重?fù)p傷[5-7]。利用透射電子顯微鏡觀察自噬小體的變化被認(rèn)為是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，并且在某種程度上自噬小體的多少代表了自噬活動(dòng)的強(qiáng)弱[8]，而在腦缺血再灌注損傷過程中，自噬小體的變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系如何？相關(guān)報(bào)道尚不詳細(xì)。因此，本實(shí)驗(yàn)以常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外研究的PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型，模擬神經(jīng)元缺血再灌注損傷，觀察缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞自噬小體的變化，探討細(xì)胞自噬對(duì)抑制細(xì)胞凋亡和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的重要作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后的高分化PC12細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院許順江教授惠贈(zèng)；自噬檢測(cè)試劑盒[單丹酰尸胺(monodansylcadaverine, MDC)法]購(gòu)于凱基生物公司；TUNEL檢測(cè)凋亡試劑盒購(gòu)于Roche；Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒購(gòu)于BD；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)購(gòu)于Sigma；馬血清購(gòu)于BI；胎牛血清購(gòu)于PAR；RPMI-1640培養(yǎng)基由Gibco生產(chǎn)；Earle’s平衡鹽溶液由LEAGENE生產(chǎn)；Triton X-100購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DAB試劑盒購(gòu)于北京中山金橋生物技術(shù)公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。二氧化碳培養(yǎng)箱3111型和三氣培養(yǎng)箱3131型購(gòu)于Thermo；熒光顯微鏡DM5000B型購(gòu)于Leica；透射電子顯微鏡H-7650型購(gòu)于HITACHI；流式細(xì)胞儀FACSAriaII型購(gòu)于BD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青、鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、飽和濕度)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照(control)組、模型(model)組(即缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組)、自噬抑制劑3-MA組和自噬激活劑RAPA組。除正常對(duì)照組外，其余各組建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型：棄去正常細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI-1640培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青、鏈霉素混合液)，用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞2次，更換培養(yǎng)液為無(wú)糖Earle’s培養(yǎng)液模擬細(xì)胞缺血狀態(tài)，然后放入含94% N2、5% CO2、1% O2的37 ℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，氧糖剝奪3 h后，更換無(wú)糖Earle’s培養(yǎng)液為正常細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h[9-10]。正常對(duì)照組正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理；自噬抑制劑組和自噬激活劑組氧糖剝奪3 h后復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)分別加入3-MA(終濃度為5 mmol/L)和RAPA(終濃度為250 nmol/L)，直到培養(yǎng)結(jié)束。

2.3 透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬小體 0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化；PBS清洗細(xì)胞2次；1 000 r/min離心5 min；2.5%戊二醛固定細(xì)胞4 h；PBS浸洗3次；1%鋨酸固定細(xì)胞2 h；PBS浸洗2次；丙酮逐級(jí)脫水(50%、70%、80%、90%、100%)2遍；包埋劑∶純丙酮1∶1配制， 37 ℃浸透1 h，包埋劑∶純丙酮3∶1配制，37 ℃浸透3 h，純包埋劑37 ℃浸透5 h；37 ℃恒溫箱12 h和60 ℃恒溫箱36 h聚合；超薄切片機(jī)切片(厚度約50 nm)；醋酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色；HITACHI H-7650型透射電子顯微鏡觀察單位面積內(nèi)自噬小體的形態(tài)變化和數(shù)目。

2.4 MDC熒光染色檢測(cè)自噬小體 參考凱基生物公司自噬檢測(cè)試劑盒(MDC法)說(shuō)明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞接種到24孔板中做細(xì)胞爬片，初始濃度為2×108/L，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行造模及給藥處理。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞25 min；PBS浸洗2次；300 μL 1× wash buffer 清洗細(xì)胞2次；每孔加入100 μL MDC工作液(1× wash buffer與MDC染色液按9∶1混合),室溫避光反應(yīng)45 min；棄去MDC工作液，300 μL 1× wash buffer 清洗細(xì)胞3次；每孔加入100 μL collection buffer覆蓋細(xì)胞爬片；熒光顯微鏡觀察并計(jì)算單位面積內(nèi)熒光斑點(diǎn)的數(shù)目，激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)為512 nm。

2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率 參考BD凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，0.25%胰蛋白酶(不含EDT A)消化細(xì)胞，1 500 r/min將細(xì)胞離心5 min，4 ℃ PBS清洗細(xì)胞2次，100 μL 1× binding buffer重懸細(xì)胞(約含1×105個(gè)細(xì)胞)，同時(shí)加入5 μL FITC和5 μL PI，避光室溫反應(yīng)15 min，最后加入400 μL 1× binding buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分率。

2.6 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 參考Roche的TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，細(xì)胞接種于6孔板做爬片，初始細(xì)胞濃度為2×108/L，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行造模及給藥處理。細(xì)胞在4%多聚甲醛中室溫固定25 min，0.2%的Triton X-100透化細(xì)胞5 min，新鮮配制的3% H2O2室溫處理細(xì)胞5 min，待玻片干后，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(TdT與dUTP按1∶9混合)于細(xì)胞上，陰性對(duì)照組僅加50 μL dUTP液，37 ℃避光濕盒反應(yīng)60 min，待玻片干后，加50 μL converter-POD于細(xì)胞上，37 ℃避光濕盒反應(yīng)30 min，加100 μL DAB顯色劑，室溫反應(yīng)10 min，蘇木素復(fù)染，幾秒后用自來(lái)水沖洗，脫水，透明，封片。細(xì)胞核被染成棕黃色者為凋亡細(xì)胞(即陽(yáng)性細(xì)胞)，每張切片在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5 個(gè)不同的視野，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例(即細(xì)胞凋亡指數(shù))，取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析,各組均數(shù)間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 透射電子顯微鏡觀察缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞自噬小體的變化

正常對(duì)照組無(wú)典型自噬小體的形成；模型組可見包裹著細(xì)胞內(nèi)容物的空泡狀雙層膜結(jié)構(gòu)，即自噬小體；與模型組相比，自噬抑制劑組自噬小體減少(P<0.05)，而自噬激活劑組自噬小體變大，數(shù)量顯著增多(P<0.05)，并偶見單層膜囊泡樣結(jié)構(gòu)，即自噬溶酶體，見圖1。

Figure 1.The morphological observations of autophagosomes under transmission electron microscope. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmo-del group.

圖1 透射電子顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞自噬小體的結(jié)果

2 MDC熒光染色觀察缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞自噬小體的變化

正常對(duì)照組偶見少量熒光斑點(diǎn)，熒光強(qiáng)度微弱；與正常對(duì)照組相比，模型組熒光斑點(diǎn)增多(P<0.05)，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；與模型組相比，自噬抑制劑組熒光斑點(diǎn)顯著減少(P<0.05)，熒光強(qiáng)度減弱，而自噬激活劑組熒光斑點(diǎn)顯著增多(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與透射電子顯微鏡所得結(jié)果趨勢(shì)相一致，見圖2。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞凋亡率

與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，自噬抑制劑組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，而自噬激活劑組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

Figure 2.The observation of autophagosomes with MDC fluorescent staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 MDC熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞自噬小體的結(jié)果

4 TUNEL染色檢測(cè)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞凋亡

正常對(duì)照組偶見凋亡細(xì)胞；與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組相比，自噬抑制劑組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而自噬激活劑組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)所得結(jié)果趨勢(shì)相一致，見圖4。

討 論

自噬是指從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜或線粒體外膜脫落形成的雙層膜與需要降解的長(zhǎng)壽命蛋白或老化損傷的細(xì)胞器集結(jié)在一起，形成自噬小體，并與溶酶體逐漸融合形成自噬溶酶體，通過自噬溶酶體途徑降解其所包裹的大分子物質(zhì)，提供急需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，我們通常所說(shuō)的細(xì)胞自噬為巨自噬，也是目前研究最多和最深入的。自噬的檢測(cè)方法主要包括透射電子顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、MDC熒光染色、自噬相關(guān)蛋白的直接或間接檢測(cè)等，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察自噬小體的變化是檢測(cè)自噬最經(jīng)典、最直接的方法，被認(rèn)為是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。

Figure 3.The changes of the apoptotic rates in the PC12 cells with different treatments examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的比較

自噬功能的異?？蓪?dǎo)致多種腦血管疾病的發(fā)生或發(fā)展[6]。Puyal 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，于腦缺血再灌注損傷前給予自噬激活劑可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，縮小腦梗死容積，減輕神經(jīng)功能障礙。Carloni 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血缺氧4 h后海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元中的自噬相關(guān)基因beclin-1表達(dá)上調(diào)，在缺血缺氧24 h達(dá)到高峰，應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素后beclin-1表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)死亡的海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，而給予自噬抑制劑3-MA后，beclin-1表達(dá)下降，死亡的海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量增多。Sheng 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在離體培養(yǎng)的氧糖剝奪細(xì)胞模型中，缺氧缺糖可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬，LC3-Ⅱ水平和自噬小體數(shù)量明顯升高，而應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后細(xì)胞活性降低，損傷明顯加重。

Figure 4.The changes of the apoptosis in the PC12 cells with different treatments examined by TUNEL(×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的結(jié)果

細(xì)胞凋亡是指由體內(nèi)體外多種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，被稱為I型程序性細(xì)胞死亡[14]，而由于過度自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡被稱為II型程序性細(xì)胞死亡[15]。自噬和凋亡既有明顯的區(qū)別，又存在著復(fù)雜的聯(lián)系。Ryter 等[16]報(bào)道，在心肌缺血損傷中，細(xì)胞自噬可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減輕缺血導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷，但過度自噬會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。眭怡群等[17]報(bào)道，自噬相關(guān)基因 beclin-1、LC3與凋亡相關(guān)基因BCL-2、p53在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)調(diào)作用。Bauvy 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在 HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后，細(xì)胞凋亡活性明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞的自噬作用可抑制細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后PC12細(xì)胞內(nèi)的自噬小體明顯增多，應(yīng)用自噬抑制劑后，自噬小體減少，細(xì)胞凋亡程度上升，而給予自噬激活劑后，自噬小體變大且數(shù)量明顯增多，細(xì)胞凋亡程度顯著下降。這表明缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬，形成具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，并且細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了自噬的形態(tài)學(xué)變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，但自噬是一把雙刃劍，自噬過強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并且自噬的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，如何更加精確地檢測(cè)自噬、調(diào)控自噬、甚至應(yīng)用藥物干預(yù)自噬從而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用將是我們下一步重點(diǎn)研究的方向。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Relationship between morphological changes of autophagy and apoptosis in PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation

JIN Xiao-fei1, ZHANG Ying2, LI Ai-ying2, WU Mi-shan2, ZHOU Xiao-hong2, ZHAO Yan-meng2, GAO Wei-juan2

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiUniversityofChineseMedicine,HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchonCardiocerebrovascularDisease,Shijiazhuang050200,China.E-mail：gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the relationship between morphological changes of autophagy and apoptosis in the PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation. METHODS: The PC12 cells were randomly divided into normal control group, oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, autophagy inhibitor group and autophagy activator group. The cells in oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, autophagy inhibitor group and autophagy activator group were exposed to reoxygenation (12 h) after 3 h of oxygen-glucose deprivation, and autophagy inhibitor 3-methyladenine and autophagy activator rapamycin were added into the cells at the same time. Using transmission electron microscope and monodansylcadaverine fluorescence staining, the morphological changes of autophagosome were observed. The apoptosis of the PC12 cells were analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining and TUNEL method. RESULTS: Compared with normal control group, the numbers of autophagosomes and the apoptotic rates increased in oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group (P<0.05). Compared with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, the numbers of autophagosomes decreased obviously (P<0.05) and the apoptotic rates increased markedly in autophagy inhibitor group (P<0.05). The numbers of autophagosomes increased obviously (P<0.05), the apoptotic rates decreased markedly (P<0.05), the autophagosomes became bigger in size, and autolysosomes was also found in autophagy activator group. CONCLUSION: Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation induce autophagy in PC12 cells, and autophagy inhibits cell apoptosis to play a protective role.

Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation; Autophagy; Cell apoptosis; PC12 cells

1000- 4718(2016)12- 2157- 06

2016- 08- 15

2016- 10- 08

河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 16967756D)； 河北省普通高校高層次人才科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No. GCC2014031)； 河北省2016年博士學(xué)位點(diǎn)科研能力建設(shè)項(xiàng)目(No. 169677128D)； 河北省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目; 河北省研究生創(chuàng)新資助項(xiàng)目

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.006

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