郭 可， 繆 紅， 王樹松， 程建軍， 商亞珍△

(1河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室， 承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000;2河北省計劃生育科學研究所，河北 石家莊 050071)

半枝蓮黃酮抑制復合Aβ所致大鼠皮層細胞NFT沉積及其調(diào)節(jié)機制*

郭 可1， 繆 紅1， 王樹松2， 程建軍1， 商亞珍1△

(1河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室， 承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000;2河北省計劃生育科學研究所，河北 石家莊 050071)

目的：探討半枝蓮黃酮(SBF)對復合Aβ，即β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)聯(lián)合三氯化鋁(AlCl3)和重組人類轉化生長因子-β1(RHTGF-β1)所致大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(NFT)沉積，tau蛋白磷酸化的影響及糖原合成激酶(GSK)3β和蛋白磷酸酶(PP)2A的調(diào)節(jié)機制。方法:雄性SD大鼠，腦室注射復合Aβ建立擬阿爾茨海默病(AD)大鼠記憶障礙模型，Morris水迷宮進行記憶障礙模型篩選，模型成功大鼠灌胃35、70和140 mg/kg的SBF 和140 mg/kg的陽性對照藥銀杏葉黃酮(GLF)，持續(xù)37 d。硝酸銀法測定大鼠大腦皮層的NFT，Western blot法檢測大鼠海馬、皮層中總tau蛋白、Ser199和Ser214位點磷酸化的tau蛋白水平以及相關GSK3β和PP2A蛋白的表達水平。RT-PCR法檢測海馬、皮層中GSK3β和PP2A的mRNA水平。結果:大鼠腦室注射復合Aβ可以引起大鼠腦內(nèi)NFT生成增加、Ser199和Ser214位點磷酸化tau蛋白、GSK3β蛋白和mRNA表達水平皆明顯增加，PP2A的蛋白和mRNA表達水平明顯降低。3種劑量的SBF灌胃37 d 不同程度地逆轉復合Aβ所致大鼠腦內(nèi)上述異常改變。GLF也表現(xiàn)出與SBF相似的結果。結論:SBF能夠抑制復合Aβ所致大鼠腦內(nèi)NFT沉積，該作用可能是通過抑制GSK3β活性、增加PP2A活性從而降低tau蛋白磷酸化而實現(xiàn)的。

半枝蓮黃酮； β淀粉樣蛋白25—35； 三氯化鋁； 重組人類轉化因子-β1； 神經(jīng)纖維纏結； tau 蛋白； 糖原合成激酶3β； 蛋白磷酸酶2A

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種多病因參與的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為進行性記憶障礙和行為異常改變[1]。一系列資料顯示，腦內(nèi)老年斑(senile plaque，SP)的沉積和神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)形成被認為是AD最主要的病理特征。神經(jīng)細胞內(nèi)NFT形成是由過度磷酸化的tau蛋白相互纏結而成，而tau蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)特有的一種微管相關蛋白，具有促進微管形成和穩(wěn)定微管結構的功能；當tau蛋白被過度磷酸化后就變成了對神經(jīng)具有很強毒性的雙螺旋絲(paired helical filament，PHF)和束狀細絲(straight filament，SF)[2]，PHF和SF再纏結沉積在神經(jīng)細胞的胞體和樹突從而形成了NFT，PHF、SF和NFT共同使神經(jīng)元受損、變性，干擾神經(jīng)信號傳導，從而出現(xiàn)神經(jīng)功能紊亂[3]。在AD的NFT中tau蛋白質有40個以上異常的磷酸化位點，而使這些位點磷酸化依賴于蛋白激酶糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)、細胞周期素依賴性激酶-5(cyclin-dependent kinase -5，CDK5)和cAMP依賴的蛋白激酶(cyclin AMP-dependent protein kinase，PKA)等與蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PP)1、PP2A和PP2B等之間的平衡[4]，當某些因素引起蛋白激酶與磷酸酯酶活性失衡時，就會出現(xiàn)tau蛋白異常磷酸化[5]。另外，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)對神經(jīng)系統(tǒng)也有較強的毒性，且腦內(nèi)Aβ增加亦可增加tau蛋白過度磷酸化，二者互相交惡進一步加劇神經(jīng)毒性，包括腦內(nèi)NFT大量形成，進而引發(fā)AD[6-7]。因此，正向調(diào)節(jié)蛋白激酶與蛋白磷酸酶活性，抑制tau蛋白過度磷酸化、阻止NFT在神經(jīng)細胞內(nèi)形成可能會成為治療AD的重要手段之一。研究發(fā)現(xiàn)，動物腦室投放Aβ肽段可以誘發(fā)動物神經(jīng)病理學改變，如果結合鋁和重組人類轉化生長因子-β1(recombinant human transforming growth factor-β1，RHTGF-β1)建立多因素神經(jīng)損害，更能接近模擬臨床神經(jīng)退行性病人的神經(jīng)病理生理特征。

半枝蓮黃酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是從半枝蓮(ScutellariabarbataD. Don)地上部分分離的黃酮類化合物，其主要成分是野黃芩苷[8]。以往研究已經(jīng)證明，SBF具有解熱、抗炎和抗氧化等多種藥理功效，對去勢大鼠記憶障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌及腦內(nèi)自由基異常變化、對Aβ25-35損傷星形膠質細胞及復合Aβ誘導的神經(jīng)線粒體凋亡通路異常都有明顯的正向作用[9-14]，但對Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和RHTGF-β1(復合Aβ)引起動物腦內(nèi)NFT形成、tau蛋白磷酸化及相關酶的影響尚未見報道。本實驗利用大鼠腦室注射復合Aβ建立神經(jīng)損害模型，探討SBF對復合Aβ所致大鼠腦內(nèi)NFT形成的影響及機制。

材 料 和 方 法

1 動物和藥品

清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(動物許可證號為150308，體重300～350 g)購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心。RHTGF-β1購于Prospect Biosystems；Aβ25-35購于上海強耀生物科技有限公司；SBF由承德醫(yī)學院中藥研究所提供，純度為83.29%；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術公司；蛋白 Marker購于Thermo ；抗PP2A抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；抗GSK3β抗體購于博士德生物技術公司；抗β-actin 抗體購于Bioword；抗tau、p-tau(Ser214)和p-tau(Ser199)的抗體購于Abcam；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購于中杉金橋生物技術有限公司；增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購于北京普利來基因技術有限公司；GSK3β、PP2A引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0亦購于寶生物工程(大連)有限公司；銀杏葉黃酮(Ginkgobilobaleaves flavonoids, GLF)由揚子江藥業(yè)提供。

2 方法

2.1 大鼠記憶障礙模型的建立和篩選 健康雄性SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，頭皮常規(guī)消毒后沿正中線縱向切開1.5 cm左右的切口，分離皮下組織及骨膜，標記前鹵點位置。于前鹵點后2.0 mm，矢狀縫右側旁開1.4 mm，深4.6 mm確認丘腦背側核位置，微量注射器注入RHTGFβ1 1 μL。于前鹵點后1.2 mm，失狀縫左側旁開2.0 mm，深4.0 mm確認側腦室位置，用鉆頭在該點鉆一直徑為0.2 mm孔，埋置導管，并用磷酸鋅水門汀固定導管，蓋上導管帽。手術第2 天上午開始，每天注射Aβ25-354 μL，連續(xù)注射14 d，每天下午注射1% AlCl33 μL，連續(xù)注射5 d。假手術組大鼠做相同手術，但腦室注射等容積的生理鹽水。

利用Morris大鼠水迷宮進行大鼠記憶障礙模型的動物篩選。所有大鼠在手術后第45 天進行水迷宮游泳訓練，每天訓練2次，以2次游泳成績均值作為大鼠當天的訓練成績，連續(xù)訓練4 天，以第4 天大鼠的訓練成績作為篩選模型成功的指標。水迷宮訓練第4 天，注射復合Aβ的每只大鼠找到平臺的潛伏期是A、假手術組大鼠找到平臺的平均潛伏期是B，其篩選率(screening ratio，SR)= (A-B)/B，當注射復合Aβ的大鼠篩選率大于0.2時，即為造模成功大鼠。

2.2 實驗動物分組及樣品制備 造模成功大鼠30只隨機分為模型組、3種劑量SBF藥物組和陽性對照藥GLF組，每組6只。藥物組大鼠分別每天灌胃35、70和140 mg/kg SBF 或140 mg/kg GLF 1次，連續(xù)37 d；模型組和假手術組大鼠灌胃等體積生理鹽水。動物于灌胃37 d后斷頭處死，一部分用濾紙吸干大腦表面血液，冰上選取大腦視交叉至大腦橫裂冠狀腦組織，將其置于4%甲醛中固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，用于硝酸銀染色測定NFT。剩余大鼠亦斷頭處死，輕輕剝離軟腦膜，在冰上分離海馬、皮層，置于1.5 mL無RNA酶的EP管中，置液氮中冷凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)Western blot法的篩選和RT-PCR等指標的測定。

2.3 硝酸銀染色法測定皮層NFT 將各組大鼠大腦石蠟包埋塊用石蠟切片機連續(xù)切片，片厚5 μm，常規(guī)脫蠟至水；在20%硝酸銀水溶液中避光浸染20 min；蒸餾水清洗；浸入銀氨液作用15 min后移入稀氨水中浸泡；切片浸入顯影工作液顯色，見神經(jīng)軸突呈黑色時即取出；稀氨水內(nèi)浸洗1 min；流水沖洗1 min；5%的硫代硫酸鈉處理2 min；流水沖洗5 min，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞內(nèi)NFT情況。鏡下(×400)選取6個視野，對每個視野中NFT進行計數(shù)，以平均值作為NFT細胞數(shù)。

2.4 Western blot法檢測海馬、皮層中總tau蛋白、Ser199和Ser214位點磷酸化tau、GSK3β和PP2A的蛋白表達 將各組大鼠凍存的海馬、皮層組織用勻漿器冰上勻漿，用RIPA裂解液提取相應組織總蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度。在蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，100 ℃ 沸水變性3 min。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中用100 V恒壓電泳分離蛋白，250 mA恒流濕轉膜2 h，將蛋白轉移至PVDF膜。5%牛血清蛋白封閉2 h，加入 I 抗4 ℃過夜，用TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min ，加入 II 抗孵育2 h，TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min。使用ECL化學發(fā)光劑進行曝光并顯影。膠片掃描后采用Quantity One 4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.5 RT-PCR檢測海馬、皮層中GSK3β和PP2A的mRNA表達 TRIzol法提取大鼠海馬、皮層組織總RNA，逆轉錄為cDNA。根據(jù)大鼠GenBank的基因序列進行引物設計。GSK3β的上游引物序列為5’-TTCTCGGTACTACAGGGCACCA-3’，下游引物序列為5’-GTCCTAGCAACAATTCAGCCAACA-3’；PP2A的上游引物序列為為5’-ACTCGTCGTACCCCAGACTACTTC-3’，下游引物序列為5’-CCCGATTCCATTAGGTCAACA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。按說明書在PCR儀中將引物加入cDNA 中進行序列擴增，反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 2 min。反應結束后取8 μL各擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳50 min后，取出凝膠，在紫外投射儀中確認PCR反應產(chǎn)物并拍攝圖像。采用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶GSK3β、PP2A與β-actin灰度的比值代表目的基因的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 模型復制與篩選

圖1顯示，隨著訓練天數(shù)的延長，所有大鼠找到平臺的潛伏期都逐漸降低，且假手術組大鼠找到平臺的潛伏期明顯低于腦室注射復合Aβ 大鼠找到平臺的潛伏期。根據(jù)第4天假手術組大鼠和每只腦室注射復合Aβ 大鼠的SR大于0.2計算，本實驗大鼠模型成功率為100%。有關大鼠學習記憶研究資料另文發(fā)表。

Figure 1.The successful model screening of the rats in memory impairment using Morris water maze.

圖1 復合Aβ組和假手術組大鼠Morris水迷宮篩選

2 SBF對復合Aβ所致大鼠神經(jīng)細胞NFT沉積的影響

與假手術組相比，模型組大鼠皮層中NFT細胞增加了4.82倍(P<0.01)。模型組大鼠皮層NFT沉積的細胞數(shù)顯著增多，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維增粗、紊亂，或密集呈團塊狀、編織狀，遍布全部細胞質并深入細胞突起，形成染色較深的拖尾狀。與模型組大鼠相比，35、70和140 mg/kg劑量SBF及GLF明顯減輕復合Aβ25-35所致神經(jīng)細胞內(nèi)NFT沉積(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.SBF reduced composited Aβ-induced NFT aggregation in the brain (Silver staining, ×400). Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖2 SBF對復合Aβ所致大鼠神經(jīng)細胞NFT沉積的影響

3 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中總tau蛋白表達的影響

圖3顯示與假手術組比較，模型組大鼠海馬、皮層總tau 蛋白的表達無顯著性差異。與模型組相比，灌胃35、70、140 mg/kg SBF及140 mg/kg GLF 37 d后，海馬、皮層總tau蛋白表達量無顯著性差異。

4 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層tau蛋白Ser199位點磷酸化水平的影響

圖4顯示與假手術組比較，模型組大鼠海馬、皮層中Ser199位點磷酸化tau 蛋白水平明顯上升(P<0.01)；灌胃35、70 mg/kg SBF 后，Ser199位點磷酸化tau 蛋白在海馬、皮層中的表達量與模型組相比無顯著性差異，而140 mg/kg SBF 使海馬、皮層中Ser199位點磷酸化tau 蛋白水平顯著降低(P<0.05)。陽性對照藥GLF組與模型組相比無顯著性差異。

5 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層tau蛋白Ser214位點磷酸化水平的影響

圖5顯示模型組大鼠海馬、皮層中Ser214位點磷酸化tau 蛋白表達較假手術組明顯升高(P<0.01)。給予SBF 37 d后，35 mg/kg SBF 組和模型組相比無顯著性差異，70、140 mg/kg SBF顯著降低了Ser214位點磷酸化tau 蛋白水平(P<0.05)。陽性對照藥GLF顯著降低大鼠海馬、皮層中Ser214位點磷酸化tau 蛋白表達量(P<0.05)。

Figure 3.The effect of SBF on total tau protein expression in the hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.

圖3 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中總tau蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of SBF on p-tau (Ser199) protein level in hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖4 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中Ser199位點磷酸化tau蛋白水平的影響

Figure 5. The effect of SBF on p-tau (Ser214) protein level in hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖5 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中Ser214位點磷酸化tau蛋白水平的影響

6 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層GSK3β蛋白表達的影響

由圖6可見模型組大鼠海馬、皮層中GSK3β的蛋白表達量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，35 mg/kg SBF組和模型組無顯著性差異，而70、140 mg/kg SBF和陽性對照藥140 mg/kg GLF顯著降低了大鼠海馬、皮層中GSK3β蛋白表達(P<0.05)。

7 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層PP2A蛋白表達的影響

與假手術組相相比，模型組大鼠海馬、皮層中PP2A的表達水平明顯降低(P<0.01)。而3劑量SBF均能顯著升高海馬、皮層中PP2A的表達(P<0.05)。陽性對照藥GLF也使大鼠海馬、皮層中PP2A蛋白表達顯著增加(P<0.05)，見圖7。

8 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中GSK3β mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬、皮層中GSK3β的mRNA表達量顯著增加(P<0.01)。35 mg/kg SBF組與模型組相比無顯著性差異，70、140 mg/kg SBF則使GSK3β的mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。陽性對照藥GLF亦能顯著降低大鼠海馬、皮層中GSK3β的mRNA表達(P<0.05)，見圖8。

9 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中PP2A mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬、皮層中PP2A的mRNA表達明顯降低(P<0.01)。35 mg/kg SBF組與模型組相比無顯著性差異，70、140 mg/kg SBF使PP2A的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。陽性對照藥GLF亦能顯著升高大鼠海馬、皮層中PP2A的mRNA表達(P<0.05)，見圖9。

討 論

AD 是老年人群的最常見病和多發(fā)病，發(fā)病機制不甚明確。目前認為AD是由多病因參與的神經(jīng)退行性疾病[1]，對此提出了多種假說，包括膽堿能假說、Aβ毒性學說、tau蛋白過度磷酸化學說、神經(jīng)炎癥學說和氧化應激學說等。其中最受認可的是Aβ毒性學說和tau蛋白過度磷酸化學說[15]，特別是Aβ

Figure 6.The effect of SBF on the protein expression of GSK3β in the hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖6 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中GSK3β蛋白表達的影響

Figure 7.The effect of SBF on the protein expression of PP2A in the hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05vsmodel group.

圖7 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中PP2A蛋白表達的影響

Figure 8. The effect of SBF on the mRNA expression of GSK3β in the hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖8 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中GSK3β mRNA表達的影響

Figure 9.The effect of SBF on the mRNA expression of PP2A in the hippocampus and cerebral cortex of the rats induced by composited Aβ. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖9 SBF對復合Aβ所致大鼠海馬、皮層中PP2A mRNA表達的影響

毒性學說中涉及的Aβ在腦內(nèi)沉積形成的SP和tau蛋白過度磷酸化形成的NFT被認為是AD發(fā)病的重要機制。然而，近年來有臨床研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Aβ水平與AD的嚴重程度并無明顯相關性[16-17]，而tau蛋白過度磷酸化形成NFT與AD患者臨床癡呆程度呈正相關，提示tau蛋白異常磷酸化是造成癡呆的直接原因[18]。NFTs 是由神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化形成的PHF和SF組成。PHF和SF具有極強的神經(jīng)毒性，它們主要沉積在軸突，也存在于神經(jīng)元胞體，大量PHF和SF聚合而成的NFT誘導神經(jīng)元受損、變性，干擾神經(jīng)信號傳導，進而導致神經(jīng)結構與功能障礙，包括認知功能的障礙。

tau蛋白作為在神經(jīng)系統(tǒng)中微管裝配的微管相關蛋白，在正常的生理條件下，tau蛋白磷酸化水平非常低，且與微管蛋白結合形成微管核心，并促進其它微管蛋白在此核心上進一步延伸形成微管，同時tau蛋白與微管的結合也穩(wěn)定了微管的結構與功能，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞軸突的物質運輸，包括神經(jīng)營養(yǎng)物質供應、能量傳遞和信號傳導等[19]。然而，在病理狀態(tài)下，tau蛋白多個位點被磷酸化，過度磷酸化的tau蛋白從微管中分離出來，致使細胞骨架崩解，大量的過度磷酸化的tau蛋白聚積形成了PHF和SF，進而纏繞形成NFT，最終導致神經(jīng)細胞發(fā)生退行性病變[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD的腦內(nèi)NTF中tau蛋白有多個絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)位點異常磷酸化，包括Ser199、Ser214、Thr231、Ser202、Ser404等。調(diào)節(jié)這些位點磷酸化的主要是蛋白激酶和蛋白磷酸酶。而在眾多酶中，GSK3β和PP2A對調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化發(fā)揮更為重要的作用[21]。

GSK3β是一種絲氨酸蘇氨酸磷酸激酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元極性建立和神經(jīng)突觸形成成熟軸突的過程中起重要作用[22]。GSK3β參與調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化，可使Ser199、Thr231、Ser396、Ser400、Ser413位點磷酸化[23]，形成NFT，致使動物出現(xiàn)空間記憶障礙和神經(jīng)損傷。

PP2A是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，存在于人腦的錐體神經(jīng)元中，由結構亞基-A亞基和催化亞基-C亞基先形成核心酶，然后再與調(diào)節(jié)亞基-B亞基組成異三聚體復合物-PP2A全酶[24]。PP2A是參與tau蛋白磷酸化的關鍵酶之一[25]，在tau蛋白去磷酸化中發(fā)揮著非常重要的作用。它能使難溶性PHF-tau蛋白上Ser214、Ser199、Ser202、Thr23、Ser404位點去磷酸化。一旦PP2A失去活性就不能發(fā)揮tau去磷酸化作用，最終導致NFT形成[26]。

NFT直接參與了AD的發(fā)生與發(fā)展，tau蛋白過度磷酸化是形成NFT的主要原因，而GSK3β、PP2A調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化。因此，任何能夠抑制tau蛋白過度磷酸化、調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的相關酶GSK3β與PP2A平衡，從而抑制NFT形成的方法都可能有利于AD的治療。本實驗利用大鼠腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和RHTGF-β1建立多因素記憶障礙和神經(jīng)損傷模型發(fā)現(xiàn)復合Aβ能夠干擾蛋白激酶GSK3β和磷酸酯酶PP2A表達，促進tau蛋白Ser199、Ser214位點過度磷酸化，從而誘導神經(jīng)細胞內(nèi)NFT形成。然而，灌胃不同劑量的SBF 37 d后發(fā)現(xiàn)，3劑量SBF不同程度地逆轉復合Aβ所致大鼠皮層細胞NFT沉積，在抑制Ser199、Ser214位點磷酸化tau蛋白水平和GSK3β的表達的同時升高PP2A表達。表明，SBF能夠抑制復合Aβ所致大鼠腦內(nèi)NFT的沉積，其抑制作用可能是通過抑制tau蛋白Ser199和Ser214位點的過度磷酸化、調(diào)節(jié)GSK3β和PP2A的活性來完成的。

tau蛋白過度磷酸化是AD患者神經(jīng)異常改變的重要標志，研究發(fā)現(xiàn)，AD腦內(nèi)總tau蛋白是由正常磷酸化的tau蛋白和過度磷酸化的tau蛋白組成，當過度磷酸化的tau蛋白表達增加時，正常磷酸化的tau蛋白表達則降低[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦室注射復合Aβ使大鼠腦內(nèi)Ser199和Ser214位點磷酸化tau蛋白表達明顯增加，而總tau蛋白水平未發(fā)生明顯改變，表明腦室注射復合Aβ不影響腦內(nèi)總tau蛋白合成，只是促進過度磷酸化tau蛋白的表達，該結果與文獻報道的D-半乳糖所致AD大鼠海馬中總tau蛋白與正常對照組無顯著差異相一致[28]。灌胃SBF后總tau蛋白表達較模型組沒有明顯變化，但使Ser199和Ser214位點磷酸化tau蛋白含量明顯降低，表明SBF能夠抑制tau蛋白過度磷酸化，其結果也與SBF能夠調(diào)節(jié)GSK3β和PP2A的活性有關。

本研究證實了SBF抑制NFT在腦內(nèi)的沉積機制可能與降低Ser199和Ser214位點磷酸化tau蛋白含量、抑制 GSK-3β和激活 PP2A活性有關。結合本研究室以往的研究，SBF對去勢大鼠記憶障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌及腦內(nèi)自由基異常變化、對Aβ?lián)p傷星形膠質細胞及復合Aβ誘導的神經(jīng)線粒體凋亡通路異常都有明顯的正向作用[9-14]，鑒于目前多個Aβ蛋白藥物臨床試用的失敗，及tau蛋白藥物研究中的成績[29]，SBF可能作為以tau蛋白為靶標的藥物治療如AD等神經(jīng)退行性疾病。

[1] Khairallah MI, Kassem LA. Alzheimer’s disease: Current status of etiopathogenesis and therapeutic strategies[J]. J Biol Sci, 2011, 14(4): 257-272.

[2] Giacobini E, Gold G. Alzheimer disease therapy moving from amyloid-β to tau[J]. Nat Rev Neurol, 2013,9(12): 677-686.

[3] Polydoro M, Acker CM, Duff K, et al. Age-dependent impairment of cognitive and synaptic function in the htau mouse model of tau pathology[J]. J Neurosci, 2009, 29 (34):10741-10749.

[4] Wang JZ, Xia YY, Grundke-Iqbal I, et al. Abnormal hyperphosphorylation of tau: sites, regulation, and molecular mechanism of neurofibrillary degeneration [J]. Alzheimers Dis, 2013, 33(Suppl1): S123-S139.

[5] Nakamura K, Greenwood A, Binder L, et al. Proline isomer-specific antibodies reveal the early pathogenic Tau conformation in Alzheimer’s disease[J]. Cell, 2012, 149(1): 232-244.

[6] Dong S, Duan Y, Hu Y, et al. Advances in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: a re-evaluation of amyloid cascade hypothesis[J]. Transl Neurodegener， 2012, 1(1): 1-18.

[7] Armstrong RA. The molecular biology of senile plaques and neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease[J]. Folia Neuropathol， 2009, 47(4):289-299.

[8] 鄭永紅， 韋曉瑜, 龍繼紅. 半枝蓮的研究進展[J]. 中草藥, 2010, 41(8): 1406-1408.

[9] 董永彩， 商亞珍. 半枝蓮的藥理學研究進展[J]. 承德醫(yī)學院學報, 2009, 26(1): 98-100.

[10]郗玉玲， 劉敏華， 張曉峰， 等. 半枝蓮黃酮對去卵巢大鼠記憶障礙的改善作用[J]. 中國老年學雜志, 2011, 31(2): 242-245.

[11]董永彩， 董雅潔， 龔玉芳， 等. 半枝蓮黃酮對去卵巢大鼠血脂水平的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志. 2010, 30(15): 1260-1263.

[12]范 悅， 吳曉光， 趙泓翔， 等. 半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質細胞NOS、HSP70及apoE異常表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2): 359-363.

[13]趙泓翔， 郭 可， 崔亞迪， 等. 半枝蓮黃酮對復合Aβ25 -35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL 及 Bak異常的干預作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(12): 2262-2266.

[14]郭 可， 吳曉光， 崔亞迪， 等. 半枝蓮黃酮對復合Aβ所致大鼠皮層細胞凋亡抑制作用及線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)機制[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2015, 35(20): 1994-1999.

[15]Wang JZ, Grundke-Iqball I, Iqbal K. Kinases and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofibrillary degeneration[J]. Eur J Neurosci, 2007, 25(1): 59-68.

[16]Imbimbo BP, Giardina GA. Gamma-secretase inhibitors and modulators for the treatment of Alzheimer’s disease: Disappointments and hopes[J]. Curr Top Med Chem, 2011, 11(12): 1555-1570.

[17]Ryan JM, Grundman M. Anti-amyloid-beta immunotherapy in Alzheimer’s disease: ACC-001 clinical trials are ongoing[J]. J Alzheimers Dis, 2009, 17(2): 243.

[18]王建枝. Tau蛋白在老年性癡呆癥神經(jīng)細胞退行性變性中的作用[J]. 神經(jīng)損傷與功能重建，2006, 1 (1): 1-3.

[19]Kuznetsov IA, Kuznetsov AV. What tau distribution maximizes fast axonal transport toward the axonal synapse[J]. Math Biosci, 2014, 253: 19-24.

[20]Del Ser T, Steinwachs KC, Gertz HJ, et al. Treatment of Alzheimer’s disease with the GSK-3 inhibitor tideglusib: A pilot study[J]. J Alzheimers Dis, 2013, 33(1): 205-215.

[21]許 杰， 溫世榮，于艷紅， 等. Tau蛋白在阿爾茨海默病中的作用[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2015, 15(3): 573-575.

[22]Forlenza OV, e-Paula VJ, Diniz BS. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders[J]. ACS Chem Neurosci, 2014, 5(6):443-450.

[23]Li DW, Liu ZQ, Chen W, et al. Association of glycogen synthase kinase-3β with Parkinson’s disease[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(6):2043-2050.

[24]Van Eersel J, Ke YD, Liu X, et al. Sodium selenate mitigates tau pathology, neurodegeneration, and functional deficits in Alzheimer’s disease models[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(31):13888-13893.

[25]李雪蓮， 楊翠翠， 張 蘭. 蛋白磷酸酶2A活性調(diào)節(jié)機制及其在阿爾茨海默病中的作用[J]. 國際藥學研究雜志, 2016, 43(1): 39-43.

[26]Liu R, Zhou XW, Tanila H, et al. Phosphorylated PP2A(tyro-sine 307)is associated with Alzheimer neurofibrillary pathology[J]. J Cell Mol Med, 2008, 12(1): 241-257.

[27]萬 章， 王春梅. tau蛋白過度磷酸化在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的作用[J]. 醫(yī)學研究生學報, 2010, 23(5): 539-542.

[28]張智華， 王秀蓮， 呂銀娟， 等. 石菖蒲-遠志藥對不同組分對阿爾茨海默病模型大鼠海馬Tau蛋白及其Ser396位點磷酸化的影響[J]. 醫(yī)藥導報, 2016, 35(5): 448-453.

[29]Duan Y, Dong S, Gu F, et al. Advances in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: Focusing on Tau-mediated neurodegeneration[J]. Trans Neurodegener, 2012, 1(1): 24.

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ

GUO Ke1, MIAO Hong1, WANG Shu-song2, CHENG Jian-jun1, SHANG Ya-zhen1

(1HebeiProvinceKeyResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineAgainstDementia,HebeiProvincialKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopment,InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiResearchInstituteforFamilyPlanning,Shijiazhuang050071,China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

AIM: To investigate the effects ofScutellariabarbataflavonoids (SBF) on neurofibrillary tangle (NFT) aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of glycogen synthase kinase (GSK) 3β and protein phosphatase (PP) 2A in the rats induced by amyloid β protein 25-35 (Aβ25-35) in combination with AlCl3and recombinant human transforming growth factor (RHTGF)-β1(composited Aβ). METHODS: The male SD rats were used to establish the simulated Alzheimer disease (AD) model by intracerebroventricular injection of composited Aβ. The Morris water maze was applied for screening the successful model rats with learning and memory deficits. The successful model rats were daily and orally administrated with SBF at doses of 35, 70 and 140 mg/kg or positive control drugGinkgobilobaleaves flavonoids (GLF) at 140 mg/kg for 37 d. The silver nitrate staining was used to determine the cortical NFT. The protein levels of total tau, phosphorylated protein of tau at Ser199 and Ser214 sites, GSK3β and PP2A in hippocampus and cortex were determined by Western blot. The mRNA expression of GSK3β and PP2A in the hippocampus and cortex was detected by RT-PCR. RESULTS: Compared with sham group, the cell number of positive NFT with silver nitrate staining in model rat cerebral cortex was significantly increased. The protein levels of phosphorylated tau protein at Ser199 and Ser214 sites, GSK3β in the hippocampus and cerebral cortex in the model rats dramatically elevated, and PP2A was marked decreased as compared with the sham group rats. Meanwhile, the mRNA expression of GSK-3β significantly increased but PP2A was decreased. However, these above abnormalities were differently attenuated by treating with SBF at different doses or GLF at 140 mg/kg for 37 d. CONCLUSION: SBF suppresses the NFT aggregation by inhibition of the regulatory functions of GSK-3β and PP2A, thus reducing the phosphorylation of tau protein.

Scutellaria barbata flavonoids; Amyloid β25-35; AlCl3; Recombinant human transforming growth factor-β1; Neurofibrillary tangle; tau protein; Glycogen synthase kinase 3β; Protein phosphatases 2A

1000- 4718(2016)12- 2147- 10

2016- 04- 07

2016- 09- 14

河北省自然科學基金資助項目(No. C2009001007； No. H2014406048)；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(No. 05027); 河北省高校重點學科建設項目

R363; R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.005

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0314-2290616； E-mail: shangyz@sina.com