摘要：目的 評(píng)價(jià)納米銅IUD 和TCu220C IUD的體外細(xì)胞毒性。方法 采用納米銅材料IUD和TCu220C IUD，用細(xì)胞完全培養(yǎng)液做浸提介質(zhì)分別浸提24 h、72 h制備相應(yīng)浸提液，與L929細(xì)胞接觸培養(yǎng)，通過采取MTT（四唑鹽）比色法測(cè)定細(xì)胞毒性和倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)來進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果 納米銅IUD細(xì)胞毒性分級(jí)為1～2級(jí)，TCu220C IUD細(xì)胞毒性分級(jí)為2～4級(jí)。結(jié)論 納米銅IUD較TCu220C IUD對(duì)細(xì)胞生長情況影響小，細(xì)胞相容性更好。

關(guān)鍵詞：納米銅IUD； TCu220C IUD； 細(xì)胞毒性；MTT

Abstract：Objective To evaluate the cytotoxicity of nano-copper IUDand TCu220C IUD with mouse fibroblast cells. Methods Leaching liquors of nano-copper IUD and TCu220C IUD were prepared with Cell culture fluid. The proliferation of L-929 cells was measured by tetrazolium colorimetric assay （MTT）， and the morphology of the cells were observed by inverted microscope. Results The cytotoxicity of nano-copper IUD group was 1～2， but the TCu220C group was2～4. Conclusion Nano-copper IUD present more cytocompatibility.

Key words：Nano-copper IUD； TCu220C IUD；Cytotoxicity； MTT

宮內(nèi)節(jié)育器由于具有長效、簡便、經(jīng)濟(jì)、避孕效果好、取出后能很快恢復(fù)生育能力等特點(diǎn)，深受廣大育齡婦女的歡迎[1]。我國使用最多的宮內(nèi)節(jié)育器是含銅節(jié)育器[2]。但目前市面上的含銅宮內(nèi)節(jié)育器均存在置入后出血、疼痛等副反應(yīng)，進(jìn)而影響宮內(nèi)節(jié)育器的被接受性和使用年限。低密度聚乙烯/納米銅復(fù)合材料是采用物理和化學(xué)方法研制出的一種新型宮內(nèi)節(jié)育器材料，本文采用MTT法比較低密度聚乙烯/納米銅復(fù)合材料IUD（簡稱納米銅IUD）和TCu220C IUD的細(xì)胞毒性，為新型含銅宮內(nèi)節(jié)育器的應(yīng)用和推廣提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料 納米銅IUD（納米銅含量為30%的變異T型IUD），由華中科技大學(xué)材料與工程學(xué)院提供；對(duì)照材料TCu220C IUD，無錫市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；細(xì)胞株：小鼠成纖維細(xì)胞L-929，購買于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保存中心；RPMI1640培養(yǎng)基（改良型）（Hyclone 美國），小牛血清（GIBCO 美國），胰蛋白酶（Amresco），MTT粉劑 （Sigma 美國），二甲基亞楓DMSO （Sigma 美國）。

1.2浸提液的制備 將納米銅IUD和TCu220C IUD紫外線無菌[3]處理以后，依照GB/T16886.12浸提液的制備標(biāo)準(zhǔn)（樣品質(zhì)量/浸提液=0.2g/ml），用FBS- RPMI1640培養(yǎng)液作為浸提介質(zhì)，分別放入37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h、72 h，制備浸提液，過濾備用。陰性對(duì)照溶液：FBS- RPMI1640培養(yǎng)液。陽性對(duì)照溶液：濃度為 6.4g/ml的苯酚溶液。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)[4] 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞接種密度為5000個(gè)/孔[4]接種于96孔板上，每孔100 μl，每板接種60個(gè)孔，重復(fù)接種3板，待細(xì)胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，0.01 mol/L的PBS清洗后，分別加入納米銅和TCu220C IUD制備的浸提液、陽性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl。在加入干預(yù)溶液后的第1 d，第3 d，第5 d分別取出一板，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，再放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉原培養(yǎng)液，用0.01 mol/L的PBS清洗后每孔加入150 μl DMSO，室溫避光15 min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞光密度值（OD值），實(shí)驗(yàn)波長為492 nm，參比波長630 nm，計(jì)算各濃度光密度值（OD值）的平均值。

按以下公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。細(xì)胞增值率與細(xì)胞毒性的關(guān)系見表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0級(jí)～1級(jí)的為合格，結(jié)果為2級(jí)反應(yīng)的應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，結(jié)果為3～5級(jí)的為不合格[4]。

2 結(jié)果

2.1倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察 加干預(yù)液前用倒置顯微鏡觀察，各孔細(xì)胞貼壁伸展，形態(tài)正常，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形。加入干預(yù)液培養(yǎng)后24 h觀察，陰性對(duì)照細(xì)胞形態(tài)良好，為長梭形和多角形，可見圓形分裂細(xì)胞，表明細(xì)胞生長旺盛（圖1）；陽性對(duì)照組存留細(xì)胞多數(shù)形態(tài)異常，核皺縮或溶解，偶見細(xì)胞影像及崩解產(chǎn)物（圖2）。用72 hTCu220C浸提液干預(yù)24 h可見細(xì)胞見少量絮狀物，貼壁的細(xì)胞約占觀察視野的75%～85%，部分貼壁細(xì)胞發(fā)生變形，高倍鏡下可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多黑色顆粒，部分細(xì)胞體積變大或皺縮，有胞質(zhì)溢出（圖3）；第3 d，第5 d貼壁細(xì)胞約占整個(gè)視野的35%～45%。72 h TCu220C浸提液干預(yù)后有少量漂浮的死細(xì)胞和絮狀物，貼壁細(xì)胞中有約30%的細(xì)胞呈圓形。24 h納米銅浸提液干預(yù)后有10%～20%的細(xì)胞呈圓形，偶可見漂浮死細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量有增加但增加幅度不及陰性組。MTT染色后， 陰性對(duì)照組可見大量密集的藍(lán)紫色針狀結(jié)晶（圖4），陽性對(duì)照組僅有少量結(jié)晶沉積。

2.2不同浸提液中細(xì)胞增殖率及毒性分級(jí) 不同組別的細(xì)胞相對(duì)增殖率和毒性評(píng)級(jí)結(jié)果見表2。納米銅浸提72 h干預(yù)5 d發(fā)現(xiàn)有輕度細(xì)胞毒性，TCu220C浸提24 h、72 h時(shí)細(xì)胞毒性分別為2～3級(jí)和3～4級(jí)。

3 討論

L929是具有傳代容易、繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、易儲(chǔ)存，1982年美國質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)將L929推薦為細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞。本試驗(yàn)采取MTT比色法是一種新的快速評(píng)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色法，目前在國際上已廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)，腫瘤學(xué)和醫(yī)用生物材料的生物相容性評(píng)價(jià)[5]。

含銅IUD的避孕效果主要依賴于銅在宮腔內(nèi)腐蝕而釋放出的銅離子[2]。所以銅的腐蝕會(huì)影響到含銅IUD的避孕效果和長期使用。有研究表明，納米銅材料中銅的腐蝕與含銅IUD中銅的腐蝕過程是相同的[6]，而且本實(shí)驗(yàn)所使用的納米銅材料中納米銅粉是均勻分布在復(fù)合材料內(nèi)部的，外界溶液通過復(fù)合材料中的微孔進(jìn)入材料內(nèi)部與納米銅接觸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生銅離子，銅離子進(jìn)入溶液后發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[7]，而不是納米銅直接作用于細(xì)胞[8]，所以納米銅材料浸提液中銅對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制與TCu220C浸提液中銅對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制是一樣的，兩者具有可比較的條件。

前期研究[9，10]提示金屬銅釋放的銅離子對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性，含銅 IUD 因含銅面積不同，其表現(xiàn)出來的細(xì)胞毒性也不同，含銅面積越大，細(xì)胞毒性越大[6，10]。而納米銅材料的特殊結(jié)構(gòu)使得材料中銅顆粒的腐蝕速率是可控的，在理論上不僅避免了一般的含銅IUD在置器初期發(fā)生的爆釋現(xiàn)象[11]，而且對(duì)細(xì)胞毒性的影響也是可以控制的，所以在臨床應(yīng)用前景上納米銅材料更有優(yōu)勢(shì)。

本次的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，納米銅IUD浸提液的細(xì)胞毒性處于1～2級(jí)，TCu220C IUD細(xì)胞毒性分級(jí)為2～4級(jí)，說明納米銅IUD對(duì)細(xì)胞生長情況影響較TCu220C IUD小，細(xì)胞相容性更好，可以對(duì)其在臨床上的使用起到可靠的指導(dǎo)作用。

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編輯/周蕓霏