摘要：用索氏法氨水-氯仿提取得到烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]總生物堿，采用p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和角叉菜膠致后足跖腫脹法、小鼠熱板法和乙酸致小鼠扭體法等方法來評估烏藥總生物堿的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明，烏藥總生物堿有緩解p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹及角叉菜膠致后足跖腫脹的效果，能顯著減少小鼠在熱板上舔后足的次數(shù)和減少乙酸致小鼠扭體的次數(shù)，鎮(zhèn)痛效果顯著。

關(guān)鍵詞：烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]；總生物堿；抗炎；鎮(zhèn)痛

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5101-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.053

Abstract： The anti-inflammatory and analgesic effects of total alkaloids extracted by Soxhlet method with the ammonia and chloroform as the solvent，were observed by p-xylene-induced mice ear swelling method，carrageenan-induced paw swelling method，hot plate method and aceti cacid writhing method in mice. Results showed that，the total alkaloids from Lindera Radix could obviously relieve mice ear swelling and carrageenan-induced paw swelling，significantly reduce the number of the mice licking hind and decrease mice acid-induced writhing times. The analgesic effect of Linderae Radix was remarkable.

Key words： Linderae Radix； total alkaloids； anti-inflammatory； analgesia

烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]系樟科（Lauraceae）山胡椒屬（Lindera）植物，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西等地。藥用部位主要為直根及連珠狀塊根[1]，為傳統(tǒng)的常用理氣止痛藥，具有溫腎散寒的功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏藥具有廣泛的藥理活性[3]。烏藥主要成分為多種異喹啉類生物堿、揮發(fā)油、呋喃倍半萜、酚類、有機酸、黃酮等化學(xué)成分[4]，異喹啉類生物堿、呋喃倍半萜、烏藥醚內(nèi)酯與烏藥內(nèi)酯等為烏藥的特征性化學(xué)成分[5，6]。本試驗主要以烏藥直根及連珠狀塊根為主要藥用部位，用索氏法氨水-氯仿提取，經(jīng)真空干燥得到烏藥總生物堿[7]，并用烏藥總生物堿（TALR）進行抗炎鎮(zhèn)痛研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

索氏提取器、98-1-C型數(shù)顯控溫電熱套（天津泰斯特）、DZF6050型電熱真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、N-1000v-w型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA日本東京理化器械株式會社）、HH-4型電熱恒溫水浴鍋（上海市百典儀器廠）、FA2004型電光分析天平（上海精密科學(xué)儀器廠）。

1.2 主要試劑

氨水、氯仿、碘化鉀、鹽酸、乙酸、對二甲苯等，均為國產(chǎn)分析純（AR）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；阿司匹林（南京白敬宇制藥有限公司）；角叉菜膠（Sigma公司），注射用水配制1%角叉菜膠混懸液，在冰箱4 ℃條件下保存；其他試驗用水為重蒸餾水。

試驗所用樣品采自江西信豐，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院彭金年博士鑒定為烏藥。

1.3 試驗動物

昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003，合格證號：No.43004700015959。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏法氨水-氯仿提取烏藥總生物堿

稱取經(jīng)干燥和粉碎過的烏藥直根與塊根500 g，分為若干份，均用適量氨水拌勻，濕潤密閉放置30 min，分次裝入索氏提取器，加三氯甲烷用電熱套加熱回流提取3 h，對提取液TLC（薄層色譜），并進行碘化鉀試驗至不顯紅色為止，稍冷過濾，將各份濾液合并，得濾液Ⅰ，將濾液Ⅰ在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮三氯甲烷提取液，濃縮液用1%的鹽酸純化，過濾，得濾液Ⅱ，再向濾液Ⅱ加氨水至pH為9，密閉，靜置過夜，過濾，得烏藥總生物堿（TALR），真空干燥，干燥品研成細粉，將其用重蒸水在100 mL容量瓶中配制成混懸液，得烏藥總生物堿溶液TALR1；搖勻，用移液管移取50 mL TALR1溶液至100 mL容量瓶中，配制成TALR2溶液；搖勻，再用移液管向TALR2中移取50 mL溶液至100 mL容量瓶中，配制成TALR3溶液。

2.2 烏藥總生物堿（TALR）對p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹的試驗[8，9]

取健康、體質(zhì)量18～22 g的雄性昆明種小鼠50只，每組10只，隨機分為5組，小鼠空白組灌胃（ig）給生理鹽水0.2 mL/10 g體質(zhì)量，陽性藥物組灌胃（ig）給阿司匹林2 mg/10 g體質(zhì)量，試驗組分別灌胃（ig）給烏藥總生物堿TALR1、TALR2、TALR3各0.2 mL/10 g體質(zhì)量，相同時間段，每天1次，連續(xù)給藥 5 d，末次給藥60 min后，在乙醚麻醉狀態(tài)下，每只小鼠輕涂對二甲苯于左耳廓正反兩面致炎，右耳不涂為正常耳作對照，4 h后將小鼠麻醉頸椎脫臼致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳，用直徑9 mm的鋒利打孔器在左右耳相同部位打下圓耳片，分別用電光分析天平稱重，以每只小鼠的左右耳片質(zhì)量之差作為耳廓腫脹程度，計算平均腫脹度和標(biāo)準(zhǔn)差，并以平均腫脹度計算腫脹抑制率，見表1。

腫脹度=用藥左耳片質(zhì)量-未用藥右耳片質(zhì)量

腫脹抑制率=

由表1可知，索氏法氨水-氯仿提取所得烏藥總生物堿（TALR），與空白生理鹽水組相比，TALR1、TALR2對p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用（P﹤0.01），腫脹抑制率達46.28%和40.76%，表明較高濃度的烏藥總生物堿抗炎作用明顯。

2.3 烏藥總生物堿（TALR）對角叉菜膠致小鼠后足跖腫脹的試驗[8-10]

給藥處理同“2.2”，末次給藥60 min后，在乙醚麻醉狀態(tài)下，用26號針頭注射器向每只小鼠右后足跖部皮下進針注入1%角叉菜膠混懸液0.05 mL致炎，左足不注射角叉菜膠為正常足作對照，5 h后，將小鼠在麻醉狀態(tài)下頸椎脫臼致死，于踝關(guān)節(jié)處剪下左右后足，分別用電光分析天平稱重，以每只小鼠的左右后足質(zhì)量之差作為足腫脹程度，計算平均腫脹度和標(biāo)準(zhǔn)差，并用平均腫脹度計算腫脹抑制率，見表2。

腫脹度=用藥右后足質(zhì)量-未用藥左后足質(zhì)量

腫脹抑制率=

由表2可知，索氏法氨水-氯仿提取所得烏藥總生物堿（TALR），與空白生理鹽水組相比，TALR1、TALR2均能顯著抑制因角叉菜膠所致小鼠右后足跖的腫脹，腫脹抑制率為42.49%和36.12%。

2.4 物理刺激法對小鼠舔足反應(yīng)的試驗[8，9]

先將熱板容器置于恒溫水浴中，加熱至（55±0.5） ℃，取健康、體質(zhì)量18～22 g的雌性昆明種小鼠，逐一將其放于熱板上，分別測每只小鼠的正常痛閾值：從小鼠放于熱板上至出現(xiàn)其舔后足反應(yīng)止的潛伏時間為正常痛閾值（s），間隔30 min，再測定第2次，以2次痛閾值的平均時間為每只小鼠給藥前的正常痛閾值。將潛伏時間小于5 s或大于30 s、或跳躍的小鼠剔除。取測定痛閾值合格的小鼠40只，每組8只，隨機分為5組，空白組灌胃（ig）給生理鹽水0.2 mL/10 g體質(zhì)量，陽性藥物組灌胃（ig）給阿司匹林2 mg/10 g體質(zhì)量，試驗組分別灌胃（ig）給烏藥總生物堿TALR1、TALR2、TALR3各0.2 mL/10 g體質(zhì)量，相同時間段，每天1次，連續(xù)給藥5 d，各組最后一次給藥后于30、60、90 min測定小鼠的痛閾值，若小鼠在熱板上60 s無舔后足反應(yīng)，立即取出，以60 s計，見表3。由表3可知，烏藥總生物堿（TALR）能明顯延遲小鼠舔后足的時間，小鼠的痛閾值增大，即鎮(zhèn)痛效果明顯。

2.5 化學(xué)試劑刺激法對小鼠扭體反應(yīng)的試驗[8，9]

給藥處理同“2.2”，末次給藥60 min后，每鼠腹腔注射（ip）0.6%乙酸0.1 mL/10 g體質(zhì)量，從注射乙酸后開始觀察小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起等扭體反應(yīng)，并記錄從注射乙酸后15 min內(nèi)各鼠扭體的次數(shù)，以此計算烏藥總生物堿（TALR）對小鼠扭體反應(yīng)的疼痛抑制率，作為評判烏藥總生物堿（TALR）鎮(zhèn)痛的效果標(biāo)準(zhǔn)，見表4。由表4可知，烏藥總生物堿（TALR），可明顯抑制乙酸所致小鼠的扭體次數(shù)，即與空白生理鹽水組相比有顯著差異，特別是TALR1和TALR2與空白生理鹽水組比較呈極顯著性（P﹤0.01）。

疼痛抑制率=

3 小結(jié)

烏藥用不同溶劑提取所得產(chǎn)物成分相差較大，本試驗用索氏法氨水-氯仿提取后，經(jīng)濃縮干燥得烏藥總生物堿（TALR），由于烏藥總生物堿為含酚羥基類的異喹啉類生物堿，所以在提取、濃縮、干燥及試驗過程中盡可能用氮氣保護，并貯存于棕色容器。

試驗采用的是生理鹽水作空白組、阿司匹林作陽性對照組、以烏藥總生物堿不同濃度TALR1、TALR2、TALR3對p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致小鼠后足跖腫脹等進行抗炎試驗，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，烏藥總生物堿抗炎效果明顯；物理熱板法致小鼠舔后足反應(yīng)和化學(xué)試劑乙酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗結(jié)果表明，烏藥總生物堿鎮(zhèn)痛作用顯著。在烏藥總生物堿低劑量組TALR3的試驗過程中，抗炎作用效果略差。

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