摘要：以兜唇石斛試管苗為材料，研究組織培養(yǎng)過程中試管苗的生長狀況，通過測定組織培養(yǎng)過程中分化苗合成的脯氨酸含量來確定兜唇石斛的耐鹽性。最終得到最適合兜唇石斛試管苗生長的培養(yǎng)基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA；進行耐鹽培養(yǎng)時得到脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。

關鍵詞：兜唇石斛；耐鹽性；脯氨酸

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5095-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.051

Abstract： The seedlings of Dendrobium aphyllum were used as materials to study the propagation and salt tolerance in the tissue culture. The content of the proline from seedlings could determine salt tolerance of Dendrobium aphyllum. Finally，the most suitable medium for Dendrobium aphyllum seedlings to grow was： MS+20 g/L D（+）-Sucrose+6.5 g/L Agar+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA. Salt tolerance culture medium：MS+20 g/L D（+）-Sucrose+6.5 g/L Agar+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl.

Key words： Dendrobium aphyllum； salt tolerance； proline

兜唇石斛（Dendrobium aphyllum）屬于蘭科（Orchidaceae）植物，分布于中國長江以南（廣西、云南、貴州）、尼泊爾、錫金、不丹、印度東北部至中南半島和馬來西亞[1]；別名無葉石斛大光節(jié)、水草石斛，生長在400～1 500 m的疏林樹干上或山谷巖石上[2]。

兜唇石斛有重要的觀賞價值和較高的藥用價值。近年來，由于蘭花愛好者收藏數量增加、森林砍伐嚴重、藥用開發(fā)過多等因素，自然界中石斛蘊藏量逐年減少[3]。且石斛生長速度緩慢，繁殖率低，許多優(yōu)良品種無法大量繁殖以滿足日益增長的市場需求。針對這一問題，利用組織培養(yǎng)技術可以擴大石斛蘭生產規(guī)模。目前生產上多利用設施農業(yè)通過溫室栽培培養(yǎng)大量石斛，而溫室的環(huán)境相對封閉，室內的溫度較高，導致基質水分大量蒸發(fā)，鹽分含量增高，不利于兜唇石斛生長發(fā)育。雖然兜唇石斛已經成為市場流通品種，但是目前大多數學者研究了其的化學成分[4]和多糖含量[5]等，其耐鹽性方面相關的研究尚未見報道。因此，本試驗通過測定不同NaCl濃度下兜唇石斛組培苗葉片中脯氨酸的含量，研究組培過程中兜唇石斛的耐鹽性，為石斛抗逆栽培和抗性育種研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為兜唇石斛試管苗，取自天津農學院農學與資源環(huán)境學院植物細胞工程研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 兜唇石斛的培養(yǎng) ①篩選最適培養(yǎng)基。取兜唇石斛種苗接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+6-BA+NAA。如表1所示，將6-BA和NAA濃度分別設定4個梯度，6-BA的梯度為0、1、2、3 mol/L，NAA的梯度為0、0.2、0.4、0.6 mol/L。一共16組配比，每組重復5次，找出兜唇石斛試管苗生長所需的最適培養(yǎng)基。②種苗的擴繁。兜唇石斛的培養(yǎng)過程中，依據兜唇石斛的生長長勢得到兜唇石斛最適培養(yǎng)基配方，作為種苗擴繁培養(yǎng)基。為保證種苗耐鹽培養(yǎng)所需要的種苗數，共培養(yǎng)65瓶，每瓶接種3個種苗。

1.2.2 兜唇石斛的耐鹽培養(yǎng) ①兜唇石斛種苗的耐鹽培養(yǎng)。在兜唇石斛最適培養(yǎng)基MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA的基礎上加入12個濃度梯度的NaCl，分別為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%，配制成耐鹽培養(yǎng)基。將擴繁的無菌兜唇石斛種苗接種到耐鹽培養(yǎng)基中，每個濃度重復5次。②兜唇石斛種苗的耐鹽性測定。首先，制作脯氨酸標準曲線。按照脯氨酸含量的測定方法[6，7]，以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。其線性回歸方程為：y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2）。其次，樣品測定。稱取葉片0.5 g放到具塞試管中（3次重復），加入5 mL 3%的5-磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，冷卻后吸取上清液。具塞試管中加入2 mL上清液，加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，進行沸水浴30 min。冷卻后向具塞試管中加入4 mL的甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置分層后吸取甲苯層，以甲苯溶液為對照，在分光光度計520 nm波長下比色，測得各個鹽濃度下試管苗中脯氨酸的吸光度。

2 結果與分析

2.1 兜唇石斛的培養(yǎng)

經過2個月的觀察，不同生長調節(jié)劑配比兜唇石斛的生長狀況如表2，不同配比的生長調節(jié)劑培養(yǎng)的兜唇石斛真菌污染率為6.25%。從表2中可以看出，H到M號生長調節(jié)劑配比條件下種苗的長勢較好，其中最好的為L號，故兜唇石斛的最適培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA。

2.2 兜唇石斛的耐鹽培養(yǎng)

1）耐鹽性分析。兜唇石斛的耐鹽性是通過測定種苗葉片中的脯氨酸含量來確定的，在逆境條件下，植物體內脯氨酸的含量顯著增加。脯氨酸是植物體內的一種重要調節(jié)物質[8]，植物通過不斷積累脯氨酸來適應不同的鹽堿環(huán)境。因此不同濃度的NaCl脅迫下，兜唇石斛苗體內的脯氨酸含量也會有變化。

2）不同NaCl含量對兜唇石斛脯氨酸含量的影響。用分光光度計測量值也會存在誤差，所以在測量種苗中脯氨酸含量之前，先做脯氨酸的標準曲線，得到脯氨酸濃度（x）與吸光度（y）的回歸方程：y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2）。之后用分光光度計測定種苗脯氨酸提取液的吸光度，代入回歸方程就可以得出不同NaCl濃度下兜唇石斛種苗體內所含的脯氨酸濃度（圖2）。

是實際測出的不同鹽濃度處理下兜唇石斛試管苗葉片脯氨酸含量的變化圖。由圖3看出，脯氨酸含量在第7個處理出現(xiàn)峰值并依次向兩邊降低，第7個處理的脯氨酸含量最高，說明第7個處理的兜唇石斛種苗耐鹽性最高，即脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+ 2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。

3 小結與討論

MS培養(yǎng)基設計于1962年，具有高含量的氮、鉀，高濃度的無機鹽，尤其是硝酸鹽的用量很大，同時含有一定數量的銨鹽。營養(yǎng)豐富，是目前應用最廣泛的培養(yǎng)基[9]。外源生長調節(jié)劑對于兜唇石斛組織培養(yǎng)有著顯著的影響，6-BA是細胞分裂類生長調節(jié)劑，對于細胞的分化及出芽有著必要的作用[10]。NAA是生長素類生長調節(jié)劑，對于植物體的生根有重要作用[11]。在MS培養(yǎng)基的基礎上加入適宜濃度的6-BA和NAA，可使組培苗生長得更快更好。由表3可看出，H到M號培養(yǎng)基的生長調節(jié)劑配比條件下組培苗的長勢較好，其中最好的為L號，因此最適合兜唇石斛組培苗生長的培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA。在這個生長調節(jié)劑配比的培養(yǎng)條件下組培苗的長勢最好，葉色由剛開始培養(yǎng)的淡綠變?yōu)樯罹G，植株健壯且無病害。

脯氨酸是一種小分子滲透物質，是水溶性最大的氨基酸，許多植物在受到逆境脅迫時都能積累高水平的脯氨酸。有學者把植物在逆境脅迫條件下脯氨酸含量的變化作為抗脅迫性的重要指標，如李國樹等[12]的研究表明，脯氨酸含量可以作為鐵皮石斛組織培養(yǎng)中的一個生理指標。土壤鹽漬化是農作物生產中最嚴重的非生物逆境之一，選育耐鹽作物，提高作物對鹽漬環(huán)境的適應能力，是減輕土壤鹽漬化危害的重要途徑之一。因此，研究植物耐鹽性是植物耐鹽育種的基礎。植物的耐鹽性與植物體內生成的脯氨酸有一定的關系，且迄今為止仍有爭議。有的學者認為脯氨酸的積累與抗脅迫性之間缺少相關性，似乎只是脅迫的結果[13-14]；更多學者研究表明，脯氨酸積累與鹽脅迫呈顯著的正相關[15-18]。本試驗在兜唇石斛的培養(yǎng)基中分別添加了不同濃度的NaCl，在鹽脅迫60 d的情況下，其脯氨酸含量的測定數據表明，當NaCl濃度在0.0%～0.6%，測定脯氨酸含量呈上升趨勢，說明脯氨酸積累與鹽脅迫呈正相關；當NaCl濃度在0.6%～1.1%，測定脯氨酸含量呈下降趨勢，說明脯氨酸積累與鹽脅迫呈負相關。兜唇石斛經過耐鹽培養(yǎng)得到脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。在這個NaCl濃度下兜唇石斛的種苗體內脯氨酸含量達到最高值，說明NaCl含量達到0.6%是植物產生具有抗逆性的脯氨酸的極限，培養(yǎng)基中NaCl含量若超過0.6%時，植物自身所產生的脯氨酸已經不足以抗鹽脅迫，所以兜唇石斛耐鹽性的臨界濃度為0.6%。

參考文獻：

[1] 趙永靈，王世林，李曉玉.兜唇石解多糖的研究[J].云南植物研究，1994，16（4）：392-396.

[2] 云南植物研究所.云南植物志[M].北京：科學出版社，1977.

[3] MOHAMMAD M H，MADHU S，PROMILA P.In vitro propagation of Dendrobium aphyllum（Orchidaceae）-seed germination to flowering[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2013，22（2）：157-167.

[4] 張朝鳳，邵 莉，王 磊，等.兜唇石斛酚類化學成分研究[J].中國中藥雜志，2008，33（24）：2922-2925.

[5] 趙俊凌，馬 潔，李 戈，等.兜唇石斛多糖提取及脫蛋白工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1-6.

[6] 王學奎.植物生理生化試驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2008.

[7] 李合生.植物生理生化試驗原理與技術[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8] 惲 銳，鄭慧瑩.松嫩平原簡化草甸朝鮮堿茅，獐毛耐鹽堿特性的比較研究[J].植物生物學報，1996，20（4）：322-329.

[9] 王家福.花卉組織培養(yǎng)與快繁技術[M].北京：中國林業(yè)出版社，2006.

[10] 周瑞金，楊 靜，孔曉萍.植物生長調節(jié)劑對香石竹離體培養(yǎng)的影響[J].現(xiàn)代園藝，2013（12）：5-6.

[11] 李 軍，徐 虹，王曉敏.不同因素對香石竹初代培養(yǎng)的影響[J].安徽農學通報，2008，14（19）：41-42.

[12] 李國樹，徐成東，李天星，等.鐵皮石斛組培苗耐鹽性研究[J].北方園藝，2011（1）：153-156.

[13] MOFTAH A E，MICHEL B E.The effect of sodiumchloride on solute potential and proline accumulation in soybean leaves[J].Plant Physiol，1987（83）：238-240.

[14] HANSON A D，NELSON C E，PEDERSEN A R，et al.Capacity for proline accumulation during water stress in barley and its implications for breeding for drought resistance[J].Crop Sci，1979（19）：489-493.

[15] DELAUNEY A J，VERMA D P S.Proline biosynthesis and osmoregulation in plants[J].Plant J，1993（4）：215-223.

[16] STEWART G R，LEE J A.The role of proline accumulation in halophytes[J].Planta，1974（120）：279-289.

[17] MCCUE K F，HANSON A D.Drought and salt tolerance：Towards understanding and application[J].Trends Biotech，1990（8）：358-362.

[18] 陳托兄，張金林，陸 妮，等.不同類型抗鹽植物整株水平游離脯氨酸的分配[J].草業(yè)學報，2006，36（1）：36-41.