摘要：以鴨梨為試材，利用透射電鏡顯微技術和組織化學技術對梨果實石細胞分化及次生壁形成過程進行研究。結果表明，石細胞分化始于開花第7天，原生質體收縮于細胞一側，隨后胞內出現(xiàn)顆粒狀凝聚物，次生壁逐漸增厚，之后胞質繼續(xù)收縮消失，早期形成的石細胞多以群體形式同時出現(xiàn)。石細胞次生壁形成是逐步進行的，即先形成纖維素或半纖維素網(wǎng)架結構，再進行木質化填充。透射電鏡下石細胞分化過程中依次呈現(xiàn)出細胞核染色質凝聚、細胞核變形、核膜界限不清晰的現(xiàn)象；胞內出現(xiàn)同心層次的自噬泡，形成大量囊泡；細胞核消失，內質網(wǎng)斷裂并大量增生，質膜向內突起形成泡狀結構；次生壁增厚，胞內細胞器僅有線粒體和內質網(wǎng)，最終細胞質收縮消失。

關鍵詞：鴨梨；石細胞；分化；程序性死亡

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5021-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.031

Abstract： Taking Yali pear as test material， the microstructure， ultrastructure and lignin deposition process of stone cells in Yali fruitlets during the early differentiating period were examined by using light microscopy and transmission electron microscopy（TEM）. The results showed that all stone cell clusters in Yali pear fruitlets started to differentiate almost simultaneously on the 7th day after full bloom. Entocyte in some parenchyma cells was clustered together and aggregated at one side， which was the start of stone cell differentiation. Then， these parenchyma cells showed small and scattered granular cytoplasm. With the thickening of the secondary wall in these cells， the stone cell formed. It was also revealed that most of former stone cells differentiated at the same time. Ultrastructure was examined by using transmission electron microscopy and the results showed that the initial nucleus was regular roundness，the first sign of this degeneration was the condensation of the cytoplasm，then chromatin condensed， karyotheca degeneration，and nucleus deformity finally disappear in the cell. Autophagic vacuole was observed in the cytoplasm， then more and more vesica appeared，and endoplasmic reticulum proliferation and dilation，followed by blebbing of the plasma membrane. With the thickening of secondary wall，cellular organelles including mitochondria and endoplasmic reticulum still well preserved，and at last the cytoplasm shrunk and disappeared.

Key words： Yali pear； stone cell； differentiation； programmed cell death

梨果酸甜適口、多具芳香，深受人們喜愛。中國和日本等國家是世界上最主要的東方梨生產(chǎn)國，東方梨具有肉質多汁、風味香甜等優(yōu)點，但因其果實中石細胞含量高而影響了梨果的鮮食品質和加工品質。石細胞一般是由薄壁細胞經(jīng)過次生壁強烈增厚并高度木質化而來，梨果實石細胞在分類上屬于短石細胞[1]，在果肉中呈團狀出現(xiàn)。不同品種梨的石細胞形態(tài)、數(shù)量及分布狀態(tài)存在很大差異，是鑒別梨果肉品質的重要依據(jù)[2-4]，石細胞團的大小、密度和分布是梨果實中較穩(wěn)定的性狀之一[4]，現(xiàn)已成為梨主要原產(chǎn)、生產(chǎn)國和有關國際組織為規(guī)范梨種質資源鑒定而確立的評價指標之一[5]。國內外學者對于石細胞的發(fā)育開展了大量的研究，多集中于石細胞整體發(fā)育、結構成分以及石細胞與果實品質之間的關系[4，6-8]。對于石細胞分化過程研究尚少，石細胞是如何從薄壁細胞轉變?yōu)榇紊谠龊竦募毎?，其機理尚不清楚。石細胞是一種厚壁類細胞，目前已經(jīng)對與之類似的導管[9]、篩管[10]、纖維[11]等開展了大量研究，它們的形成均為細胞程序性死亡過程（PCD），而對于薄壁細胞向石細胞演化過程鮮見報道。本研究探討了鴨梨石細胞的分化過程及機制，旨在為生產(chǎn)中采用合理的栽培措施，以減少梨石細胞的形成，從而改善梨果實品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

試驗地為河北農業(yè)大學標本園，位于河北省保定市郊區(qū)，為沖積平原潮土，黏壤，肥力中等，樹齡12年生，生長結果正常，花期平均溫度16.2 ℃，相對濕度30%～50%。供試材料為盛果期鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）。4月初蕾期選擇生長勢一致的鴨梨樹10棵，于花蕾大氣球期在樹冠的中層南部選擇花蕾發(fā)育期基本一致的短果枝掛牌，每花序只留第1、2朵邊花。開花當日采用雪花梨花粉授粉，采集開花0～20、30、40 d及成熟期的果實。

1.2 試驗方法

1.2.1 石細胞分化過程顯微結構觀察 在幼果赤道線附近橫切，用鋒利的刀片快速地切取組織，切成3 mm3的小塊，迅速投入含有4.0%多聚甲醛和2.5%戊二醛（用0.1 mmol/L pH 7.6的磷酸緩沖液配制）固定液中，乙醇脫水，二甲苯過渡，石蠟包埋，6 μm切片，番紅固綠對染，Olympus顯微鏡鏡檢，顯微成像系統(tǒng)（DN-2）采集圖像。

1.2.2 木質素定位 參照Rahman等[12]的方法，利用Wiesner法檢測石細胞次生壁的木質化進程，樣品經(jīng)固定、脫水、包埋及切片同“1.2.1”，經(jīng)復水和清洗，在制片上加適量1%間苯三酚及6 mol/L HCl，鏡檢，DN-2系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3 超微結構觀察 用鋒利的刀片快速地切取果實組織，切成1.0 mm×0.5 mm×0.5 mm小塊，轉入含有0.1 mol/L二甲砷酸鈉的2.5%（V/V）戊二醛固定液（pH 7.2）中，4 ℃下初固定3 h，沖洗后轉至1% OsO4（0.1 mol/L二甲砷酸鈉配制）中，4 ℃固定。梯度乙醇脫水，丙酮過渡，Spon812包埋，超薄切片機（LKB-5，Sweden）切片。鈾染和鉛染后，在透射電鏡（JEM-1400型，Japan）下觀察和采集圖像。

2 結果與分析

2.1 石細胞分化期的顯微結構變化

開花當日（圖1-a），花托內為大量薄壁細胞，其相對較小，排列緊密，略呈多邊形，細胞質濃。開花后第7天，薄壁細胞增大，靠近果心部位聚集出現(xiàn)胞質凝聚細胞，其中央大液泡完全形成（圖1-b）。從開花后第9～11天，在靠近果心部分和果肉中部先后出現(xiàn)胞質呈顆粒狀凝集狀細胞（圖1-c和圖1-d），最初顆粒較小，后聚集逐漸變大，這些均為石細胞前體細胞，其多以群體形式出現(xiàn)，偶見有單個出現(xiàn)。開花后第12天，次生壁增厚石細胞出現(xiàn)（圖1-e），其位置并不一定位于石細胞前體群中央，次生壁已增厚但對番紅著色能力差，說明木質化程度較低。開花后第13天，石細胞的次生壁顯著增厚，其原生質體凝聚于細胞中央（圖1-f），周圍有許多正在分化的石細胞前體薄壁細胞。開花后第15～18天，石細胞團呈現(xiàn)（圖1-g），石細胞次生壁繼續(xù)增厚，細胞質收縮更加明顯。開花后第20天，石細胞團中大部分細胞次生壁增厚明顯，先期形成的石細胞中個別細胞的細胞質已趨于殆盡（圖1-h）。開花后第40天，早期形成的石細胞團中大部分細胞次生壁完全加厚，細胞質已完全轉移，其周圍仍有石細胞處于分化后期（圖1-i）。此外還發(fā)現(xiàn)組織中有許多胞質凝聚的細胞出現(xiàn)（未列出圖片），說明石細胞在大量形成。至果實成熟期，石細胞形態(tài)與開花后第40天一致，周圍薄壁細胞較開花后第40天明顯增大（圖1-j）。

2.2 石細胞分化期次生壁的木質化進程

經(jīng)Wiesner反應，開花當日薄壁細胞未著色，細胞壁木質素含量較少或無（圖2-a）。開花后第9天，胞質凝聚期細胞中顆粒物也未著色（圖2-b），說明石細胞分化前期并未大量存在木質素。首個石細胞出現(xiàn)（開花后第12天）時其胞壁增厚（圖2-c），次生壁未大量沉積木質素，與周圍薄壁細胞一致。待石細胞團初步形成時（開花后第15天），部分胞壁呈淺桃紅色，說明存在木質素單元，但含量較低（圖2-d）。開花后第16天，石細胞團分布于果肉不同部位（圖2-e），次生壁迅速加厚，其靠近初生壁部分著色較深，向內遞減，說明木質素分布由外向內逐漸降低（圖2-f）。開花后第18～20天，石細胞次生壁顯著增厚呈桃紅色，呈向心式變淺（圖2-g和圖2-h），其細胞質也被染成棕褐色。

2.3 石細胞分化期的超微結構變化

開花當日薄壁細胞胞質濃厚，細胞器豐富，原液泡聚集，初生壁薄而平整，胞壁零星分布初生紋孔場，細胞核呈球形，邊緣整齊，核質濃厚，內質網(wǎng)整齊（圖3-a）。開花后第5天，液泡聚集形成中央大液泡（圖3-b），部分薄壁細胞細胞核染色質開始凝聚，向核膜邊緣靠近，核形狀趨于不規(guī)則，略呈瓣裂狀（圖3-b-1），初生壁增厚，其附近細胞質中可見高爾基體、線粒體等細胞器，細胞出現(xiàn)具雙層膜結構的運輸小泡（圖3-b），同時一些細胞中見到同心圓潴泡結構（圖3-c）。開花后第7天，細胞器凝聚于一側（圖3-d），胞壁上具發(fā)達的胞質通道與相鄰的細胞相連，液泡膜開始出現(xiàn)破裂（圖3-d-2）。開花后第8天，胞質濃度增加，內質網(wǎng)斷裂成幾部分（圖3-e-3），粗糙內質網(wǎng)大量增生，或向內包吞細胞質組成泡狀結構（圖3-e-4）。部分細胞內出現(xiàn)大量單層膜泡狀結構（圖3-f），有的形成包圍多個細胞器的自噬泡（圖3-f-5）。開花后第9天，胞質先凝聚為小顆粒狀，后聚集成較大顆粒，并向細胞膜邊緣聚集，質膜內陷形成許多小泡（圖3-g）。開花后第10～11天，細胞質聚集于質膜附近，細胞核降解，細胞壁內側趨于不平整（圖3-h），質膜與細胞壁之間囊泡體（圖3-i-6）、質膜向內形成了大量的運輸小泡（圖3-i）。開花后第12天，石細胞顯現(xiàn)，質壁分離，未見細胞核，胞質內殘存細胞器，次生壁增厚但整體較薄，其與初生壁電子密度相近，說明二者成分相近（圖3-j）。開花后第14天，在初生紋孔場位置次生壁并未增厚，形成紋孔道，在次生壁內側有可見厚度的一層結構（圖3-k），這層結構與初生壁相近，細胞質內形成大量囊泡（圖3-k-7），次生壁增厚，紋孔道形成。開花后第18天，胞質內形成大量粗糙內質網(wǎng)（圖3-l）以及內質網(wǎng)包圍細胞質形成泡狀結構，部分內質網(wǎng)末端與線粒體相連（圖3-l-8）。開花后第20天，細胞次生壁繼續(xù)增厚，胞質向中心凝聚，僅剩大量線粒體、粗糙內質網(wǎng)和許多囊泡狀結構（圖3-m）。開花后第40天，最早完成分化石細胞，次生壁完全形成，胞內無細胞質，胞間層和初生壁電子密度明顯大于次生壁（圖3-n）。普通薄壁細胞在發(fā)育過程中，保持完整的細胞核，其核膜核仁清晰可見，僅形成均勻厚度的初生壁（圖3-o）。

3 討論

3.1 石細胞的分化時間及形式

劉慶華等[13]、阿拉木薩等[4]認為石細胞團在形成過程中，首先薄壁細胞中有個別細胞壁變厚稱之為原基細胞，后來以原基細胞為中心，周圍的薄壁細胞繼續(xù)增厚，形成新的石細胞，圍繞原基石細胞逐漸積累形成石細胞團。碭山酥梨[7]石細胞出現(xiàn)于果實發(fā)育中期（花后第15～23天），部分細胞壁不均勻加厚形成石細胞，最后石細胞聚簇形成石細胞團。從分化時間而言，前人研究認為石細胞分化始于花后兩周，由單個石細胞出現(xiàn)為開始，稱該細胞為石細胞原基，這與本研究中石細胞出現(xiàn)的時間相近。然而，石細胞次生壁的出現(xiàn)說明細胞壁已經(jīng)發(fā)生了特化[14]，本研究采用的固定劑有效地區(qū)分了分化前期的石細胞（即次生壁未增厚的細胞）和普通薄壁細胞。故認為石細胞的分化應以薄壁細胞的胞質聚集于胞內一側為起點，始于花后1周。從分化形式上而言，在分化初期石細胞團多以群體形式同時分化，少數(shù)以單個形式出現(xiàn)。前體期石細胞密集出現(xiàn)，其中某個細胞分化速度較快，先出現(xiàn)次生壁增厚，該細胞可能位于群體中間，亦或位于一側，緊隨其后出現(xiàn)的石細胞也并不一定是與之相鄰細胞，而是周圍多個細胞近乎同時形成次生壁。石細胞團分化類似于原生木質部和后生木質部分化形式，因此稱石細胞原基為“始石細胞”或“原生石細胞”更為恰當。

3.2 石細胞次生壁的分化與木質素沉積

呂芮宏等[15]指出石細胞含量與木質素呈顯著正相關，果實發(fā)育期木質素含量也與石細胞的含量變化存在相關性[8]。于娟娟等[16]認為木質素沉積在石細胞的細胞壁上，從而使次生壁加厚，也有研究認為石細胞的木質素積累是由最外側開始，然后透過細胞膜向細胞質發(fā)展而最終形成石細胞[17]。與石細胞同為厚壁類細胞的導管，次生壁木質素總量由外向內先持續(xù)減少至最小值，到內側壁略有增大[18]。次生木質部導管和管胞形成次生壁時，先由纖維素微纖絲定向排列，其間有一些半纖維素成分連接，具孔隙結構，此后隨著木質化的進行，這些孔隙被球形小體填充，最后才形成具有十分致密結構的次生壁[19]。鴨梨石細胞次生壁初現(xiàn)時，易被固綠著色，說明其含有較多的纖維素和半纖維素，Wiesner反應弱證明木質素含量很少。隨著次生壁的逐漸增厚，靠近外側的次生壁易于番紅著色， Wiesner反應結果也證明外側細胞壁木質素高于內側。由此判斷石細胞分化與導管分化相近，初期并未沉積較多的木質素，而是形成了纖維素和半纖維素的網(wǎng)架結構，此后才逐步在網(wǎng)架內部進行填充。石細胞剛出現(xiàn)時，電鏡下其新形成的次生壁與初生壁電子密度相近，當次生壁增厚到一定程度時，仍然可見在次生壁的內側有一電子密度較大的層次，而隨著次生壁的增厚該層逐漸不明顯，說明石細胞次生壁形成是逐步進行的，即先形成纖維素或半纖維素網(wǎng)架結構，再進行木質化填充。

3.3 梨果實石細胞PCD的初步證據(jù)

Kerr等[20]將細胞死亡分為兩類，即程序性死亡和壞死，程序性死亡過程不同于壞死在于其有明顯的時序性，其中細胞核是否發(fā)生特異性變化是衡量PCD發(fā)生的重要形態(tài)特征之一[21]。導管分子分化過程中細胞核由最初的紡錘狀變?yōu)樾螤畈灰?guī)則，后出現(xiàn)縊縮或出芽，染色質凝聚，分化后期核膜較完整，最終才出現(xiàn)核膜消失及核崩解[22]，該現(xiàn)象也存在于美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）小孢子發(fā)育[23]、水燭香蒲（Typha angustifolia）的通氣組織形成[24]、柑橘（Citrus）氣孔器保衛(wèi)細胞[25]程序性死亡過程。梨果實石細胞分化早期（薄壁細胞期）即出現(xiàn)了細胞核的染色質凝聚以及細胞核的瓣裂狀，后呈空泡狀并逐漸解體，次生壁出現(xiàn)之后細胞核已無蹤跡，說明石細胞分化具有PCD特征。此外，其細胞器和質膜變化同樣具有時序性，分化前薄壁細胞內質網(wǎng)整齊，隨后發(fā)生斷裂并持續(xù)增生，形成泡狀或線狀結構或部分與線粒體相連，這種現(xiàn)象也存在于導管形成過程中[22]。石細胞分化早期質膜保持完整，后質膜逐漸內陷形成許多泡狀結構，線粒體始終保持完整的結構，直至最后原生質體高度收縮后依然可見線粒體，與獼猴桃[23]小孢子PCD過程一致，這些特征均說明石細胞分化具有PCD特征。

4 結論

石細胞分化以薄壁細胞細胞質聚集為起點，薄壁細胞中央大液泡將胞質擠于一側，細胞核染色質出現(xiàn)凝聚、細胞核變形、核膜界限不清晰，此后胞內出現(xiàn)同心層次的自噬泡，胞質凝聚成顆粒狀，胞內形成大量囊泡，后細胞核消失，內質網(wǎng)斷裂并大量增生，質膜向內突起形成泡狀結構，隨后次生壁增厚，胞內細胞器僅有線粒體和內質網(wǎng)，最終細胞質收縮消失，整個過程具有細胞程序性死亡的特征。

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