摘要：冬凌草（Rabdosia rubescens）是唇形科香茶菜屬一種抗腫瘤藥用植物，二萜類主要成分冬凌草甲素是其主要的活性物質(zhì)。對(duì)冬凌草的生物學(xué)特性、分布、遺傳多樣性、冬凌草甲素及其抗癌活性、冬凌草甲素生物合成路徑及其二萜類合酶、冬凌草的轉(zhuǎn)錄組等研究方面進(jìn)行了綜述，為冬凌草種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用及其相關(guān)的生物分子機(jī)制進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：冬凌草（Rabdosia rubescens）；遺傳多樣性；生物合成路徑；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-4901-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.002

Abstract： Rabdosia rubescens is an antitumor medicinal plant in Labiatae family. Diterpenes，especially oridonin，were the main active components in this plant. The biological characteristics，distribution，genetic diversity，oridonin and its antitumor activity，biosynthesis pathways of oridonin and its diterpenes synthase，and transcriptome of R. rubescens were summarized，to provide scientific reference for the rational exploitation and utilization of germplasm resource of R. rubescens and further discovery of the relative bio-molecular mechanisms.

Key words： Rabdosia rubescens； genetic diversity； biosynthesis pathways； transcriptome

冬凌草，學(xué)名碎米椏[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.]，拉丁文學(xué)名由原來(lái)的[Isodon rubescens（Hemsl.） Hara]修訂為[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.）][1]，唇形科香茶菜屬多年生草本或亞灌木植物的干燥地上部分，是一種重要的藥用植物，主要分布于黃河、長(zhǎng)江流域，主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山一帶[2]。冬凌草全草入藥，藥苦、甘，性微寒；具有清熱解毒、活血止痛、抗菌消炎[3]等功效，其粗制劑具有抗癌作用[4]。冬凌草中含有萜類、黃酮類、生物堿、甾體、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸、單糖等成分[5]，其中對(duì)映-貝殼杉烷類二萜化合物，特別是冬凌草甲素是冬凌草中含量最高、生物活性較強(qiáng)、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值豐富的一類有效成分[6]。冬凌草由于被肆意采挖造成了資源瀕于枯竭、品種退化、活性成分減少等問題。目前，對(duì)冬凌草的研究更多地集中在化學(xué)成分及其藥理作用方面，而對(duì)冬凌草遺傳多樣性及其代謝路徑等方面還有待進(jìn)一步研究。本文就其生物學(xué)特性、資源分布、遺傳多樣性、冬凌草甲素及其抗癌機(jī)制、冬凌草甲素生物合成路徑及其二萜類合酶、冬凌草的轉(zhuǎn)錄組研究方面進(jìn)行了綜述，旨在為有效運(yùn)用生物學(xué)研究方法來(lái)改善冬凌草人工栽培中存在的問題，改善其代謝途徑以及提高其活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 冬凌草的生物學(xué)特性

冬凌草為亞灌木植物，高0.3～1.2 m，木質(zhì)根莖，有長(zhǎng)纖維狀須根。莖直立，多數(shù)，基部近圓柱形，無(wú)毛，皮層縱向剝落，上部多分枝，分枝具花序，莖上部及分枝均四棱形，具條紋，帶紫紅色。莖葉對(duì)生，聚傘花序3～5花，最下部者有時(shí)多至7花?；ūP環(huán)狀，小堅(jiān)果倒卵狀三棱形，淡褐色，無(wú)毛?；ㄆ?～10月，果期8～11月[7]。冬凌草染色體數(shù)目為2n=2x=24[8]。冬凌草種子均為倒卵形，但不同發(fā)育程度冬凌草種子在形態(tài)特征上明顯不同，從種皮顏色上可以將其分為褐色具花紋和褐色種子兩大類。董誠(chéng)明等[9]研究發(fā)現(xiàn)種子蛋白表達(dá)量的差異導(dǎo)致兩種不同的發(fā)育類型。冬凌草的表皮細(xì)胞的形狀、氣孔類型均相同，但其葉基形狀、葉長(zhǎng)、葉寬、葉表皮微形態(tài)特征存在明顯的差異[10]。隨著冬凌草日常需求量的增加，冬凌草的栽培技術(shù)得到了很大的改進(jìn)，從種子繁殖、幼苗扦插、移植栽培、病蟲防治等方面提高種苗的產(chǎn)量[11-13]。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)建立冬凌草無(wú)性快繁體系是促進(jìn)冬凌草大面積人工栽培， 緩解自然資源匱乏現(xiàn)狀的有效途徑[14，15]。

2 冬凌草的地理分布

唇形科香茶菜屬[Rabdosia （Bl.） Hassk]植物全世界約有150種，在非洲南部、南亞、東南亞以及東歐等地區(qū)都有分布。中國(guó)有90 個(gè)種和21個(gè)變種，在湖北、四川、貴州、廣西、陜西、甘肅、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省區(qū)均有分布，主要分布在長(zhǎng)江以南以及西南各省區(qū)。冬凌草屬于廣布種，在湖北、四川、貴州、廣西、陜西、甘肅、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省區(qū)均有分布。主要集中分布于太行山區(qū)，藥用冬凌草也主要產(chǎn)于這一地區(qū)。王新民等[16]采用中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)（TCMGIS）分析得出冬凌草全國(guó)適宜區(qū)分布（圖1）。冬凌草的分布很廣，而隨著各地對(duì)其需求量的增加，野生的冬凌草資源瀕臨枯竭，因此通過(guò)對(duì)不同地區(qū)的自然居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，并收集代表性的種質(zhì)資源，建立冬凌草核心種質(zhì)庫(kù)，篩選優(yōu)良的種質(zhì)資源才能實(shí)現(xiàn)冬凌草的大面積人工種植。

3 冬凌草遺傳多樣性研究

研究遺傳多樣性的方法包括形態(tài)宏觀水平的性狀統(tǒng)計(jì)和分子微觀水平的同工酶、等位酶以及DNA分子標(biāo)記方法，例如RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP和DNA測(cè)序等。DNA分子標(biāo)記方法的研究對(duì)象是遺傳物質(zhì)本身，不受物種所處環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響，又能反映環(huán)境條件對(duì)物種遺傳選擇的影響，成為研究物種遺傳多樣性和品種鑒定的主要方法。表1中總結(jié)了目前冬凌草及其相關(guān)香茶菜屬的遺傳多樣性的研究概況。除了上述分子標(biāo)記方法外，現(xiàn)在又發(fā)展了許多現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)，郭培國(guó)等[17]運(yùn)用微衛(wèi)星錨定片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Microsatellite-anchored fragment length polymorphism，MFLP）利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和SSR錨錠引物技術(shù)的雙重原理建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)菜薹種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行了分析。而冬凌草的遺傳多樣性分析還停留在初始階段。

李國(guó)民等[22]從遺傳距離上對(duì)不同地區(qū)、各種類型的冬凌草進(jìn)行了基因水平的分類，研究表明產(chǎn)地差異和類型差異共同影響了冬凌草種質(zhì)資源的多樣性和復(fù)雜性，冬凌草在物種水平上具有較高的遺傳多樣性，居群水平遺傳多樣性較低，大部分遺傳變異存在于居群間，與其他研究類似[25]。而魏俊杰[26]在研究河南濟(jì)源地區(qū)的兩種冬凌草（一類是含有冬凌草甲素的冬凌草，另一類是含OGP-46的冬凌草）時(shí)，從內(nèi)環(huán)境因素中的內(nèi)生菌及遺傳因素中的rDNA ITS序列兩方面探討形成這種差異的可能原因，但2種類型的冬凌草在ITS序列上并未表現(xiàn)出顯著的差異。說(shuō)明居群內(nèi)擁有較低的居群特有多態(tài)位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)是否與次生代謝產(chǎn)物合成基因相關(guān)，是否可以作為分子鑒定的依據(jù)，還有待進(jìn)一步研究。

冬凌草的種質(zhì)資源多種多樣，不同地區(qū)冬凌草二萜類成分明顯不同，而不同變異類型冬凌草二萜類成分也發(fā)生變化，無(wú)明顯規(guī)律性。植株的生長(zhǎng)受到各種因素的影響，光、溫度、濕度、土壤肥沃程度、海拔、氣候條件等都能明顯地影響冬凌草的生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的合成。隨著產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的不同，其次生代謝成分的結(jié)構(gòu)類型會(huì)有較大的變化，這種次生代謝成分上的多樣性是常見的生物多樣性現(xiàn)象的表現(xiàn)之一。在貴州產(chǎn)冬凌草中就沒有發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素和乙素的存在，而在河南產(chǎn)的冬凌草中就主要含有冬凌草甲素[27]。陳隨清等[28]通過(guò)冬凌草指紋圖譜對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地和不同類型的冬凌草進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)冬凌草二萜類成分明顯不同。不同地區(qū)冬凌草二萜類成分不同，而且同一地區(qū)的同一株冬凌草不同部位的二萜類成分也有較大的差異。廖偉玲等[29]采用薄層色譜法對(duì)冬凌草中齊墩果酸和冬凌草甲素進(jìn)行定性鑒別，高效液相色譜法測(cè)定冬凌草甲素含量，發(fā)現(xiàn)不同地方分布、冬凌草不同部位冬凌草甲素含量都有較大的差別。說(shuō)明冬凌草隨著產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境（海拔、水、土和氣候條件等）的不同，其次生代謝成分的結(jié)構(gòu)類型會(huì)有較大的變化。僅從化學(xué)成分差異去分析冬凌草的種質(zhì)資源的分布規(guī)律和差異是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，尤其是在DNA分子標(biāo)記發(fā)展迅速的情況下，可以深入到遺傳分子層面去分析其遺傳差異，并運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造。如通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)優(yōu)良的冬凌草進(jìn)行人工栽培，能有效解決野生冬凌草的匱乏問題；研究冬凌草內(nèi)二萜類主要成分冬凌草甲素的生物合成路徑并克隆相關(guān)酶的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造出能合成更多冬凌草甲素的冬凌草。

4 冬凌草甲素及其抗癌活性

冬凌草甲素（Oridonin）屬7，20-環(huán)氧型對(duì)映-貝殼杉烷類二萜化合物，為無(wú)色針狀結(jié)晶，味道極苦，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑。冬凌草甲素有很高的抗癌活性，其抗癌活性是由于分子中α-亞甲基環(huán)戊酮部分結(jié)構(gòu)，裂環(huán)或亞甲基飽和則作用消失[30，31]。冬凌草甲素分子式為C20H28O6，相對(duì)分子質(zhì)量為364.43，熔點(diǎn)為248～250 ℃，分子結(jié)構(gòu)見圖2。

冬凌草甲素顯著抑制人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和PC-9細(xì)胞的體外增殖、黏附和侵襲，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)CDK1、β-catenin等抗體的表達(dá)和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性[33]。冬凌草甲素通過(guò)與受體結(jié)合或抑制腫瘤細(xì)胞的鈉泵轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞從周圍環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，使瘤體縮小甚至消失。冬凌草甲素還有抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系（CEM）的作用，通過(guò)破壞CEM的細(xì)胞膜和誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，上調(diào)和下調(diào)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白以發(fā)揮抗白血病作用[34]。冬凌草甲素目前在治療腫瘤方面有很重要的作用，因此研究冬凌草甲素的生物合成路徑及其相關(guān)基因的克隆，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造其生物合成，以期得到含有大量冬凌草甲素的冬凌草是冬凌草研究的一個(gè)重要方向。

5 冬凌草甲素生物合成路徑、二萜類合酶及其相關(guān)基因的克隆

冬凌草甲素通過(guò)甲羥戊酸途徑（Mevalonic acid，MVA）和脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（Methyl-D-erythritol phosphate，MEP）形成異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP），以形成的IPP為前體物質(zhì)形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），再以GGPP為底物在二萜合酶的催化作用下形成二萜骨架或終產(chǎn)物（即貝殼杉烯化合物），然后通過(guò)細(xì)胞色素P450修飾底物結(jié)構(gòu)[35]生成冬凌草甲素。圖3為冬凌草甲素的生物合成路徑[36，37]。

合成冬凌草甲素相關(guān)的酶有MVA途徑的硫解酶、羥甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）、甲羥戊酸激酶（MK）、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶（MVAPP）；MEP途徑的脫氧木酮糖-5-磷酸合酶、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶（DXP synthase）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖激酶、2-甲基赤蘚糖-2，4-環(huán)二磷酸合酶、1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶、異戊烯基單磷酸激酶；通過(guò)MVA途徑和MEP途徑形成IPP，再由IPP通過(guò)一系列的反應(yīng)合成貝殼杉烯化合物，這一過(guò)程需要的生物合酶有牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)DS）、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl diphosphate synthase，CDS）、貝殼杉烯合酶（Kaurene synthase，KS）等，最后通過(guò)細(xì)胞色素P450修飾底物結(jié)構(gòu)生成最終的冬凌草甲素。雖然人們知道了冬凌草甲素的生物合成路徑，但是目前未見到以冬凌草為材料研究合成冬凌草甲素的酶及其相關(guān)基因克隆的報(bào)道，上述基因在其他植物或微生物中已經(jīng)被克隆出來(lái)，表2是目前對(duì)合成冬凌草甲素部分合酶及其相關(guān)基因在不同植物中的克隆情況。GenBank中并沒有發(fā)現(xiàn)冬凌草中合成冬凌草甲素相關(guān)的酶基因，這無(wú)疑給冬凌草甲素的生物合成路徑研究帶來(lái)困難，在目前生物信息學(xué)等交叉學(xué)科的迅速發(fā)展下，冬凌草甲素的生物合成路徑中酶基因的研究肯定會(huì)得到突破。

6 冬凌草的轉(zhuǎn)錄組研究

冬凌草轉(zhuǎn)錄組方面的研究很少，截至到2015年11月13日NCBI登錄的冬凌草的基因序列只有61條。隨著生物理論的發(fā)展，衍生出了很多的生物學(xué)研究方法，系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、種群遺傳學(xué)還有條形碼的分類等，更進(jìn)一步深化生物學(xué)的研究。夏至等[41]通過(guò)分子鑒定和親緣關(guān)系研究的方法得出5條葉綠體基因序列、5條ITS片段序列。Yu等[42]通過(guò)研究唇形科香茶菜屬的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和生物地理學(xué)得到3條葉綠體基因序列、1條花序基因、1條ITS。Harris等[43]運(yùn)用一種結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和種群遺傳學(xué)的方法研究得出對(duì)應(yīng)的序列28條，微衛(wèi)星標(biāo)記得到微衛(wèi)星序列11條[21]。陜西省微生物研究所的Li等上傳18S基因3條。陳士林等上傳葉綠體基因序列2條，1條ITS序列。2015年4月，來(lái)自河南大學(xué)的Zhu上傳了冬凌草中1條乙酰輔酶a-C-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因完整序列，長(zhǎng)度為1 254 bp，這也是目前已知的惟一冬凌草生物合酶基因。

二萜類作為冬凌草最主要的抗癌成分，特別是二萜類的冬凌草甲素，它們的生物合成途徑倍受重視。二萜類的生物合成路徑有很多種，二萜化合物生物合成途徑中的相關(guān)酶，特別是二萜合酶成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，當(dāng)然二萜合酶相關(guān)基因在其他植物中研究有許多，在冬凌草中的研究目前還沒有。加拿大學(xué)者對(duì)包括冬凌草在內(nèi)的低等到高等共10個(gè)含有二萜類化合物的植物進(jìn)行454、Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后進(jìn)行二萜代謝路徑中二萜合成酶和P450家族基因挖掘。在近1百萬(wàn)個(gè)萜類合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)了46個(gè)新的二萜合成酶和400個(gè)相關(guān)的P450基因[44]。冬凌草葉子的454、Illumina GA II、Illumina Hiseq2000這3個(gè)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)登錄在NCBI，但是基因序列并沒有注釋。隨著生物研究方法的不斷豐富，如生物信息學(xué)的發(fā)展，冬凌草的研究除了以系統(tǒng)發(fā)生分類學(xué)和遺傳多樣性方面，還可以更深入地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組序列分析，為冬凌草生物合成路徑的研究奠定基礎(chǔ)。

7 前景與展望

冬凌草作為天然藥物在臨床上的應(yīng)用非常廣泛，具有清熱解毒、活血止痛之功效，現(xiàn)代研究證明還有抗腫瘤作用，具有很高的藥用價(jià)值。對(duì)冬凌草的生物學(xué)特性、主要化學(xué)成分到分子生物學(xué)階段的研究，無(wú)疑還存在許多方面的不足。通過(guò)對(duì)冬凌草遺傳多樣性和種質(zhì)資源的研究，可以篩選出優(yōu)良的種質(zhì)資源，以便人工栽培。

目前研究最多的化學(xué)成分是冬凌草的二萜類，而來(lái)源于冬凌草中的二萜類往往含量低，且天然冬凌草資源有限，因此關(guān)于二萜類在生物體內(nèi)的合成路徑越來(lái)越受到人們的關(guān)注。冬凌草中的二萜類屬于對(duì)映-貝殼杉烷類二萜化合物，其相對(duì)應(yīng)的生物合成途徑過(guò)程長(zhǎng)而復(fù)雜，至今對(duì)于冬凌草二萜類合成路徑的研究處于初級(jí)階段。研究二萜類的合成相關(guān)基因和闡明其代謝途徑將成為冬凌草也是大多數(shù)藥用植物現(xiàn)代化研究的發(fā)展趨勢(shì)之一。隨著對(duì)冬凌草研究的不斷深入，借助于代謝調(diào)控等生物工程手段，實(shí)現(xiàn)藥用成分的人工介入生物生產(chǎn)是未來(lái)的發(fā)展方向之一。

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