摘要：miRNA是目前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，隨著越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，miRNA的命名及注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)歷了一系列變化。對(duì)miRNA的命名及注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了總結(jié)，以期為后續(xù)的miRNA命名及注釋鑒定提供借鑒。

關(guān)鍵詞：miRNA；命名；注釋

中圖分類(lèi)號(hào)：Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-4897-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.001

Abstract： miRNA is one of the hot spot in biological research. With the discovery of more and more miRNA， the identification criteria for naming and annotation of miRNA have undergone a series of changes. The development of identification criteria for naming and annotation of miRNA were summarized， in order to provide references for the subsequent miRNA research.

Key words： miRNA； naming； annotation

miRNA是動(dòng)物、植物、微生物甚至包括病毒在內(nèi)的生物普遍存在的一類(lèi)單鏈非編碼小RNA分子，其序列長(zhǎng)度約22 nt，并在物種間有一定的保守性。1993年Victor Ambros實(shí)驗(yàn)室首先在秀麗線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)非編碼小RNA lin-4通過(guò)反義RNA-RNA互作形式與3′UTR結(jié)合負(fù)調(diào)控LIN-14蛋白的表達(dá)[1]；2000年Gary Ruvkun實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)第二個(gè)非編碼RNA let-7通過(guò)3′UTR負(fù)調(diào)控LIN-41蛋白的表達(dá)[2]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)let-7序列在不同物種間有一定的保守性[3]；此后，人們意識(shí)到非編碼小RNA可能在物種中廣泛存在，從而在2001年《Science》雜志上同時(shí)有3篇文獻(xiàn)報(bào)道物種中存在大量非編碼RNA，并將其統(tǒng)稱(chēng)為microRNA或miRNA[4-6]。

此后，miRNA的研究迅速吸引了大批科學(xué)家，成為目前生物學(xué)研究熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。miRNA的序列及注釋信息均貯存在miRBase（www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中，該數(shù)據(jù)庫(kù)將不同物種歸為5大門(mén)類(lèi)：Chromalveolata（囊泡藻界）、Metazoa（動(dòng)物界）、Mycetozoa（黏菌門(mén)）、Viridiplantae（植物界）、Viruses（病毒界）。miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)已更新至21版，共28 645條記錄[7]。

本文對(duì)miRNA的命名及注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了總結(jié)，以期為后續(xù)miRNA研究提供借鑒。

1 miRNA簡(jiǎn)介

miRNA在生物體內(nèi)由miRNA基因編碼，miRNA基因分布于各染色體上，可位于基因間、內(nèi)含子或外顯子上，且多個(gè)miRNA基因常成簇存在。在動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)miRNA基因被II型RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）[8]，再經(jīng)過(guò)Drosha/DGCR8復(fù)合體加工成為前體miRNA（pre-miRNA）[9-11]；pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（例如EXP5）從細(xì)胞核輸出至細(xì)胞質(zhì)[12]；在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer酶進(jìn)一步加工為成熟的miRNA（Mature miRNA）[13]；成熟的miRNA與Ago蛋白等相關(guān)蛋白組成miRISC沉默復(fù)合體，抑制靶基因mRNA翻譯或者直接降解mRNA，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[14]。

miRNA生成與作用過(guò)程在植物細(xì)胞與在動(dòng)物細(xì)胞中會(huì)稍有差異，植物miRNA基因也被II型RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為pri-miRNA；植物miRNA加工為成熟的miRNA過(guò)程均在細(xì)胞核內(nèi)完成，并且沒(méi)有Drosha/DGCR8的同源蛋白，植物pri-miRNA及pre-miRNA序列長(zhǎng)度的變異比動(dòng)物更大；成熟的miRNA或者pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸出至細(xì)胞質(zhì)；在細(xì)胞質(zhì)中，miRNA與Ago家族蛋白（主要是Ago1）結(jié)合成為miRISC沉默復(fù)合體，并主要以降解靶基因mRNA的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)[15]。

2 miRNA命名

2.1 命名規(guī)則統(tǒng)一前的miRNA命名情況

最先發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)miRNA基因根據(jù)其表型分別被作者命名為lin-4、let-7、lsy-6。2001年，Thomas Tuschl、Gary Ruvkun、Victor Ambros 3個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)大量的非編碼小RNA，因此他們商定將這類(lèi)小RNA命名為microRNAs或miRNAs；并將具體發(fā)現(xiàn)的每一個(gè)miRNA按照發(fā)現(xiàn)順利進(jìn)行數(shù)字命名（例如miR-1），并將編碼該miRNA的基因以mir-1表示；高度同源的序列給以相同的名字，并增加1個(gè)小寫(xiě)字母代表同源序列間的少數(shù)堿基差異（例如miR-2a、miR-2b）；如果在基因組不同位點(diǎn)產(chǎn)生相同的miRNA，則在其后面進(jìn)一步加上短橫線及數(shù)字后綴（例如mir-6-1、mir-6-2）[4]。

2.2 動(dòng)物miRNA的命名

2003年Ambros等[16]科學(xué)家聯(lián)合發(fā)表了一個(gè)miRNA鑒定、注釋及命名的規(guī)則。miRNA的命名以“miR”為前綴，再加惟一的基因發(fā)現(xiàn)順序的數(shù)字（例如miR-1、miR-2等）；相應(yīng)的miRNA編碼基因用小寫(xiě)字母及斜體表示（例如mir-1、mir-2）；不同物種中相同或相似的miRNA用相同的名字命名（例如果蠅與秀麗線蟲(chóng)的miR-1相差1個(gè)堿基，但均命名為miR-1）；同一物種相同的miRNA命名相同，加數(shù)字后綴區(qū)分不同的基因組位點(diǎn)（例如果蠅的mir-6-1、miR-6-2表示這兩個(gè)miRNA基因在基因組不同位置，但均能產(chǎn)生相同的成熟miRNA序列）；同一物種中相似的miRNA命名相同，但是給以不同的小寫(xiě)字母后綴進(jìn)行區(qū)分（例如果蠅的miR-13a、miR-13b）。

2004年Griffiths-Jones[17]對(duì)miRNAs的命名進(jìn)行了進(jìn)一步補(bǔ)充，miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄前體稱(chēng)為pri-miRNAs；發(fā)卡結(jié)構(gòu)（Hairpin）的直接前體稱(chēng)為pre-miRNAs。對(duì)于來(lái)自同一pre-miRNA前體的兩個(gè)miRNA，用類(lèi)似miR-56及miR-56*表示，其中帶“*”號(hào)的miRNA表達(dá)量較低，屬隱形表達(dá)；如果暫不知道兩個(gè)miRNA的顯隱性表達(dá)關(guān)系，則用如miR-142-5p及miR-142-3p的形式表示兩個(gè)miRNA分別來(lái)自同一發(fā)卡前體的靠近5′或3′的莖；同時(shí)建議最好不用miR-142-s及miR-142-as[18]的形式表示。后來(lái)發(fā)現(xiàn)miRNA的顯隱性表達(dá)是相對(duì)的，在不同條件下兩者間的表達(dá)量可能變化，因此不再用基因加“*”號(hào)代表隱形表達(dá)的miRNA，改為用加“-5p”、“-3p”代表兩者間的位置關(guān)系[19]。在miRBase中記錄的miRNA如果重新命名，則其之前的名稱(chēng)可在“Previous IDs”項(xiàng)查看。miRNA前體也用斜體表示，要依據(jù)上下文判斷所指代到底是miRNA基因還是所預(yù)測(cè)前體（例如用mir-16表示其基因及所預(yù)測(cè)的前體）。

2006年Griffiths-Jones等[19]進(jìn)一步補(bǔ)充，在表示不同物種相同或相似的miRNA時(shí)，其前面加上3～4個(gè)字母代表物種的前綴表示（例如來(lái)自人類(lèi)的hsa-miR-101與來(lái)自小鼠的mmu-miR-101）。

以上的命名規(guī)則，2008年Griffiths-Jones等[20]進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)。

另外，由于人類(lèi)的miR-548基因家族成員目前已知有80個(gè)，這樣在用字母進(jìn)行不同成員區(qū)分時(shí)單字母（僅有26個(gè)）已經(jīng)不夠用，因此人類(lèi)的miR-548家族成員可以看到有雙字母存在的情況，例如has-miR-548aa、has-miR-548az-5p。

2.3 植物miRNA的命名

植物的miRNA基因命名與動(dòng)物的miRNA命名類(lèi)似，但也有明顯的區(qū)別：首先，植物的miRNA基因命名以物種前綴+MIR（全大寫(xiě)字母，與動(dòng)物有差異）+數(shù)字組成，例如ath-MIR166a。其次，同一植物基因組不同位點(diǎn)產(chǎn)生相同或相似的成熟miRNA均增加1個(gè)字母進(jìn)行區(qū)別，不用數(shù)字后綴[20]，例如ath-miR166a，這種規(guī)則會(huì)導(dǎo)致相同的成熟miRNA序列，然而由于其基因在基因組的位點(diǎn)不同，而名稱(chēng)不一樣，例如ath-miR156a-5p位于2號(hào)染色體、ath-miR156d-5p位于5號(hào)染色體，但兩者序列一致。最后，植物的miRNA前體序列較長(zhǎng)（約200 bp），而動(dòng)物的miRNA前體較短（約100 bp），這樣導(dǎo)致同樣的前體序列產(chǎn)生多個(gè)不同的miRNA，如擬南芥ath-MIR829基因，在前體的5′端有一個(gè)miRNA（ath-miR829-5p），而在其3′端有兩個(gè)miRNA，這兩個(gè)miRNA分別命名為ath-miR829-3p.1、ath-miR829-3p.2[21，22]。

2.4 病毒miRNA的命名

病毒的miRNA基因是以其來(lái)源的遺傳位點(diǎn)命名，例如來(lái)自Epstein Barr病毒BART位點(diǎn)的miRNA基因命名為ebv-mir-BART1。同一基因產(chǎn)生的多個(gè)miRNA基因用數(shù)字后綴區(qū)分，例如rlcv-mir-rL1-1基因。

病毒的成熟miRNA序列命名類(lèi)似動(dòng)物成熟miRNA命名，例如rlcv-mir-rL1-1基因產(chǎn)生的兩個(gè)miRNA分別命名為rlcv-miR-rL1-1-5p、rlcv-miR-rL1-1-3p。

3 miRNA的注釋鑒定

3.1 miRNA注釋鑒定通用標(biāo)準(zhǔn)

2003年Ambros等[16]首次提出了miRNA鑒定的標(biāo)準(zhǔn)（Expression criteria），主要包括表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)及生成標(biāo)準(zhǔn)（Biogenesis criteria）。

1）表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)如下：

A：在RNA樣本中能通過(guò)雜交（通常是Northern blotting方法）檢測(cè)到約22 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本存在。

B：從RNA文庫(kù)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA文庫(kù)中鑒定約22 nt的序列，并且該序列能與所研究的物種的基因組序列完全匹配。

2）生成標(biāo)準(zhǔn)如下：

C：22 nt的miRNA序列需來(lái)自發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體的一個(gè)臂上，所預(yù)測(cè)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)自由能要最小，并且能在另一臂上找到該miRNA至少16 bp配對(duì)的部分序列，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體不能包含大的內(nèi)在環(huán)及大的不對(duì)稱(chēng)凸起。動(dòng)物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體長(zhǎng)度約60～80 nt，而植物的前體序列變異較大，甚至可能有幾百個(gè)堿基長(zhǎng)。

D：miRNA及其前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性，保守的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的要求同上述C點(diǎn)，只是不要求折疊自由能最低。

E：Dicer蛋白功能的缺失導(dǎo)致可檢測(cè)到miRNA前體的積累。

3）以上條件單獨(dú)或其組合對(duì)于是否miRNA的判斷情況如表1。

隨著miRNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，miRNA序列測(cè)定結(jié)果越來(lái)越多，在這些結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，miRNA的兩端是可變的，尤其3′端發(fā)生變化的可能性更大，因而將其中測(cè)序次數(shù)最多的序列作為miRNA序列[20]。

3.2 植物miRNA注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)

由于植物miRNA有其自身特點(diǎn)，因此，Meyers等[22]將植物miRNA的注釋特點(diǎn)單獨(dú)總結(jié)如下：

1）主要標(biāo)準(zhǔn)：從發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體一個(gè)臂獲得21個(gè)堿基的miRNA序列。植物發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體具有這些特征：①miRNA與miRNA*（miRNA*是miRNA對(duì)應(yīng)另一個(gè)臂上與miRNA配對(duì)部分的序列的統(tǒng)稱(chēng)，這部分序列可以是一個(gè)miRNA，也可不是）分別來(lái)自發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩個(gè)臂，且其形成的雙鏈結(jié)構(gòu)在3′端有2個(gè)堿基的懸垂。②miRNA與其對(duì)應(yīng)臂上的序列，包括miRNA*只有4個(gè)或者更少堿基的錯(cuò)配。③miRNA及其對(duì)應(yīng)臂上的序列所形成的非對(duì)稱(chēng)的凸起序列很短（1～2個(gè)堿基）且頻率很低（1個(gè)或沒(méi)有），尤其在miRNA/miRNA*結(jié)構(gòu)中。

2）輔助標(biāo)準(zhǔn)：物種間的保守性，雖然大部分miRNA在物種間保守，須注意有一部分miRNA是物種特有的。存在所調(diào)控靶基因，但須注意一些保守性低miRNA所預(yù)測(cè)的靶基因難以驗(yàn)證，甚至一些miRNA自身靶基因很少，或者雖然有靶基因但是難以用目前的生物信息方法及試驗(yàn)方法預(yù)測(cè)驗(yàn)證。DCL1基因依賴(lài)性（DCL是植物Dicer Like genes統(tǒng)稱(chēng)），大多數(shù)植物miRNA依賴(lài)DCL1基因產(chǎn)生，須注意有些miRNA不依賴(lài)DCL1。RDR及PolIV/PolV非依賴(lài)性（RNA Dependent RNA Polymerases，統(tǒng)稱(chēng)RDRs），大多數(shù)siRNA是這些基因依賴(lài)的，但是有些miRNA的生成可能受到siRNA的調(diào)控，從而間接表現(xiàn)出RDR及PolIV/PolV依賴(lài)性。去除重復(fù)序列區(qū)及結(jié)構(gòu)RNA的污染，重復(fù)序列區(qū)產(chǎn)生的miRNA較少，tRNA及rRNA不產(chǎn)生miRNA，這些序列須事先去除。

3.3 整合深度測(cè)序數(shù)據(jù)miRNA注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，miRNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)越來(lái)越多，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)將深度測(cè)序數(shù)據(jù)整合進(jìn)行miRNA注釋鑒定，2011年由Kozomara等[23]提出整合深度測(cè)序數(shù)據(jù)的miRNA注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)：

1）多個(gè)Reads（10～20是常用閾值）支持成熟miRNA序列存在（這些Reads能來(lái)自不同的文庫(kù)則更好）。

2）支持成熟miRNA序列的Reads序列可映射至其參與組裝的Contig序列上，且連同側(cè)翼序列可折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體，成熟miRNA序列在前體的一個(gè)臂上。

3）映射至Contig的Reads同時(shí)不可與其他已注釋的轉(zhuǎn)錄本有重疊區(qū)（即Reads序列不可能是mRNA或其他已知的RNA類(lèi)型）。

4）Reads所映射的區(qū)域產(chǎn)生的miRNA 5′端必須相同，容許3′端有一定的變化。

5）更理想的條件是Reads數(shù)據(jù)支持所預(yù)測(cè)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)兩個(gè)臂均有miRNA存在（即所謂的miRNA及miRNA*序列），且兩者間的代表序列配對(duì)良好。

2014年Kozomara等[7]對(duì)于整合深度測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA鑒定，要使所鑒定miRNA可信度高，則更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)如下：

1）各有10個(gè)Reads支持發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體產(chǎn)生的兩個(gè)miRNA。

2）大多數(shù)的Reads與發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體產(chǎn)生的成熟miRNA雙鏈匹配，其3′端容許有0～4個(gè)堿基懸垂。

3）映射至前體一個(gè)臂上的reads，至少50%產(chǎn)生相同的5′端結(jié)構(gòu)。

4）所預(yù)測(cè)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體自由能要<-0.2 kcal/mol/nt。

5）成熟miRNA序列須有60%以上的堿基在所預(yù)測(cè)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)前體上是配對(duì)存在的。

3.4 公眾注釋

從2012年開(kāi)始，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)維基百科（Wikipedia）網(wǎng)頁(yè)鏈接的形式提供公眾注釋功能，鼓勵(lì)數(shù)據(jù)庫(kù)的使用者及miRNA研究專(zhuān)家對(duì)miRNA相關(guān)信息進(jìn)行補(bǔ)充完善[7]。

4 展望

隨著miRNA研究的發(fā)展，所發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量越來(lái)越多，miRNA命名過(guò)程中所遇到的各種不同情況基本都已經(jīng)出現(xiàn)，因此各物種miRNA命名的規(guī)則基本固定下來(lái)，當(dāng)然遇到新的情況時(shí)可能會(huì)對(duì)現(xiàn)有規(guī)則進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)充和修改。另外對(duì)同一個(gè)miRNA，如果曾經(jīng)有多種命名方式，在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中均會(huì)被記錄，通過(guò)查詢(xún)這些記錄可了解miRNA名稱(chēng)變化情況。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，短片段小RNA的獲得越來(lái)越容易，但是將其中真正的miRNA注釋鑒定出來(lái)將是需要花費(fèi)時(shí)間與經(jīng)歷的過(guò)程，預(yù)期今后對(duì)miRNA的注釋鑒定標(biāo)準(zhǔn)將越來(lái)越嚴(yán)格，并且會(huì)繼續(xù)引入第三方的注釋進(jìn)行補(bǔ)充和修改，使miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)所記錄的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。

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