王 蕊 李立恒 謝麗娟 胥愛(ài)文 王鐘華

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微血管模式、密度及影像學(xué)參數(shù)對(duì)涎腺腺樣囊性癌預(yù)后的關(guān)系

王 蕊 李立恒 謝麗娟 胥愛(ài)文 王鐘華

目的 探討微血管模式、密度以及影像學(xué)參數(shù)與涎腺腺樣囊性癌預(yù)后的相關(guān)性。方法收集涎腺腺樣囊性癌患者148例，免疫組化染色方法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31、CD105單克隆抗體表達(dá)及檢測(cè)涎腺腫瘤組織的微血管密度(MVD)，比較CT灌注參數(shù)、微血管密度(MVD)參數(shù)在良惡性腫瘤之間的差異及相關(guān)性。結(jié)果CD31在惡性腫瘤組中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD105在惡性腫瘤組中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；惡性腫瘤組灌注參數(shù)BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩組的MTT參數(shù)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；采用Spearman分析腫瘤各灌注各參數(shù)值與MVD的相關(guān)性，結(jié)果顯示BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關(guān)性。結(jié)論CT灌注參數(shù)可較準(zhǔn)確地定量分析腫瘤血流灌注狀態(tài)，微血管密度(MVD)、CD105可特異性標(biāo)記腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，在涎腺腺樣囊性癌的預(yù)后的評(píng)價(jià)中發(fā)揮著有積極作用。

涎腺腺樣囊性癌；CT灌注參數(shù)；微血管密度(MVD)；CD34；CD105

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1432～1435)

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC) 是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，極易發(fā)生局部浸潤(rùn)和神經(jīng)侵襲轉(zhuǎn)移，且其浸潤(rùn)性極強(qiáng)，易侵入血管，造成血運(yùn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳，但本病帶瘤生存時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[1-2]。腫瘤的生長(zhǎng)有賴(lài)于血管的生成，作為量化血管形成程度的微血管密度是血管形成的效應(yīng)標(biāo)志，可反應(yīng)腫瘤生物學(xué)惡性程度的重要參數(shù)。但是有關(guān)微血管模式與腫瘤進(jìn)展以及脈管內(nèi)癌栓、局部腫瘤浸潤(rùn)等高危因素的以及預(yù)后的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。目前影像學(xué)手段仍是診斷涎腺腺樣囊性癌的主要手段，對(duì)病變的性質(zhì)、轉(zhuǎn)移等情況提供最直接的依據(jù)，CT灌注成像能夠反映組織血流動(dòng)力學(xué)變化，從而可監(jiān)測(cè)腫瘤新生血管[3-5]。本研究收集術(shù)前CT灌注影像學(xué)檢查資料、預(yù)后資料和病理資料齊全的涎腺腺樣囊性癌標(biāo)本組織蠟塊，通過(guò)觀察微血管模式、不同內(nèi)皮標(biāo)記物檢測(cè)微血管密度，探討涎腺腺樣囊性癌血供以及微血管新生及模式的演變規(guī)律，并且未腺樣囊性癌的預(yù)后評(píng)估研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2005年1月-2015年7月我院涎腺腺樣囊性癌患者148例，其中男性87例，女性61例，年齡39～74歲，平均年齡為(55.3±10.7)歲；均為單側(cè)腺體發(fā)病，其中左側(cè)發(fā)病的有77例，右側(cè)發(fā)病的有71例，發(fā)病部位位于舌下腺的有27例，位于腮腺的有101例，其余20例位于頜下腺。臨床分期及病理類(lèi)型參照國(guó)際WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分析判斷，其中Ⅰ期40例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例，Ⅳ期34例；篩孔狀51例、管狀型50例、實(shí)體型47例。隨機(jī)將148例患者分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組74例。

1.2 治療情況

本研究均為來(lái)院的初診病例，均在我院完成手術(shù)治療，其中單純手術(shù)治療的有85例，輔助放療等治療手段的有63例，舌下腺27例中有12例行口底的微波治療，10例行上半頸部清掃，5例行頜下清掃加下頜骨切除術(shù)；位于腮腺101例中行腮腺淺葉切除的有38例，行全葉切除的有32例，行殘葉切除的有21例，行腮腺癌聯(lián)合根除術(shù)的有6例，行擴(kuò)大切除術(shù)的有4例；20例位于頜下腺的患者中行頜下三角清掃術(shù)的有8例，行聯(lián)合根治術(shù)的有8例，行上半頸清掃術(shù)的有2例，行頜下三角清掃家頜骨切除的有2例；輔助放療治療的63例患者均采用面頸部聯(lián)合的對(duì)穿野照射，其中有24例輔加根治性的同側(cè)頸部照射，15例輔加預(yù)防性的同側(cè)頸部照射。區(qū)域淋巴結(jié)的放療劑量為50～70 Gy，原發(fā)灶的放療劑量為30～70 Gy。隨訪中發(fā)生復(fù)發(fā)的68例中行手術(shù)治療的有32例，其中15例追加了放療。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè)CD31、CD105表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟至水→3%甲醇-H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性→蒸餾水沖洗，10 ml PBS洗5分鐘→抗原修復(fù)后，10 ml PBS洗3次，每次5 min→滴加10%正常山羊血清封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性染色→滴加一抗4 ℃冰箱過(guò)夜→0.01 M PBS洗3次，每次5 min→滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG，37 ℃孵育30 min→0.01 M PBS洗3次，每次2 min→滴加辣根酶HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min→DAB顯色劑顯色5 min，自來(lái)水終止顯色→復(fù)染→酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 CT灌注檢測(cè)流程 先行常規(guī)CT平掃，確定腫瘤中心部位，選取感興趣區(qū)，使用高壓注射器經(jīng)肘靜脈快速推注對(duì)比劑碘克沙醇(300 mg/ml)，流率4 ml/s，總劑量50 ml，延遲時(shí)間5～15 s，掃描時(shí)間50 s，然后以病灶最大層面為中心，行灌注掃描，層厚5 mm×8層，50次連續(xù)同層動(dòng)態(tài)掃描，將數(shù)據(jù)傳輸至GE AW4.22工作站，應(yīng)用GE Perfusion 3灌注軟件分析，得到一系列CT灌注參考值BF、BV、PS及MTT。

1.3.3 對(duì)病例干預(yù)手段及措施 資深病理專(zhuān)家對(duì)切片復(fù)核確認(rèn)，利用相應(yīng)的存檔組織蠟塊進(jìn)行CD31、CD105免疫組化染色，標(biāo)記微血管密度，記錄觀察微血管的生長(zhǎng)模式；同時(shí)對(duì)患者術(shù)前行64排螺旋CT灌注掃描，先行常規(guī)CT平掃，確定腫瘤中心部位，選取感興趣區(qū)，使用高壓注射器經(jīng)肘靜脈快速推注對(duì)比劑碘克沙醇(300 mg/ml)，流率4 ml/s，總劑量50 ml，延遲時(shí)間5～15 s，掃描時(shí)間50 s，然后以病灶最大層面為中心，行灌注掃描，層厚5 mm×8層，50次連續(xù)同層動(dòng)態(tài)掃描，將數(shù)據(jù)傳輸至GE AW 4.22工作站，應(yīng)用GE Perfusion 3灌注軟件分析，得到一系列CT灌注參數(shù)：血容量(BV)、血流量(BF)、對(duì)比劑平均通過(guò)時(shí)間(MTT)、表明通透性(PS)以及強(qiáng)化峰(PH)。

1.3.4 資料收集 征得所有患者及其家屬的同意，簽署知情同意書(shū)，選擇合適的手術(shù)方式，并記錄術(shù)后過(guò)程。記錄不同標(biāo)記的微血管密度，收集CT影像微血管參數(shù)，同時(shí)對(duì)每位患者的治療方式等臨床資料進(jìn)行收集，查閱出院后隨訪資料卡，定期記錄患者隨訪及復(fù)查情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CT灌注參數(shù)與不同病理參數(shù)差異采用t檢驗(yàn)；微血管模式與不同病理參數(shù)的差異采用多行卡方檢驗(yàn)；CD105、CD31標(biāo)記的微血管密度差異比較采用t檢驗(yàn)；用Spearman分析腺樣囊性癌CT灌注參數(shù)BF、BV、PS及MTT值與MVD的相關(guān)性，計(jì)算等級(jí)相關(guān)系數(shù)rs;對(duì)所有影響預(yù)后的因素采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行單因素和單因素分析，并繪制生存曲線，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD31在涎腺腫瘤中的表達(dá)

CD34在惡性腫瘤組中的表達(dá)水平明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 CD34在涎腺腫瘤中的表達(dá)情況(±s)

表1 CD34在涎腺腫瘤中的表達(dá)情況(±s)

組別例數(shù)MVD(個(gè)/100倍視野)t值P值惡性腫瘤組7224．8±10．31．2360．243良性腫瘤組7630．6±11．1

2.2 CD105在涎腺腫瘤中的表達(dá)

CD105在惡性腫瘤組中的表達(dá)水平明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 CD105在涎腺腫瘤中的表達(dá)(±s)

表2 CD105在涎腺腫瘤中的表達(dá)(±s)

組別例數(shù)MVDt值P值惡性腫瘤組7216．8±8．21．3650．184良性腫瘤組7621．6±8．4

2.3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數(shù)結(jié)果的比較

惡性腫瘤組灌注參數(shù)BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩組的MTT參數(shù)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數(shù)結(jié)果的比較(±s)

表3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數(shù)結(jié)果的比較(±s)

灌注參數(shù)惡性腫瘤組良性腫瘤組t值P值BF(ml·100g-1·min-1)211．3±19．7144．0±27．28．2150．000BV(ml·100g-1)28．1±5．916．3±5．56．9450．000MTT/s12．8±1．312．0±6．30．0970．975PS(ml·100g-1·min-1)30．6±5．125．1±4．82．9640．001

2.4 灌注各參數(shù)與以CD34、CD105標(biāo)記的MVD比較

采用Spearman分析腫瘤各灌注各參數(shù)值與MVD的相關(guān)性，結(jié)果顯示BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 灌注各參數(shù)與以CD31、CD105標(biāo)記的MVD比較

3 討論

腺樣囊性癌是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，5年生存率約為20%。極易發(fā)生局部浸潤(rùn)和神經(jīng)侵襲轉(zhuǎn)移[6]。腫瘤微血管新生是其浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提條件[7]。近幾年涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，雖然隨著治療手段的進(jìn)步，患者的生存率有所提高，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是其死亡的主要原因[8]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)涎腺腺樣囊性癌的研究主要集中在病因?qū)W中遺傳基因的研究、早期診斷方法的研究、手術(shù)方法改進(jìn)的研究、放射、化學(xué)治療的研究等方面，且取得了一定進(jìn)展，但涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病率及死亡率無(wú)明顯下降，說(shuō)明上述研究的深度不夠，一些研究結(jié)果尚未用于臨床[9-11]。由于涎腺腺樣囊性癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前仍是威脅人類(lèi)生命的主要疾病。因此，進(jìn)一步研究和尋找有關(guān)涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的早期生物標(biāo)記物和敏感特異的診斷手段，是涎腺腺樣囊性癌有效治療、改善預(yù)后，提高生存率的關(guān)鍵所在。由于涎腺腺樣囊性癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前仍是威脅人類(lèi)生命的主要疾病，研究涎腺腺樣囊性癌的病因，做好涎腺腺樣囊性癌發(fā)病的預(yù)防，減少其發(fā)病率，仍是今后研究的主要方向[12]。

傳統(tǒng)的診療方法已經(jīng)難以滿(mǎn)足廣大患者日益增長(zhǎng)的健康需求。目前，腫瘤的抗血管生成治療的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，但是有關(guān)腫瘤微血管模式的研究少見(jiàn)報(bào)道；因?yàn)槟[瘤微血管分布無(wú)規(guī)律，多數(shù)計(jì)數(shù)密度，但是僅以密度代替微血管特性很不完善，需要對(duì)影像資料、病理資料和手術(shù)大體所見(jiàn)、預(yù)后隨訪進(jìn)行綜合研究，但未見(jiàn)類(lèi)似相關(guān)報(bào)道，而對(duì)此研究意義重大，它不僅可以術(shù)前評(píng)估腫瘤的性質(zhì)、為手術(shù)治療提供參考，而且對(duì)腫瘤進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估提供參考[13]。本研究收集術(shù)前CT灌注影像學(xué)檢查資料、預(yù)后資料和病理資料齊全的涎腺腺樣囊性癌標(biāo)本組織蠟塊，通過(guò)觀察微血管模式、不同內(nèi)皮標(biāo)記物檢測(cè)微血管密度，探討涎腺腺樣囊性癌血供以及微血管新生及模式的演變規(guī)律，并且未腺樣囊性癌的預(yù)后評(píng)估研究提供理論基礎(chǔ)。

CD105在血管生成中是必需的因子，其功能與TGF及其受體具有密切的相關(guān)性，可作為血管形成過(guò)程中的促進(jìn)劑或拮抗劑，在體內(nèi)能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生以及間質(zhì)細(xì)胞的代謝，從而促進(jìn)血管形成，研究發(fā)現(xiàn)CD105與多種惡性腫瘤的預(yù)后具有相關(guān)性并在腫瘤早期診斷中發(fā)揮著重要作用；CD31是在動(dòng)脈粥樣硬化組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的因子之一，該因子有選擇性的定位于腫瘤組織內(nèi)，其密度較高。近年來(lái)的一些研究發(fā)現(xiàn)CD105可能是一種比CD31更好的新生血管標(biāo)志物，能更準(zhǔn)確地反映內(nèi)皮細(xì)胞的增殖狀態(tài)[14-15]。本組研究發(fā)現(xiàn)CD31、CD105在惡性腫瘤組中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚有待與進(jìn)一步大樣本分類(lèi)研究。因此提示微血管密度單一指標(biāo)并不能完全代表涎腺腫瘤的血管生成，需要更多的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)檢測(cè)微血管形態(tài)學(xué)改變以及微血管新生的形式表達(dá)的差異性。研究發(fā)現(xiàn)64排CT在反映腫瘤血管生成方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可提高了診斷的準(zhǔn)確性，CT灌注掃描能更好的反映局部組織血流動(dòng)力學(xué)情況。本研究結(jié)果顯示，惡性腫瘤組灌注參數(shù)BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩組的MTT參數(shù)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能死亡原因是血液粘滯度增加、腫瘤新生血管的管腔不規(guī)則，從而導(dǎo)致血管阻力增加，所以惡性腫瘤相對(duì)于良性腫瘤具有高血流量、高血容量的表現(xiàn)。MVD標(biāo)記與CT灌注參數(shù)的相關(guān)性結(jié)果顯示，BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關(guān)，單位體積內(nèi)微血管數(shù)量越多血流量越大，本研究的原因考慮與涎腺腫瘤誘發(fā)的新生血管排列紊亂、結(jié)構(gòu)異常、基膜不完整有關(guān)，通透性高同時(shí)存在動(dòng)靜脈短路的現(xiàn)象均可導(dǎo)致血流分布不均。

綜上所述，標(biāo)記涎腺腫瘤微血管密度有待擴(kuò)大樣本量、分類(lèi)細(xì)化研究，CT灌注成像對(duì)于涎腺腫瘤的診斷及病變的確定有一定的價(jià)值，CT灌注成像可以反映病變內(nèi)部血管生成情況，涎腺良惡性腫瘤的CT灌注各項(xiàng)參數(shù)之間存在顯著性差異，MVD與灌注參數(shù)呈正相關(guān)性，微血管模式的研究不僅可以為腫瘤的治療提供參考，而且通過(guò)預(yù)后流行病資料以及臨床影像資料的研究可以科學(xué)評(píng)估預(yù)后以及篩選獨(dú)立的預(yù)后影響因素，對(duì)規(guī)范治療涎腺腺樣囊性癌和科學(xué)評(píng)估意義重大。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between Microvessel Pattern,Density and Radiographic Parameters and Prognosis of Adenoid Cystic Carcinoma

WANGRui,LILiHeng,XIELijuan,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075000

Objective To investigate the correlation of microvascular pattern,density and imaging parameters and adenoid cystic carcinoma prognosis.Methods 148 patients with adenoid cystic carcinoma were selected,immunohistochemical staining method was used to detect vascular endothelial cells CD34,CD105 monoclonal antibody expression and salivary gland tumor microvessel density (MVD),differences of CT perfusion parameters,MVD parameter between benign and malignant tumors and their correlation were compared.Results The expression of CD34 in malignant group was significantly higher than that of benign group,but the difference was not statistically significant (P>0.05);CD105 expression in malignant group was significantly higher than that of benign group,but the difference was not statistically significant (P>0.05);malignant group perfusion parameters BF,BV,PS was significantly higher than those of benign group,the difference was statistically significant (P<0.05),while MTT parameter had no statistically significant difference(P>0.05);Spearman was used to analyze correlation between tumor perfusion parameter value and MVD,results showed a positive correlation between BF,PS,BV,MTT and MVD.Conclusion CT perfusion parameters can be more accurate quantitative analysis of the tumor blood perfusion,MVD,CD105 can be specifically labeled tumor vascular endothelial cells,it plays positive role in salivary prognostic evaluation.

Adenoid cystic carcinoma;CT perfusion parameters;Microvessel density (MVD);CD34;CD105

075000 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.09.014

R739.8

A

1001-5930(2016)09-1432-04

2015-10-08

2016-02-14)