（1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 揚(yáng)州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225200）

龔洪泳1，趙明明1,2，范俊俊1,2，張往祥1,2*，衛(wèi)紫星1，張 洋1

不同海棠品種不同葉位葉片3種色素含量的研究

（1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 揚(yáng)州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225200）

龔洪泳1，趙明明1,2，范俊俊1,2，張往祥1,2*，衛(wèi)紫星1，張 洋1

以34個(gè)海棠（Malus spp.）品種為試材，從中選取葉片色彩跨度較大的5個(gè)品種（冬紅M. ‘W inter Red’、阿迪榮M. ‘Addirondack’、亞當(dāng)M. ‘Adams’、魯?shù)婪騇. ‘Rudolph’和完美紫M. ‘Perfect Purple’），用光譜法與溶液法對(duì)葉綠素、類胡蘿卜素、花青素3種葉片色素相對(duì)含量及絕對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定、耦合，通過耦合函數(shù)計(jì)算其余29個(gè)海棠品種葉片色素的絕對(duì)含量。結(jié)果表明，3種色素絕對(duì)含量與相對(duì)含量擬合的相關(guān)系數(shù)分別為R2= 0.987 5（葉綠素）、R2= 0.999 4（類胡蘿卜素）、R2= 0.990 5（花青素），方程擬合度較好；在海棠的不同葉位中，各品種上位葉的葉綠素含量比中、下位葉低，上中位葉類胡蘿卜素和花青素比下位葉高。

海棠葉片；葉位；色素含量；耦合函數(shù)

海棠花（Malus spectabilis）是薔薇科蘋果屬（Malus）的喬木[1]，品種豐富，樹姿優(yōu)美，花開似錦，入秋后金果滿樹，芳香襲人，自古以來是我國(guó)著名觀賞樹種[2]。海棠葉色多樣（紅色、紫色、綠色等），具有極高的觀葉價(jià)值，在公園綠化以及建筑裝飾中已獲得廣泛關(guān)注[3]。葉色是各種色素綜合作用所表現(xiàn)出來的結(jié)果，不同色素種類及其含量的時(shí)空組合最終決定葉色[4]。對(duì)于不同海棠品種色素含量的研究已有報(bào)道，如張往祥等[5]對(duì)于觀賞海棠品種群開花進(jìn)程中色素組分動(dòng)態(tài)特征的研究，韓振云等[6]在探討UFGT基因在觀賞海棠葉片呈色過程中的作用時(shí)研究了其花色素苷的含量，李玲[7]對(duì)王族海棠（Malus‘Royalty’）葉片內(nèi)色素進(jìn)行了定性分析，孫方行等[8]研究了鹽脅迫下兩種海棠光合能力及色素含量的變化。但是，這些研究多重點(diǎn)圍繞海棠花朵色素含量進(jìn)行，或者是少部分海棠葉片色素含量的研究，沒有形成針對(duì)海棠品種群葉片色素含量的研究體系。此外，傳統(tǒng)的植物色素含量的測(cè)定多用比色法[9～13]或液相色譜法[14～15]，但是，這兩種方法均需破壞性取樣，且測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、成本高，無法對(duì)葉片生長(zhǎng)過程中的色素含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)。目前，隨著高光譜遙感技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員開始利用光譜分析系統(tǒng)進(jìn)行色素含量監(jiān)測(cè)[16～17]，且已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過比色法測(cè)定的色素絕對(duì)含量與光譜分析系統(tǒng)測(cè)定的相對(duì)含量具有一定的相關(guān)性[18]。

本研究將比色法測(cè)得的海棠葉片色素絕對(duì)含量與光譜法測(cè)得的相對(duì)含量進(jìn)行耦合，并計(jì)算其他海棠色素含量，進(jìn)而分析觀賞海棠上、中、下位葉片色素含量的差異，為海棠葉片色素定性評(píng)價(jià)體系提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)仙女鎮(zhèn)，119°55′ E，32°42′ N，亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫14.9℃，年平均降水量1 000 mm，無霜期較長(zhǎng)。試驗(yàn)地土壤肥沃，地勢(shì)平坦，灌排條件良好。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料有34個(gè)海棠品種，均為1年生嫁接苗，多引自歐美地區(qū)，在長(zhǎng)三角地區(qū)生長(zhǎng)適應(yīng)，葉色豐富，表現(xiàn)良好（見表1）。

表1 試驗(yàn)品種Table 1 Name of cultivars

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液法測(cè)定葉片色素絕對(duì)含量

（1）樣品采集 從供試樣品選取葉片色彩差異較大的5個(gè)品種（冬紅、阿迪榮、亞當(dāng)、魯?shù)婪?、完美紫），利用比色法進(jìn)行色素含量的測(cè)定。每個(gè)品種隨機(jī)采集10片葉，立即放入冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)定其色素含量。

（2）測(cè)定方法 葉綠素與類胡蘿卜素含量的測(cè)定參考李合生的方法[19]。計(jì)算方法為：葉綠素a，Ca=13.95A665-6.88A649；葉綠素b，Cb=24.96A649-7.32A665，兩者相加為葉綠素總濃度；類胡蘿卜素為 1 000A470-2.05Ca-114.8Cb/245。求得色素濃度后，再按下式計(jì)算葉片中單位鮮重各色素含量。葉綠體色素含量（mg/g）為色素濃度、提取液體積、稀釋倍數(shù)乘積與樣品鮮質(zhì)量的比值。

葉片中花青素的含量使用鹽酸乙醇法測(cè)定[20]。依據(jù)公式λ=來計(jì)算花青素光密度值，再依據(jù)下式計(jì)算花青素含量（Y，nmol/g）：

Y =λ/ε×V/M×100 000 0

式中，λ表示花青素在530nm波長(zhǎng)下的光密度；ε表示花青素摩爾消光系數(shù)，為4.62×106；V表示提取液總體積（m L）；M表示取樣質(zhì)量（g）；100 000 0表示計(jì)算結(jié)果換算成nmol的倍數(shù)。

1.3.2 光譜法測(cè)定葉片色素相對(duì)含量

（1）樣品采集 所取試材為試驗(yàn)苗木地向陽處同一方位，取植株上位葉（頂端葉片）、中位葉（二級(jí)枝條頂端第2、第3片葉片）、下位葉（二級(jí)枝條第5、第6片葉）各5片，保持所采集葉片健康無蟲害、長(zhǎng)勢(shì)相同、顏色均勻一致。于6：00-8：00采集試驗(yàn)材料，即刻分別放入樣品保鮮袋，封口后置于裝有冰塊的保鮮箱中帶回室內(nèi)，6 h內(nèi)完成測(cè)量[21]。

（2）測(cè)定方法 利用葉片中各種色素對(duì)光譜反射特性不同，測(cè)定樣品對(duì)不同光譜的反射特性便能測(cè)出其中多種不同色素的含量，如葉綠素、類胡蘿卜素以及花青素循環(huán)庫的大小等指標(biāo)[22]。所用儀器為Unispec光譜儀（英國(guó)PPSystems公司），通過測(cè)定葉片的反射光譜值，計(jì)算出葉片中色素的相對(duì)含量。計(jì)算公式葉綠素為（R750-R445）/（R705-R445），類胡蘿卜素為R800（1/R520-1/R700），花青素為R800（1/R550-1/R700）[23]。

1.3.3 擬合耦合函數(shù)及數(shù)據(jù)處理 構(gòu)建擬合耦合函數(shù)[24]，將色彩跨度較大的5個(gè)海棠品種色素的絕對(duì)含量和相對(duì)含量進(jìn)行擬合，得到耦合函數(shù)，并應(yīng)用于其他海棠品種葉片色素絕對(duì)含量的換算，得出運(yùn)用光譜分析儀測(cè)定植物葉片色素含量的新方法[23]。

利用Excel軟件繪制葉綠素、類胡蘿卜素、花青素柱狀圖，利用Matlab 7.0軟件繪制其三維圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)海棠品種葉綠素等3種色素的相對(duì)含量和絕對(duì)含量

表2為葉片色彩梯度較大的5個(gè)海棠品種的色素含量。對(duì)于葉片色素絕對(duì)含量而言，在這5個(gè)海棠品種中，葉綠素、類胡蘿卜素、花青素最高的均為魯?shù)婪?；葉綠素最低為亞當(dāng)；類胡蘿卜素和花青素最低為冬紅。對(duì)于葉片色素相對(duì)含量而言，在這5個(gè)海棠品種中，葉綠素最高的為完美紫，類胡蘿卜素和花青素最高的均為魯?shù)婪?；葉片中葉綠素最低的為魯?shù)婪?，類胡蘿卜素和花青素最低的均為冬紅。

表2 葉綠素、類胡蘿卜素、花青素的絕對(duì)含量和相對(duì)含量Table 2 Absolute and relation content of chlorophyll， carotenoid and anthocyanidin in leaves of 5 cultivars

2.2 色素絕對(duì)含量與相對(duì)含量的函數(shù)耦合

觀賞海棠葉片各色素含量的耦合函數(shù)中，葉綠素為y = 1.64 x2-7.53 x+10.67（R2= 0.987 5），類胡蘿卜素為y = 0.28 x+0.24（R2= 0.999 4），花青素為y = 0.002 5 x+0.001 5（R2= 0.9905）。3種色素?cái)M合效果較好（圖1），可適用于29種海棠葉片色素絕對(duì)含量的計(jì)算。

圖1 3種色素絕對(duì)含量與相對(duì)含量的耦合函數(shù)Figure 1 Coupling function for absolute and relative content of 3 pigments

2.3 海棠葉片色素含量分析

基于29個(gè)海棠品種葉片的3種色素建立三維圖，見圖2。

從上位葉到下位葉，葉綠素維度方向出現(xiàn)位點(diǎn)總體右移趨勢(shì)（葉綠素含量增加），高葉綠素含量的品種比例增加。上位葉葉綠素含量在 2.04～7.37，羅賓遜的葉綠素含量最低，紫寶石的葉綠素含量最高；中位葉葉綠素含量在2.04～8.62，亞瑟王的葉綠素含量最低，紫寶石的葉綠素含量最高；下位葉中葉綠素含量在2.03～6.15，阿美的葉綠素含量最低，紫寶石的葉綠素含量最高。

在類胡蘿卜素維度方向隨著葉位的下移，出現(xiàn)位點(diǎn)總體右移趨勢(shì)（類胡蘿卜素含量下降），高類胡蘿卜素含量的品種比例減少。上位葉類胡蘿卜素含量在 0.25～2.33，亞瑟王類胡蘿卜素含量最低，皇家類胡蘿卜素含量最高；中位葉類胡蘿卜素含量范圍在0.31～1.11，紫寶石類胡蘿卜素含量最低，時(shí)光秀類胡蘿卜素含量最高；下位葉類胡蘿卜素含量范圍在0.28～1.02，紫寶石類胡蘿卜素含量最低，皇家類胡蘿卜素含量最高。

從上位葉到下位葉，在花青素維度方向出現(xiàn)位點(diǎn)總體下移趨勢(shì)（花青素含量下降），花青素含量的葉片比例減少，上位葉花青素含量范圍在0.01～0.017，絢麗花青素含量最低，時(shí)光秀花青素含量最高；中位葉花青素含量范圍在0.001～0.007，冬金花青素含量最低，皇家花青素含量最高；下位葉花青素含量范圍在0.001～0.004之間，黃玉花青素含量最低，天鵝絨住花青素含量最高。

圖2 不同葉位海棠葉片色素含量Figure 2 Pigment content in leaves of different position

3 結(jié)論與討論

3.1 植物葉片色素含量的無損傷測(cè)定

傳統(tǒng)的色素提取過程和測(cè)定過程都比較費(fèi)時(shí)耗力，并且操作步驟繁瑣，測(cè)定過程還需要破壞大量的植物材料。在可見光波段內(nèi)，利用植被高光譜信息估測(cè)色素含量具有可行性[24～25]，因此，色素測(cè)定的新方法是選擇 5個(gè)色彩跨度較大的品種作為梯度標(biāo)準(zhǔn)，利用光譜儀測(cè)定其色素相對(duì)含量，比色法測(cè)定其絕對(duì)含量，構(gòu)建色素相對(duì)含量和絕對(duì)含量的耦合關(guān)系，得出兩者的換算公式[26]。該方程只能應(yīng)用于薔薇科蘋果屬不同海棠品種葉片的色素含量測(cè)定[27]。這種新方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法，操作簡(jiǎn)單，降低了對(duì)材料的浪費(fèi)，避免了對(duì)植株造成機(jī)械損傷，可以用于不同海棠葉片色素含量測(cè)定[26]。

3.2 觀賞海棠不同葉位色素含量差異分析

植物不同葉位間色素含量是有差異的，王美玲等[28]研究顯示兩個(gè)紫甘藍(lán)品種葉綠素含量在上位葉中最低，中位葉和下位葉差異不明顯；花青素含量在上位葉中含量最高，中位葉中含量最低。

本研究通過溶液法及光譜法測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行耦合后，計(jì)算得出29個(gè)觀賞海棠品種的色素含量，結(jié)果顯示，觀賞海棠葉片的葉綠素、類胡蘿卜素及花青素含量在不同葉位上是有差別的。上位葉的葉綠素含量比中、下位葉低，這是由于上位葉多為嫩葉，中位葉和下位葉多為老葉，隨著葉片的逐漸成熟，葉綠素含量也逐漸增加，這與郝峰鴿[29]的研究結(jié)果一致。此外，上位葉及中位葉比下位葉的光照時(shí)間長(zhǎng)，光照強(qiáng)度大，且不同光照強(qiáng)度下葉片的凈光合速率、蒸騰速率不同[30]，所以海棠葉片上、中位葉類胡蘿卜素含量和花青素含量比下位葉高。

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Determ ination of Pigment Content in Different Cultivars of Malus spp. Leaves at Different Position

GONG Hong-yong1，ZHAO M ing-ming1,2，F(xiàn)AN Jun-jun1,2，ZHANG Wang-xiang1,2*，WEI Zi-xing1，ZHANG Yang1
（1. Forestry College of Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China; 2. Yangzhou Small Apple Horticulture Co.，Ltd. Yangzhou 225200，China）

Five cultivars of Malus spp. （namely ‘W inter Red’， ‘Addirondack’， ‘Adams’， ‘Rudolph’ and ‘Perfect Purple’） with different color in leaf were selected from a total of 34 cultivars for measuring their pigment content at upper， middle and lower leaf position by spectral reflectance and solution method. Absolute and relative contents of chlorophyll， carotenoids and anthocyanins of determined cultivars were coupled function to calculate absolute pigment content in leaves of the left 29 cultivars. The result demonstrated that correlation coefficient R2was 0.9875 for chlorophyll， 0.9994 for carotenoids and 0.9905 for anthocyanins. Chlorophyll content in leaves at upper position was lower than that at m iddle and lower position， but carotenoids and anthocyanins content was the opposite.

leaf of Malus spp.; leaf position; pigment content; coupling function

S718.43；S661.4中文標(biāo)識(shí)碼：A

1001-3776（2016）02-0044-05

2015-11-18；

：2016-01-13

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目："彩葉觀賞海棠新品種選育"201410298067Y

龔洪泳（1993- ），女，本科生，從事觀賞植物栽培研究；*通訊作者。