李曼麗，趙文，高鈺丹，段紅梅，楊朝陽(yáng)，李曉光,

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期同步化的方法及對(duì)向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響①

李曼麗1，趙文2，高鈺丹2，段紅梅1，楊朝陽(yáng)2，李曉光1,2

目的分析不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞同步化于G0/G1時(shí)期的效果以得到最佳的同步化條件，并研究同步化對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)的作用下分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響。方法分離培養(yǎng)成年大鼠BMSCs，5%、1%、0.5%、0.1%、0胎牛血清(FBS)分別處理24 h、48 h。PI染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞所占比例，與正常培養(yǎng)條件(10%FBS)處理下對(duì)比。得到最佳處理?xiàng)l件后，bFGF處理3 d、7 d，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Nestin和Tuj-1的表達(dá)。結(jié)果成年大鼠BMSCs原代提取，經(jīng)傳代后，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形。不同處理?xiàng)l件下G1/G0期細(xì)胞比例均高于正常培養(yǎng)條件，1%FBS處理48 h時(shí)G1/G0期細(xì)胞比例為(94.274±0.468)%，達(dá)最高峰(F=39.91,P＜0.001)。bFGF誘導(dǎo)3 d后，細(xì)胞周期同步化后的Nestin+細(xì)胞數(shù)顯著高于未同步化的細(xì)胞數(shù)[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001)；bFGF誘導(dǎo)7 d后，同步化后的Tuj-1+細(xì)胞數(shù)顯著高于未同步化的細(xì)胞數(shù)[(74.8±3.2)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001)。結(jié)論1%FBS處理48 h是將BMSCs同步化于G0/G1期的最佳條件。細(xì)胞周期同步化于G0/G1期能夠提高BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的比例。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞周期；同步化；血清饑餓法；神經(jīng)分化；大鼠

[本文著錄格式]李曼麗，趙文，高鈺丹，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期同步化的方法及對(duì)向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(12):1399-1403.

CITED AS:LiML,ZhaoW,Gao YD,etal.Cell cycle synchronization Methods of bonemarrow mesenchymalstem cellsand itseffect on neuraldifferentiation[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(12):1399-1403.

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymal stem cells, BMSCs)來(lái)源于骨髓，是骨髓中區(qū)別于造血干細(xì)胞的具有多向分化潛能，能夠向骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)，甚至跨越胚層向神經(jīng)組織分化的細(xì)胞[1-8]。Woodbury等發(fā)現(xiàn)，在特定誘導(dǎo)條件下，來(lái)源于成年鼠和人的BMSCs可以分化為神經(jīng)元[9-10]。由于其來(lái)源廣泛并具有多向分化潛能，已經(jīng)成為基因治療或組織工程[11-14]的細(xì)胞資源。但是，骨髓中BMSCs含量極少，占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.1%，故在有限的細(xì)胞數(shù)量中提高細(xì)胞分化比例成為組織工程及細(xì)胞體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的重中之重。

細(xì)胞進(jìn)入或退出細(xì)胞周期與細(xì)胞命運(yùn)息息相關(guān)[15]。G0/G1期是細(xì)胞進(jìn)入或退出細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)期。細(xì)胞周期關(guān)鍵的限制位點(diǎn)在G1期末期。如果細(xì)胞通過(guò)這一限制點(diǎn)，將幾乎無(wú)一例外地完成細(xì)胞周期。而如果通過(guò)某些抑制手段來(lái)阻斷細(xì)胞周期使其停留在G1期，則能促進(jìn)分化[16]。相較于物理和化學(xué)方法將BMSCs細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，血清饑餓法對(duì)于細(xì)胞的傷害較小。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastgrow th factor,bFGF)，又稱FGF-2，具有促進(jìn)神經(jīng)組織生長(zhǎng)發(fā)育、血管生成、創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)等作用[17]。有研究利用bFGF結(jié)合多聚賴氨酸成功將BMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)絲蛋白(nerve fibers,NF)陽(yáng)性的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BMSCs的黏附特性，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取BMSCs[18-19]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)在不同胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)濃度下，不同處理時(shí)間時(shí)處于G0/G1時(shí)相的細(xì)胞比例，從而確定最佳的處理?xiàng)l件。本研究還利用bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞周期同步化組和未同步化組，于不同的誘導(dǎo)時(shí)間檢測(cè)其向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力和區(qū)別，探索采用血清饑餓法同步化BMSCs于G0/G1期的最優(yōu)條件，為提高BMSC的分化比例提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar成年大鼠6只，體質(zhì)量200 g，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，許可證號(hào)SYXK(京)2013-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠BMSCs提取、培養(yǎng)和傳代

1.2.1.1 提取和培養(yǎng)

成年Wistar大鼠腹腔注射4%水合氯醛6m l/kg麻醉。分離股骨和脛骨，去除股骨和脛骨上多余肌肉、血管、筋膜等并暴露骨兩端，含青鏈霉素雙抗PBS沖洗3次后，于PBS中浸泡。注射器吸取含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基從股骨和脛骨中將骨髓細(xì)胞沖洗出來(lái)，10m l DMEM培養(yǎng)基于濕潤(rùn)的37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞全換液，去除不貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.2 傳代

待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%細(xì)胞融合時(shí)，用含有雙抗的PBS洗滌3次，每皿中加入胰酶+乙二胺四乙酸(ethylene diam ine tetraacetic acid,EDTA)2m l晃勻，保證每個(gè)細(xì)胞都能接觸到。2m in后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形時(shí)，每皿加入等體積含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000 r/m in離心5 m in，棄上清后將沉淀均分到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，分別加入10m l培養(yǎng)基于濕潤(rùn)的37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%細(xì)胞融合狀態(tài)時(shí)，同樣的方法傳代至P3代備用。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記

收獲P3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，0.25%胰酶消化2 m in，4℃、1000 r/m in離心5m in，PBS(含青鏈霉素雙抗)清洗細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，棄上清加入熒光標(biāo)記一抗(PE-Cy5-labeled anti-Rat CD45/FITC-labeled anti-Rat CD90)，平均每1×106個(gè)細(xì)胞加1μl，冰上孵育40m in后，PBS洗滌1次，5m in，上機(jī)檢測(cè)，PBS洗滌細(xì)胞3次，除去未結(jié)合抗體，PBS 500μl重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.3 大鼠BMSCs血清饑餓處理

P3代細(xì)胞種植于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后分組處理。分組情況如下：5%、1%、0.5%、0.1%、0 FBS處理24 h；5%、1%、0.5%、0.1%、0 FBS處理48 h。

1.2.4 大鼠BMSCs細(xì)胞周期檢測(cè)

待處理結(jié)束后，PBS洗滌3次。每孔0.25%胰酶+ EDTA 0.5m l消化處理2m in，待細(xì)胞由長(zhǎng)梭形慢慢形變?yōu)閳A形時(shí)，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞至懸浮。收集細(xì)胞至1.5m l EP管中。1000 r/m in離心10 m in，棄上清，PBS重懸細(xì)胞后1000 r/m in離心10m in，棄上清后，邊震蕩邊快速加入70%乙醇至充分混勻，4℃固定細(xì)胞2 h以上。將經(jīng)過(guò)固定的細(xì)胞1000 r/m in離心5m in，重復(fù)2次，棄上清加入RNase1m l37℃反應(yīng)30m in，冷卻至室溫。每管中加入PI染液100μl，30 s后，EPICSXL coulter流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 BMSCs的誘導(dǎo)分化

P3代細(xì)胞種植于包被有左旋多聚賴氨酸(SIGMA)的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后向培養(yǎng)基中添加20 ng/m l bFGF(SIGMA)，2～3 d半量換液一次。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法，3 d后檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin的表達(dá)；7 d后檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物Tuj-1的表達(dá)。

1.2.6 免疫熒光

4%多聚甲醛4℃固定40m in，0.3%TritonX-100破膜5m in，之后用1%封閉用山羊血清室溫封閉30 m in，加入相應(yīng)一抗(Nestin 1∶100,M ILLIPORE；Tuj-1多克隆抗體1∶200)，37℃孵育2 h，加入A lexa594和Alexa488標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠熒光二抗(1∶300，INVITROGEN公司)，37℃避光孵育1 h，Hoechst33342(1∶1500，SIGMA公司)復(fù)染核，50% PB甘油封片，BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS)下觀察照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs形態(tài)和生長(zhǎng)特征

原代提取24 h后，細(xì)胞貼壁且兩端有較長(zhǎng)突起，胞核卵圓形，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，形成大小不一的集落，前期生長(zhǎng)緩慢，達(dá)到80%～90%匯合后傳代。傳代后細(xì)胞增殖較快，呈均勻分布生長(zhǎng)，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，10～14 d傳至P3代細(xì)胞形態(tài)，呈長(zhǎng)梭形。見(jiàn)圖1～圖2。

2.2 大鼠BMSCs的鑒定

第3代BMSCs 95%以上的細(xì)胞為CD45-/CD90+細(xì)胞。即95%以上為BMSCs。見(jiàn)圖3。

圖1 BMSCs原代細(xì)胞形態(tài)(相差顯微鏡，200×)

圖2 P3代細(xì)胞形態(tài)(相差顯微鏡，200×)

圖3 流式雙標(biāo)鑒定BMSCs

2.3 大鼠BMSCs血清同步化條件優(yōu)化

各處理?xiàng)l件下，G1/G0期細(xì)胞數(shù)目與正常培養(yǎng)狀態(tài)即10%FBS處理下都有所增加。見(jiàn)表1。其中1% FBS處理48 h時(shí)，G1/G0期細(xì)胞所占比例為94.27%，達(dá)到最高值(F=39.91,P＜0.001)。見(jiàn)表1。

2.4 細(xì)胞周期同步化于G0/G1期對(duì)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響

基于以上研究，我們選擇1%FBS處理48 h為最佳處理?xiàng)l件，并命名為同步化組，同時(shí)將10%FBS條件定義為非同步化組。bFGF誘導(dǎo)3 d后，同步化組中Nestin+細(xì)胞比例顯著高于非同步化組[(80.3±2.4)%vs. (12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001)。誘導(dǎo)7 d后，同步化組Tuj-1+細(xì)胞數(shù)顯著高于非同步化組[(74.8±3.2)%vs. (19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 bFGF誘導(dǎo)3 d和7 d后Nestin+和Tuj-1+的表達(dá)情況

表1 不同濃度FBS處理24 h、48 h時(shí)各細(xì)胞周期時(shí)相細(xì)胞所占比例(%)

3 討論

BMSCs具有廣泛的臨床應(yīng)用前景?；诟杉?xì)胞的治療在臨床中已取得良好的效果，白血病和某些癌癥治療中都應(yīng)用到干細(xì)胞。理論上，囊胚內(nèi)細(xì)胞層分離的胚胎干細(xì)胞是細(xì)胞治療的最佳細(xì)胞資源，但由于受倫理學(xué)限制及潛在的致畸性和成瘤的可能，應(yīng)用受到限制。BMSCs由于能夠取自自體，避免了上述問(wèn)題，成為熱門資源；目前主要應(yīng)用于局部移植、系統(tǒng)移植、結(jié)合干細(xì)胞的基因治療及組織工程領(lǐng)域中。李曉峰等在大面積的骨缺損骨折中應(yīng)用自體體外擴(kuò)增的BMSCs局部移植獲得成功[19]，BMSCs治療椎骨骨性融合也取得良好效果。在心血管疾病中，BMSCs治療外周動(dòng)脈疾病引起的繼發(fā)性缺血性疾病、冠狀動(dòng)脈疾病獲得巨大的成功[20]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)主要來(lái)源于骨髓，臨床上人類的MSCs一般從髂前上棘抽取[21]。骨髓中MSCs所占比例相當(dāng)少，大約為0.0001%，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離和擴(kuò)增。目前分離MSCs的方法主要有密度梯度離心、免疫磁珠分選、貼壁培養(yǎng)法等。本實(shí)驗(yàn)采用的是全骨髓貼壁培養(yǎng)法，利用MSCs在塑料制品中貼壁生長(zhǎng)并形成類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，經(jīng)傳代后，細(xì)胞擴(kuò)增速度較快[23]。研究者們使用MSCs的方法各異，進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化的分離過(guò)程仍有待于對(duì)其生物學(xué)特征和機(jī)制的深入研究。

骨髓來(lái)源MSCs細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，為了得到純度較高的MSCs，急需對(duì)得到的MSCs進(jìn)行鑒定。鑒定方法主要有三種。①BMSC具有在塑料制品中的貼附性。②具有能夠向骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞的分化能力。③利用細(xì)胞表面抗原標(biāo)志，排除造血干細(xì)胞特征。本實(shí)驗(yàn)中采用CD45和CD90共標(biāo)的方法，利用CD45排除造血干細(xì)胞可能，CD90為干細(xì)胞表面標(biāo)記。95%以上的細(xì)胞表達(dá)CD90并且為CD45陰性。如此，即可鑒定我們提取的細(xì)胞為BMSCs。

細(xì)胞周期對(duì)于調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化非常重要。G0/G1期為細(xì)胞走向增殖還是分化的關(guān)鍵限制點(diǎn)。細(xì)胞通過(guò)本限制點(diǎn)后將無(wú)一例外的走向增殖[22-23]。為了分化，在G1期，細(xì)胞需要離開(kāi)細(xì)胞周期而進(jìn)入G0期[24-25]。這表明，通過(guò)某些細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)抑制劑的過(guò)表達(dá)來(lái)阻斷細(xì)胞周期使其停留在G1期，能促進(jìn)分化，而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞通過(guò)G1期能抑制分化[26]。本研究的目的為探索將BMSCs的細(xì)胞周期同步化在G1/G0期的最優(yōu)條件，即盡可能多地將細(xì)胞阻滯在G1/G0期，使更多的細(xì)胞走向分化，從而提高細(xì)胞分化比例。本研究結(jié)果也說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題，即細(xì)胞周期同步化于G0/G1期能夠促進(jìn)更多的BMSCs在bFGF的誘導(dǎo)作用下走向分化。

研究發(fā)現(xiàn)，降低血清濃度可以提高G1/G0期細(xì)胞比例，但是BMSCs的生長(zhǎng)是需要一定濃度血清的，降低血清濃度雖然能夠提高G1/G0期細(xì)胞比例，但是同樣造成了一定程度上細(xì)胞活性的降低，所以尋找最佳的處理?xiàng)l件非常關(guān)鍵。本研究在比較不同濃度的處理?xiàng)l件后發(fā)現(xiàn)，1%FBS處理48 h不僅能夠最大程度提高G1/G0期細(xì)胞比例，同時(shí)還能保持較好的細(xì)胞活力。

細(xì)胞周期同步化是指將正常生長(zhǎng)的細(xì)胞通過(guò)物理、化學(xué)或是其他方法改變細(xì)胞周期進(jìn)程，使大部分的細(xì)胞處于某一個(gè)特定的時(shí)期。有研究顯示，利用RoscovitineATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與ATP競(jìng)爭(zhēng)CDK的ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制CDK的活性(CDK1、CDK2、CDK5、CDK7)能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G0/G1期。但是，外源性的化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞的損傷無(wú)法估計(jì)。血清饑餓法同步化細(xì)胞，不添加任何外源化學(xué)試劑，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，是目前研究者們普遍采取的方法。但處理?xiàng)l件的不確定為同步化細(xì)胞制造了障礙，本研究確定了采用血清饑餓法同步化細(xì)胞的最佳條件。

綜上所述，本研究提供了一種區(qū)別于物理、化學(xué)方法的同步化BMSCs的方法，并確定了最佳的處理?xiàng)l件。為進(jìn)一步研究BMSCs高比例分化為目標(biāo)細(xì)胞提供了方法，為BMSCs應(yīng)用于臨床研究奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。

[1]Pittenger MF,M ackay AM,Beck SC,et al.M ultilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411): 143-147.

[2]Ding Z,Liu X,Ren X,etal.Galectin-1-induced skeletalmuscle celldifferentiation of mesenchymal stem cells seeded on an acellular dermal matrix improves injured anal sphincter[J].Discov Med,2016,21(117): 331-340.

[3]?zdal-Kurt F,Tu?lu I,Vatansever HS,etal.The effectof different implantbiomaterialson the behavior of canine bonemarrow stromal cells during their differentiation into osteoblasts[J].Biotech Histochem, 2016,91(6):412-422.

[4]Zhang LY,Xue HG,Chen JY.Genistein induces adipogenic differentiation in human bone marrow mesenchymal stem cells and suppresses their osteogenic potential by upregulating PPARγ[J].Exp Ther Med, 2016,11(5):1853-1858.

[5]Kokai LE,Rubin JP,Marra KG.The potentialof adipose-derived adult stem cells as a source of neuronal progenitor cells[J].Plast Reconstr Surg,2005,116(5):1453-1460.

[6]Zhou S,Eid K,Glowacki J.Cooperation between TGF-beta and Wnt pathways during chondrocyte and adipocyte differentiation of human marrow stromalcells[J].JBoneM iner Res,2004,19(3):463-470.

[7]Oliveira JM,Rodrigues MT,Silva SS,et al.Novel hydroxyapatite/chitosan bilayered scaffold for osteochondral tissue-engineeringapplications:scaffold design and its performance when seeded w ith goat bone marrow stromalcells[J].Biomaterials,2006,27(36):6123-6137.

[8]Traktuev DO,Parfenova EV,Tkachuk VA,et al.Adipose stromal cells-plastic type of cells w ith high therapeutic potential[J].Tsitologiia, 2006,48(2):83-94.

[9]Li B,Duan P,Li C.Role of autophagy on bonemarrow mesenchymal stem-cell proliferation and differentiation into neurons[J].Mol Med Rep,2016,13(2):1413-1419.

[10]Woodbury D,Schwarz EJ,Prockop DJ,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neurosci Res,2000,61(4):364-370.

[11]段紅梅,楊朝陽(yáng),李曉光,等.殼聚糖-堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子載體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2011,17(4):329-333.

[12]涂曉萌,段紅梅,饒家聲,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(10):916-921.

[13]王聰,楊朝陽(yáng),段紅梅,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子殼聚糖載體誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化并形成突觸的研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(4):406-411.

[14]Caviness VS Jr,Sidman RL.Time of origin or corresponding cell classes in the cerebral cortex of normaland reelermutantm ice:an autoradiographic analysis[J].JComp Neurol,1973,148(2):141-151.

[15]Bilitou A,Ohnuma S.The role of cell cycle in retinaldevelopment:cyclin-dependent kinase inhibitors coordinate cell-cycle inhibition, cell-fate determination and differentiation in the developing retina[J]. Dev Dyn,2010,239(3):727-736.

[16]Lange C,Huttner WB,Calegari F.Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1,delays neurogenesis,and promotes the generation and expansion of basal progenitors[J].Cell Stem Cell, 2009,5(3):320-331.

[17]Gu Y,Xue C,Zhu J,et al.Basic fibroblastgrow th factor(bFGF)facilitates differentiation of adult dorsal root ganglia-derived neural stem cells toward Schwann cells by binding to FGFR-1 through MAPK/ERK activation[J].JMolNeurosci,2014,52(4):538-551.

[18]楊麗,張榮華,謝厚杰,等.建立大鼠BMSC穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(6):1064-1068.

[19]李曉峰,趙勁民,蘇偉,等.大鼠BMSC培養(yǎng)與鑒定[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(10):1721-1725.

[20]White IA,Sanina C,Balkan W.Mesenchymal stem cells in cardiology[J].MethodsMol Biol,2016,1416:55-87.

[21]Deb A,Wang S,Skelding K,etal.Bonemarrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart:study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients[J].Circulation,2003,1079(9): 1247-1249.

[22]M icheli L,Ceccarelli M,Farioli-Vecchioli S.Control of the normal and pathological development of neural stem and progenitor cells by the PC3/Tis21/Btg2 and Btg1 Genes[J].JCell Physiol,2015,230(12): 2881-2890.

[23]Yamada T,M inoda R,Miwa T,etal.Neurogenesisof the spiralganglion cells in the cochlea requires the transcriptional cofactor TIS21[J]. Neurosci Lett,2015,584:265-269.

[24]Kuypers NJ,Bankston AN,Howard RM.Remyelinating oligodendrocyte precursor cellmiRNAs from the Sfmbt2 cluster promote cell cycle arrestand differentiation[J].JNeurosci,2016,36(5):1698-1710.

[25]An Q,Han C,Zhou Y,etal.In vitro effects ofm itomycin C on the proliferation of the non-small-cell lung cancer line A549[J].Int JClin Exp Med,2015,8(11):20516-20523.

[26]Ohnuma S,Hopper S,Wang KC,etal.Co-ordinating retinalhistogenesis:early cell cycle exit enhances early cell fate determination in the Xenopus retina[J].Development,2002,129(10):2435-2446.

Cell Cycle Synchronization Methods of BoneM arrow M esenchymal Stem Cellsand Its Effecton NeuralDifferentiation

LIMan-li1,ZHAOWen2,GAO Yu-dan2,DUANHong-mei1,YANG Zhao-yang2,LIXiao-guang1,2
1.Departmentof BiomedicalEngineering,Schoolof BiologicalScienceand Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.Departmentof Neurobiology,CapitalMedical University,Beijing 100069,China

ObjectiveTo analyze theeffectof different treatmentconditionson cells synchronization in G0/G1 phase to get thebestcondition,and to explore its effect on neural differentiation of bonemarrow mesenchymal stem cells(BMSCs)induced by basic fibroblast grow th factor(bFGF).MethodsBMSCswere isolated and cultured in 5%,1%,0.5%,0.1%,0 fetalbovine serum(FBS)respectively,for 24 hours and 48 hours.A fter PIstaining,cell cycle proportions of each phasewere detected by flow cytometry,and were compared with the normal group(10%FBS).A fter the optimal treatment condition was got,20 ng/m l bFGFwas added into synchronization group and unsynchronization group 3 days and 7 days,respectively.The expression of Nestin and Tuj-1 were detected with immunofluorescence.ResultsAdult rat BMSCswere isolated from bonemarrow and cultured,after passage,the cellswerew ith long spindle shape.Compared with the normal group,the cell proportion of G1/G0 phase increased under different treatments,peaked with(94.274±0.468)%under 1%FBS,48 hours(F=39.91,P＜0.001).AfterbFGF induction for3 days,the Nestin+cellnumberwas higher in the synchronization group than in theunsynchronization group[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001).A fter bFGF induction for 7 days,the Tuj-1+cell numberw as higher in the synchronization group than in the unsynchronization group[(74.8±3.2%)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001).Conclusion1%FBS,48 hours is the optimal condition to BMSCs synchronization in G0/G1 phase,which can promote the neural differentiation of BMSCs.

bonemarrow mesenchymalstem cells;cell cycle;synchronization;serum starvation;neuraldifferentiation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.007

R329.2

A

1006-9771(2016)12-1399-05

2016-06-17

2016-08-01)

1.國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012AA 020206)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.31271037)；3.國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際合作與交流項(xiàng)目(No.31320103903)；4.“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012BAI17B04)；5.高等學(xué)校全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.201356)；6.國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(No.2014DFA 30640)；7.國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(No.31130022)。

1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京市100069。作者簡(jiǎn)介：李曼麗(1985-)，女，漢族，河北安新縣人，博士研究生，主要研究方向：干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。通訊作者：李曉光。E-mail:lxgchina@sina.com。