王風波+唐明薇+董海

[摘要] 目的 探討電針對腦出血大鼠出血同側(cè)海馬區(qū)Nogo-A表達的影響及作用機制。 方法 將66只成年SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和腦出血組，腦出血組再隨機分為非干預組和電針組，Ⅶ型膠原酶腦內(nèi)注射誘導大鼠尾狀核出血，電針組于造模次日開始電針干預，各組大鼠于第2、5、10、15天取出血側(cè)海馬C1區(qū)腦組織石蠟切片行Nogo-A免疫組化檢測，每例腦組織取3張切片，每張切片于400倍光鏡下隨機選取5個互不疊加視野計數(shù)陽性細胞并取其平均值。 結(jié)果 腦出血組大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)域有血腫形成；與對照組比較，非干預組與電針組海馬區(qū)Nogo-A陽性表達水平均顯著增強（P < 0.01），而電針組較非干預組表達水平明顯下降（P < 0.01）。 結(jié)論 電針干預可顯著抑制腦出血大鼠腦內(nèi)Nogo-A的表達，有利于腦出血后中樞神經(jīng)軸突的再生修復，促進神經(jīng)功能恢復。

[關(guān)鍵詞] 電針；海馬區(qū)；腦出血；Nogo-A

[中圖分類號] R245.97 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（c）-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanism of electro-axupuncture on the expression of Nogo-A in hippocampus at the same side of bleeding in rats with cerebral hemorrhage. Methods Sixty-six adult SD rats were randomly divided into control group and cerebral hemorrhage group by the random number table， and the cerebral hemorrhage group was randomly divided into non-intervention group and electro-axupuncture group. Hemorrhage of caudate nucleus in rats was induced by intracerebral injection of collagenase Ⅶ， the electro-axupuncture group was given electro-axupuncture intervention in the next day of molding， the rats of all groups were taken paraffin section of brain tissues in C1 area of hippocampus of bleeding side at the second， fifth， tenth， fifteenth day， each case of brain tissue was taken 3 slices， 5 non-overlapping field of views were randomly selected from each slice under 400 times light microscope to count the positive cells and take the average value. Results The cerebral hemorrhage group had hematoma at the right caudate nucleus. Compared with the control group， the positive expression levels of Nogo-A in hippocampus of non-intervention group and electro-axupuncture group were significantly enhanced （P < 0.01）， while the expression level of electro-axupuncture group was significantly lower than that of non-intervention group （P < 0.01）. Conclusion Electro-axupuncture can significantly inhibit the expression of Nogo-A in rats with cerebral hemorrhage， which is helpful for the regeneration and repair of nervous centralis axon after cerebral hemorrhage and to promote the recovery of neurological function.

[Key words] Electro-axupuncture； Hippocampus； Cerebral hemorrhage； Nogo-A

腦出血是危害性最大的腦卒中類型，嚴重危害患者身心健康，雖然隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的不斷進步，腦出血的病死率明顯降低，但其所致的神經(jīng)行為學功能障礙往往康復周期長，治療效果慢，嚴重影響患者生活質(zhì)量及重返社會。腦卒中后中樞神經(jīng)軸突的修復與再生機制十分復雜，受到神經(jīng)生長促進因素與軸突生長抑制因素的雙重調(diào)節(jié)[1]。Nogo-A來源于神經(jīng)髓鞘細胞，是已知的一種對神經(jīng)軸突再生抑制作用最強烈的網(wǎng)狀蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)Nogo-A在大腦皮層發(fā)育、神經(jīng)元遷移與分化、神經(jīng)生長錐活性調(diào)節(jié)與突觸穩(wěn)定性等方面均發(fā)揮著重要作用[2]。電針作為歷史悠久的傳統(tǒng)與現(xiàn)代醫(yī)學相結(jié)合的康復治療手段，已被臨床廣泛證實可促進腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復，改善記憶及學習能力，但其作用機制目前仍不十分清晰[3]。本研究旨在通過觀察電針干預對腦出血大鼠出血同側(cè)海馬區(qū)Nogo-A的表達影響，進一步探討電針干預在腦出血后中樞神經(jīng)軸突修復與再生過程中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

66只SD成年大鼠（11～12月齡），均雄性，體重200～250 g [成都醫(yī)學院動物實驗中心，合格證號SYXK（川）2015-196]；膠原Ⅶ型（Sigma）；兔抗大鼠Nogo-A抗體及SABC試劑盒（武漢博士德）；大鼠腦立體定位儀（江灣Ⅰ）；動物顱骨鉆（ALC-CED）。

1.2 方法

66只SD大鼠以1～66數(shù)字標識，隨機分為腦出血組（n = 42）、對照組（n = 24），腦出血組又隨機分為非干預組（n = 24）和電針組（n = 18）。參照王風波等[1]及楊潔等[4]的方法制備膠原酶腦內(nèi)注射誘導尾狀核腦出血模型：注射點定位矢狀線右側(cè)3 mm、前囟后0.5 mm，膠原酶與生理鹽水配制為0.6 U/1.5 μL溶液，全程無菌操作，對照組假手術(shù)方法同腦出血組，以同等劑量生理鹽水代替膠原酶。所有大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度24℃左右，干靜陰涼，通風，相對濕度50%左右。術(shù)后第2天（24 h）隨機處死對照組和非干預組大鼠各6只并取腦，觀察腦出血情況，以SABC免疫組化法檢測出血同側(cè)海馬C1區(qū)Nogo-A表達。大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)域有直徑約3 mm的血腫形成為腦出血造模成功。電針組大鼠造模次日開始電針干預，1次/d，共15 d。對照組及非干預組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何干預。各組大鼠分別于第5、10、15天行免疫組化Nogo-A檢測。

1.3 電針干預

電針組大鼠取穴百會、大椎、曲池及足三里，具體操作參照《實驗針灸學》及王風波等[1]的方法，各穴均連接電針儀，頻率5～10 Hz，以致大鼠頭部輕微抖動為度，10 min/次。

1.4 出血側(cè)海馬區(qū)Nogo-A免疫組織化學檢測

免疫組化檢測采用SABC法，陰性對照PBS代替一抗。光鏡下Nogo-A陽性細胞顯示為神經(jīng)元胞漿內(nèi)有棕黃色或棕褐色免疫顆粒。每例腦組織取3張切片，400倍光鏡下隨機選取5個互不疊加的視野，計數(shù)陽性細胞并取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較用q檢驗，非正態(tài)分布及方差不齊用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼及光鏡下大鼠出血側(cè)腦組織病理改變

以進針點冠狀面切開腦組織，可見腦出血組大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)域有直徑約3 mm的血腫形成，光鏡下見血腫區(qū)大量紅細胞滲出，神經(jīng)元變性壞死，血腫邊緣有小膠質(zhì)細胞與中性粒細胞浸潤。對照組大鼠相應區(qū)域無血腫形成。

2.2 大鼠出血側(cè)海馬區(qū)Nogo-A免疫組化檢測情況

對照組右側(cè)海馬C1區(qū)散在分布少量Nogo-A陽性細胞，非干預組、電針組右側(cè)海馬C1區(qū)Nogo-A陽性細胞數(shù)量明顯增多，胞核固縮且形態(tài)多樣。與對照組比較，非干預組、電針組Nogo-A陽性反應在各時間點均明顯增強，陽性細胞計數(shù)顯著上升（P < 0.01）；而電針組大鼠Nogo-A陽性表達水平較非干預組有明顯降低，兩組不同時間點比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖1（封三）、表1。

3 討論

腦出血作為危害性最大的腦卒中類型，約占腦血管意外疾病的20%，目前循證醫(yī)學證實腦出血的有效治療手段依然較少[5]，雖然醫(yī)療設(shè)備和技術(shù)均不斷進步，但腦出血患者致殘率并未有明顯的下降，早期的積極康復介入不僅能夠有效促進患者運動、感覺、認知、語言等功能恢復，還能預防并發(fā)癥，提高生活質(zhì)量，甚至重返社會[6]。中樞神經(jīng)軸突損傷的修復與再生受到神經(jīng)生長因子促進因素與神經(jīng)軸突生長抑制因素的雙重調(diào)節(jié)，有效抑制軸突生長抑制因素的表達水平，對腦卒中后神經(jīng)軸突修復無疑具有重要的意義[1]。Nogo-A是目前已知的抑制作用最強烈的神經(jīng)軸突再生抑制因子，本身是一種網(wǎng)狀蛋白，由Nogo基因表達，與特定受體NgR結(jié)合可誘導神經(jīng)生長錐潰縮、塌陷，在神經(jīng)元的遷移與分化、調(diào)節(jié)神經(jīng)生長錐活性與突觸穩(wěn)定性等方面都扮演著重要角色[2]。有研究顯示Nogo-A只表達于生長錐中心微管區(qū)，在生長錐周圍區(qū)域幾乎未見陽性信號，提示Nogo-A可能主要富集于胞體、突起及生長錐的微管區(qū)，通過調(diào)控微管活性及乙?；接绊戄S突生長[7]。趙修等[8]在彌漫性軸索損傷大鼠的大腦皮層、白質(zhì)、海馬、胼胝體及腦干5個腦區(qū)觀測Nogo-A的表達變化，發(fā)現(xiàn)前述幾個區(qū)域的神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細胞中均可見明顯的Nogo-A表達，其中以神經(jīng)元表達為著，少突膠質(zhì)細胞及其髓鞘相對較少，印證了Nogo-A對其他神經(jīng)元、軸突和非神經(jīng)細胞具有排斥、吸引的雙重功能，在神經(jīng)元-神經(jīng)元、神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞之間的交互作用中很可能起到重要作用。張敏等[9]根據(jù)間歇低氧循環(huán)交替法制備5%間歇低氧組和10%間歇低氧大鼠模型，病理學檢測顯示間歇低氧組大鼠大腦齒狀回神經(jīng)細胞有死亡現(xiàn)象，神經(jīng)元密度下降，死亡神經(jīng)細胞的胞核皺縮濃染，細胞周圍間隙變寬，尤以5%間歇低氧組更為明顯，免疫組織化學檢測到間歇低氧組大鼠齒狀回區(qū)腦細胞胞質(zhì)及軸突突起近側(cè)端內(nèi)Nogo-A表達顯著升高，且隨著腦缺氧的時間增加，Nogo-A的表達水平呈逐漸增高趨勢，與病理學表現(xiàn)相對應，5%間歇低氧組Nogo-A陽性表達水平最高，提示間歇低氧程度越重神經(jīng)元受損越嚴重，Nogo-A陽性反應越顯著。慢性間歇性缺氧的反復缺氧復氧循環(huán)方式所致的病理生理改變類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注過程，大量活性氧自由基的產(chǎn)生引起了氧化應激反應，極易引起中樞神經(jīng)損傷和細胞凋亡。部分海馬齒狀回下區(qū)的新生細胞可遷移到顆粒細胞層分化生成新的樹突及軸突，重新形成突觸聯(lián)系并整合到海馬的神經(jīng)環(huán)路功能，但在腦的慢性間歇缺氧過程中，Nogo-A通過軸突生長抑制區(qū)域Nogo-66與特異性受體NgR相結(jié)合，發(fā)揮出軸突生長抑制作用并導致神經(jīng)細胞生長錐回縮，阻礙軸突生長修復，間接阻斷了受損神經(jīng)纖維的再生及發(fā)育[10]，可能慢性間歇缺氧性腦損傷在一定程度或時間窗可啟動中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復機制，但這種修復信息可刺激產(chǎn)生負反饋作用并上調(diào)神經(jīng)生長抑制因子受體NgR表達水平，提供更多的Nogo-A結(jié)合位點，使Nogo-A得以發(fā)揮出更高的軸突生長抑制水平。

不僅限于大腦組織內(nèi)，有學者還發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷后少突膠質(zhì)細胞和髓磷脂將細胞內(nèi)的Nogo-A釋放出到細胞外基質(zhì)，在脊髓損傷區(qū)呈先抑后揚式表達，在損傷后第7天達高峰，14 d逐漸回落，但仍然高于假手術(shù)組水平，提示脊髓損傷后Nogo-A的高水平表達可能是阻礙神經(jīng)系統(tǒng)恢復與再生的重要因素之一[11]。丁永利等[12]用Nogo-A抗體經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔灌注脊髓全橫斷大鼠，每日1次，共10次，發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓橫斷損傷區(qū)近側(cè)端有較多的再生神經(jīng)纖維，而損傷區(qū)的再生神經(jīng)纖維很少，損傷區(qū)遠側(cè)幾乎無神經(jīng)纖維再生，說明抑制Nogo-A的陽性表達可降低神經(jīng)軸突生長的抑制因素，間接促進中樞神經(jīng)軸突再生，尤其是長纖維傳導束的軸突再生能力。

電針作為集針刺與電刺激優(yōu)點于一體的治療手段，應用于腦卒中已有較豐富和肯定的基礎(chǔ)研究成果。梁艷桂等[13]電針取缺血再灌注損傷大鼠神庭、百會穴，觀察到電針組大鼠腦梗死區(qū)面積明顯減小，提示電針神庭、百會穴可降低腦梗死大鼠的梗死面積，促進腦損傷修復。褚鑫等[14]電針自體血注入法腦出血大鼠百會、人中穴，Berderson行為學評分顯示腦出血組較對照組顯著升高，電針組大鼠出血灶周圍腦組織水腫減輕，炎癥細胞減少，細胞排列規(guī)整，其中6 h電針組改善最為明顯，提示早期電針干預對腦出血后腦組織修復具有積極的作用。有關(guān)電針在腦損傷后Nogo-A表達變化的基礎(chǔ)研究等方面，陳成等[15]電針局灶性腦缺血大鼠天泉、曲澤、內(nèi)關(guān)、大陵諸穴，分別檢測腦梗死區(qū)和血清神經(jīng)生長因子（NGF）與Nogo-A含量，實驗結(jié)果顯示電針可促進大鼠腦梗死區(qū)和血清中NGF的表達并降低血清Nogo-A的含量，二者作為神經(jīng)修復矛盾的雙方，在腦損傷后表達發(fā)生相反變化，說明電針既可改善大鼠腦缺血后突觸超微結(jié)構(gòu)，促進神經(jīng)修復，又能夠降低神經(jīng)軸突抑制因子的表達，從而誘導神經(jīng)軸突再生，減輕腦梗死后的神經(jīng)損害，但需要指出的是，該電針組大鼠腦內(nèi)Nogo-A的表達量組間差異不顯著，提示在腦缺血急性期腦內(nèi)Nogo-A的表達可能不穩(wěn)定。陳吉祥等[16]電針腦缺血再灌注大鼠百會、神庭穴，7 d后電針組梗死側(cè)海馬區(qū)Nogo-A及其受體NgR的表達均顯著下降，同時利用Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，電針組大鼠逃避潛伏期和找到平臺所經(jīng)過的路程較模型組明顯縮短，跨越平臺次數(shù)明顯增加，證明電針在抑制腦缺血大鼠Nogo-A表達與改善學習記憶能力之間呈正相關(guān)。研究成果已經(jīng)證實，針刺腦卒中大鼠百會、曲池、足三里穴可以減輕腦損傷反應，促進損傷恢復，電針功效優(yōu)于單純針刺作用。各種腦卒中后腦區(qū)Nogo-A表達均有不同程度升高，不利于神經(jīng)再生與修復，而早期電針干預有助于抑制Nogo-A的陽性反應。

目前有關(guān)電針干預腦卒中Nogo-A表達變化的基礎(chǔ)研究主要集中于腦梗死及脊髓損傷方面，尚未見到電針對腦出血Nogo-A表達變化影響的相關(guān)研究報道。腦出血大鼠模型制備技術(shù)已經(jīng)較為成熟，并且在筆者前期的研究中初步檢測到腦出血后Nogo-A表達變化相關(guān)情況[1]，基于此，本研究制備Ⅶ型膠原酶誘導尾狀核出血大鼠模型，造模成功次日即開始電針百會、曲池、足三里諸穴，觀察出血后不同時間點出血側(cè)海馬區(qū)Nogo-A的表達情況，實驗結(jié)果顯示電針上述諸穴對腦出血后海馬區(qū)Nogo-A的表達有顯著的抑制作用，進一步說明了電針能夠調(diào)節(jié)腦損傷后中樞神經(jīng)負性調(diào)節(jié)作用，抑制神經(jīng)生長錐的潰縮、塌陷，降低神經(jīng)再生與修復的阻礙因素。本研究雖然僅從大鼠出血側(cè)海馬區(qū)Nogo-A表達的角度探討電針對腦出血的康復治療意義，但考慮到Nogo-A在神經(jīng)重塑方面的重要負性調(diào)節(jié)作用，對臨床上腦出血患者治療過程中的電針取穴選擇提供了一定的實驗依據(jù)，但腦卒中的針灸治療精微復雜，更多更佳的電針穴位選擇尚有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1] 王風波，王瓊芬，張弘，等.大鼠腦出血后同側(cè)海馬區(qū)Slit2、Nogo-A表達的相關(guān)研究[J].中國醫(yī)師雜志，2015， 17（2）：195-197.

[2] Kurowska Z，Brundin P，Schwab ME，et al. Intracellular Nogo-A facilitates initiation of neurite formation in mouse midbrain neurons in vitro [J]. Neuroscience，2014，25（6）：456-466.

[3] 張?zhí)N，吳羽楠，李鉆芳，等.電針神庭百會穴對腦缺血再灌注損傷大鼠認知功能的影響[J].針灸臨床雜志，2015， 31（1）：61-64.

[4] 楊潔，倪厚杰，唐洲平.Ⅶ型膠原酶構(gòu)建大鼠腦出血模型的組織病理學研究[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2012，7（7）：235-237.

[5] FeiginVL，LawesCM，Bennett DA，et al. Worldwides troke incidence and early case fatality reported in 56 population based studies：a systematic review [J]. Lancet Neurol，2009， 8（4）：355-369.

[6] 宮為大.腦出血應用早期康復治療的療效分析[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2015，36（36）：5499-5500.

[7] 米亞靜，劉潔，王世偉，等.Nogo-A在皮層神經(jīng)元中的亞細胞分布模式研究[J].解剖學研究，2015，37（2）：97-99.

[8] 趙修，宋錦寧，郗磊，等.大鼠彌漫性軸索損傷后Nogo-A在腦組織中表達的分布與動態(tài)變化及其意義[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2015，36（1）：80-85.

[9] 張敏，張盼盼，韓曉慶，等.不同程度慢性間歇性低氧對大鼠齒狀回Nogo-A和NgR表達的影響[J].中華老年心血管雜志，2015，17（5）：522-525.

[10] Yin HL，Wang YL，Li JF，et al. Effects of curcumin on hippocampal expression of NgR and zxonal regeneration in Aβ-induced cognitive disorder rats [J]. Genet Mol Res，2014，13（1）：2039-2047.

[11] 楊俊鋒，張亞峰，馬勇，等.Nogo-A在脊髓損傷大鼠脊髓組織中的動態(tài)表達[J].中國康復醫(yī)學，2015，30（9）：867-871.

[12] 丁永利，姜勇，宋躍明，等.ChABC、GDNF、Nogo-A抗體聯(lián)合應用促損傷脊髓再生修復的實驗研究[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2015，36（3）：327-331.

[13] 梁艷桂，譚峰，陳杰，等.電針對腦缺血再灌注大鼠腦皮層超微結(jié)構(gòu)及Nogo-A表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（2）：209-213.

[14] 褚鑫，蔡恩麗，唐柱生，等.電針不同介入時間對大鼠腦出血后行為學和腦組織形態(tài)學的影響[J].針灸臨床雜志，2014，30（2）：68-70.

[15] 陳成，章薇，婁必丹，等.電針心包經(jīng)穴對急性腦缺血大鼠血清及腦組織神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長抑制因子的影響[J].針刺研究，2015，40（2）：94-98.

[16] 陳吉祥，林浴坤，吳羽楠，等.電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶功能及海馬組織Nogo-A/NgR表達的影響[J].中國康復醫(yī)學，2015，30（3）：219-223.

（收稿日期：2016-07-13 本文編輯：張瑜杰）