付文娟+常娜+王帥

[摘要] 目的 探討Livin、Caspase-8在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。 方法 選擇2008年3月～2015年3月于唐山市人民醫(yī)院就診的骨肉瘤患者64例為觀察組，取其骨肉瘤組織作為生物樣本；選擇同期就診的非骨肉瘤患者64例為對(duì)照組，取其正常骨痂組織作為生物樣本。按照骨肉瘤診治規(guī)范對(duì)相關(guān)生物樣本進(jìn)行分析，分析觀察組所有樣本的腫瘤位置、腫瘤大小、病理分型、Enncking分期等；檢測(cè)兩組樣本中Livin和Caspase-8的表達(dá)水平；分析其與腫瘤生物學(xué)行為的相關(guān)性。 結(jié)果 Livin在觀察組骨痂組織中陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P < 0.05），Caspase-8在觀察組骨痂組織的陽性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組（P < 0.05）；性別、年齡、腫瘤位置和病理分型與Livin和Caspase-8的表達(dá)水平無關(guān)（P > 0.05），而腫瘤的大小、Enncking分期和患者最終生存時(shí)間與Livin和Caspase-8的表達(dá)相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）；Livin蛋白表達(dá)和Caspase-8蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.392，P < 0.05）。 結(jié)論 骨肉瘤組織中Livin的表達(dá)量顯著升高，而Caspase-8的表達(dá)量顯著降低，且Livin和Caspase-8的表達(dá)與骨肉瘤的腫瘤大小、Enncking分期及患者最終生存時(shí)間有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤；Livin蛋白；Caspase-8蛋白；臨床意義

[中圖分類號(hào)] R738.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of Livin and Caspase-8 in human osteosarcoma. Methods The osteosarcoma cancer tissues of 64 patients with osteosarcoma cancer who were examined and treated in Tangshan Peoples Hospital from March 2008 to March 2015 were collected as the observation group. Another 64 patients with non-osteosarcoma cancer were selected as the control group. The relevant biological samples were analyzed in accordance with the standard of diagnosis and treatment of osteosarcoma cancer. The tumor location， tumor size， pathological type， Enncking stage and so on of the observation group were analyzed and observed. The expression level of Caspase-8 and Livin was detected in the two groups and its correlation with tumor biological behavior was analyzed. Results The positive expression rate of Livin in the observation group was significantly higher than that in the control group （P < 0.05）. The positive expression rate of Caspase-8 in the observation group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Sex， age， tumor location and pathological type were independent with the expression levels of Livin and Caspase-8（P > 0.05）， however， tumor size， Enncking stage and the final survival time were correlated with the expression of Caspase-8 and Livin protein （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression of Livin protein was negatively correlated with the expression of Caspase-8 protein （r = -0.392， P < 0.05）. Conclusion In osteosarcoma tissue， the expression of Livin is increased significantly and caspase-8 was significantly reduced. The expression level of Livin and Caspase-8 is related to the tumor size， Enncking stage and the final survival time of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma； Livin protein； Caspase-8 protein； Clinical significance

在我國(guó)，骨肉瘤的發(fā)病對(duì)象主要為青少年兒童，且近年來的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[1]，對(duì)社會(huì)穩(wěn)定和青少年生命健康和安全造成了嚴(yán)重的影響[2]。目前，臨床對(duì)于骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制研究尚不完全清晰，諸多學(xué)者認(rèn)為[3]，細(xì)胞正常凋亡受阻可能直接參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。Livin是最新發(fā)現(xiàn)的人凋亡抑制蛋白家族中的一種蛋白因子，半胱天冬酶（Caspase）則是一類在進(jìn)化上非常保守的蛋白酶類分子[5]。其中，Caspase-8參與到細(xì)胞凋亡過程中[6]。本研究旨在探討Livin、Caspase-8在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義，從而揭示骨肉瘤發(fā)病可能的生物學(xué)機(jī)制，為臨床生物分子藥物尋找有效靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年3月～2015年3月于唐山市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）就診的骨肉瘤患者64例為觀察組，取其骨肉瘤組織作為生物樣本，其中男38例，女26例，平均年齡（19.8±2.6）歲。選擇同期我院就診的非骨肉瘤患者64例為對(duì)照組，取其正常骨痂組織作為生物樣本，其中男38例，女26例；平均（20.2±2.2）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中骨肉瘤診斷符合全國(guó)軟組織和骨腫瘤病理診斷學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編上制定的標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)檢查和病理組織學(xué)檢查確診。②心智健全，有自主判斷能力。③術(shù)前未接受放化療等治療。④知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有器質(zhì)性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、精神性疾病，以及無法配合治療者。

1.3 方法

1.3.1 兩組骨痂組織中Livin和Caspase-8的檢測(cè)方法 本研究中使用工作液濃度為1∶100的Livin鼠抗人單克隆抗體，購于Abcam公司；工作液濃度1∶50的Caspase-8兔抗人多克隆抗體購于ABclonal公司；PBS粉劑和免疫組化MaxVisionTM/AP試劑盒購于杭州艾康生物技術(shù)有限公司。采用標(biāo)準(zhǔn)方法制作石蠟切片，即福爾馬林固定和石蠟包埋，設(shè)定切片厚度為4 μm。采用免疫組化MaxVisionTM/AP法行Livin和Caspase-8檢測(cè)，按照產(chǎn)品說明書步驟嚴(yán)格執(zhí)行，陰性對(duì)照為PBS代替一抗，對(duì)照為對(duì)照組受試者的正常骨痂組織切片。

1.3.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞中可見棕黃色細(xì)小顆粒，可認(rèn)定為陽性染色的Livin蛋白或Caspase-8蛋白。在400倍顯微鏡下記錄每張切片的10個(gè)視野，觀察每個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞的染色狀況。判定標(biāo)準(zhǔn)要根據(jù)陽性染色的細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行判定，陽性染色細(xì)胞占比的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色的細(xì)胞占比<10%，記為1分；陽性染色的細(xì)胞數(shù)目占比為10%～50%，記為2分；陽性染色的細(xì)胞占比>50%～75%，記為3分；陽性染色的細(xì)胞占比>75%，記為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度的評(píng)定如下：染色強(qiáng)度為淡黃色，記為1分；染色強(qiáng)度為棕黃色，記為2分；染色強(qiáng)度為棕褐色，記為3分。將陽性染色的細(xì)胞數(shù)目得分與細(xì)胞染色強(qiáng)度得分相乘，得出最終結(jié)果。總分≥3分為陽性，總分<3分為陰性。同時(shí)分析Livin蛋白表達(dá)和Caspase-8蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨痂組織中Livin、Caspase-8的表達(dá)情況

Livin蛋白多在細(xì)胞核內(nèi)呈陽性，極少在細(xì)胞漿內(nèi)呈陽性。Caspase-8蛋白多在細(xì)胞漿內(nèi)呈陽性，極少在細(xì)胞核內(nèi)呈陽性，見圖1。觀察組骨痂組織中Livin陽性表達(dá)率（66.94%）明顯高于對(duì)照組（10.94%）（P < 0.0），而觀察組骨痂組織中Caspase-8的陽性表達(dá)率（12.90%）明顯低于對(duì)照組（90.63%）（P < 0.01）。見表1、2。

2.2 不同病理因素的骨肉瘤組織中兩種蛋白的表達(dá)差異

性別、年齡、腫瘤位置和病理分型與Livin和Caspase-8的表達(dá)水平無關(guān)（P > 0.05），而腫瘤的大小、Enncking分期和患者最終生存時(shí)間與Livin和Caspase-8的表達(dá)相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）。其中，Livin在直徑≥8 mm的組織切片、ⅡB～Ⅲ期的組織切片和生存時(shí)間<5年的患者的組織切片中的表達(dá)量更高（P < 0.05），分別為86.21%、88.46%和90.24%；Caspase-8在直徑≥8 mm的組織切片、ⅡB～Ⅲ期的組織切片和生存時(shí)間<5年的患者的組織切片中的表達(dá)量更低（P < 0.05），分別為3.85%、5.71%和4.89%。見表3。

2.3 Caspase-8蛋白和Livin蛋白表達(dá)在骨肉瘤組織中的相關(guān)性

在64例骨肉瘤患者的組織切片中，Livin和Caspase-8同時(shí)呈陽性表達(dá)的患者僅有2例，而只有Livin陽性表達(dá)的患者為41例，只有Caspase-8陽性表達(dá)的患者為6例，余15例患者為陰性表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Livin蛋白表達(dá)與Caspase-8蛋白呈明顯負(fù)相關(guān)性（r = -0.392，P < 0.05）。見表4。

3 討論

骨肉瘤是常發(fā)于青少年中的一種惡性腫瘤，其惡變程度高，發(fā)病初期癥狀不明顯，出現(xiàn)明顯癥狀患者就醫(yī)時(shí)往往已經(jīng)處于中晚期。對(duì)于骨肉瘤的治療目前臨床上仍然以手術(shù)和放化療為主。研究認(rèn)為[8-9]，骨肉瘤的出現(xiàn)與細(xì)胞凋亡系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)[10-12]。細(xì)胞凋亡過程受抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖和轉(zhuǎn)移。因此，尋找與細(xì)胞凋亡系統(tǒng)相關(guān)的基因靶點(diǎn)作為未來骨肉瘤的治療靶點(diǎn)是戰(zhàn)勝和治愈骨肉瘤的關(guān)鍵。

結(jié)果顯示，骨肉瘤組織Livin表達(dá)水平明顯偏高，且顯著高于正常骨痂組織，且Livin的陽性表達(dá)還與骨肉瘤的腫瘤大小、Enncking分期及患者最終生存時(shí)間有關(guān)。在直徑較大、Enncking分期處于ⅡB～Ⅲ期和最終生存時(shí)間短于5年的患者體內(nèi)Livin陽性表達(dá)率顯著升高。進(jìn)一步研究Caspase-8蛋白后發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織細(xì)胞內(nèi)的Caspase-8表達(dá)水平明顯低于正常骨痂組織。且Caspase-8表達(dá)與腫瘤細(xì)胞病理因素之間的關(guān)系與Livin蛋白與腫瘤細(xì)胞病理因素之間的關(guān)系一致。Caspase-8蛋白在直徑較大、Enncking分期處于ⅡB～Ⅲ期和最終生存時(shí)間少于5年的患者體內(nèi)的陽性表達(dá)顯著下降。進(jìn)一步分析Caspase-8蛋白和Livin蛋白之間的相關(guān)性可以發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中Caspase-8蛋白的表達(dá)與Livin蛋白呈負(fù)相關(guān)。

由此說明，Livin對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用[13-14]，且也有可能可以抑制Caspase-8蛋白的表達(dá)。Caspase-8蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞外凋亡途徑中，Caspase-8蛋白活化Procaspase-3時(shí)需要去除prodomain，之后才能啟動(dòng)核心蛋白酶Caspase-3的凋亡作用。Livin蛋白可能可以抑制prodomain的去除，從而抑制之后的一系列凋亡過程[15-20]。根據(jù)研究結(jié)果，Livin蛋白和Caspase-8蛋白具有作為治療骨肉瘤基因靶點(diǎn)的潛力。

綜上所述，Livin在骨肉瘤組織中表達(dá)量顯著升高，而Caspase-8在骨肉瘤組織中表達(dá)量顯著降低，且與骨肉瘤的腫瘤的大小、Enncking分期和患者最終生存時(shí)間有關(guān)。

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（收稿日期：2016-07-16 本文編輯：任 念）