王少青，張晚魚，王大鵬,王世東,米 源,王 雷*

(1.河北省隆堯縣醫(yī)院胸外科，河北 隆堯 055350；2.河北省涉縣醫(yī)院病理科，河北 涉縣 056400;3.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院外科，河北 邯鄲 056201；4.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院皮膚性病科,河北 邯鄲 056201；5.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011)

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·論 著·

抗原致敏IL-27基因修飾的樹突狀細(xì)胞活化的CTL對食管癌細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡的影響

王少青1，張晚魚2，王大鵬3,王世東4,米 源5,王 雷5*

(1.河北省隆堯縣醫(yī)院胸外科，河北 隆堯 055350；2.河北省涉縣醫(yī)院病理科，河北 涉縣 056400;3.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院外科，河北 邯鄲 056201；4.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院皮膚性病科,河北 邯鄲 056201；5.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011)

目的研究IL-27基因轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)活化CTL體內(nèi)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的影響。方法通過在裸鼠的移植瘤周注射食管癌細(xì)胞抗原致敏、IL-27基因修飾DC(DCIL-27+Ag)活化的特異CTL，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平，熒光染料羅丹明123染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位水平并檢測caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果5組之間凋亡率、膜電位水平、caspase-3表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于PBS組，膜電位水平低于PBS組；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于Tnaive組，膜電位水平低于Tnaive組；DCIL-27+Ag、DCIL-27組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于DCnaive組，膜電位水平低于DCnaive組；DCIL-27+Ag組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于DCIL-27組，膜電位水平低于DCIL-27組。結(jié)論在荷瘤小鼠體內(nèi)，經(jīng)食管癌細(xì)胞抗原致敏、IL-27基因修飾的DC可活化特異性CTL產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，其機(jī)制可能是CTL通過降低食管癌細(xì)胞線粒體膜電位，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，激活caspase-3蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

食管腫瘤；樹突狀細(xì)胞；白細(xì)胞介素27；細(xì)胞凋亡

食管癌是最常見的上消化道惡性腫瘤之一，每年其發(fā)病率在全球范圍居惡性腫瘤第8位，約有45.6萬新發(fā)病例；病死率在全球范圍居惡性腫瘤第6位，每年近40 萬死亡病例，其中我國食管癌的發(fā)病率和病死率約占世界的 50%[1-3]。中晚期食管癌患者即使經(jīng)過手術(shù)和放化療等傳統(tǒng)治療，仍易于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中免疫缺陷被認(rèn)為是食管癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。最近的資料顯示過繼免疫治療可以改善晚期腫瘤患者的免疫抑制狀態(tài)，是一種具有較高安全性和有效的治療方法[4-6]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)最有效的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答及特異性抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。荷瘤宿主體內(nèi)的DC異常是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要方面，這使其不能有效提呈腫瘤抗原和提供協(xié)同刺激信號，從而不能細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)進(jìn)行有效激活而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前，以DC 為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療及DC 疫苗等方面已取得較大進(jìn)展[7-8]。白細(xì)胞介素27(interleukin 27，IL-27)是IL-6/IL-12家族細(xì)胞因子,主要來源于活化的單核巨噬細(xì)胞和DC。IL-27具有促進(jìn)CTL產(chǎn)生和活化，增強(qiáng)CTL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，IL-27可以抑制腫瘤新生血管生成而起到抗腫瘤作用[9-11]。本研究探討IL-27基因修飾的DC誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，旨在為食管癌的生物治療提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與動物 PA317/IL-27由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研處提供。Eca109食管癌鱗癌細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存。 BALB/C(nu/nu)裸小鼠購自南京斯科瑞生物科技有限公司(合格證號：0158144)，3～4周齡，體質(zhì)量16～18 g，雌雄各半，于無特定病原體環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2試劑和儀器 淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(GT-T551)購自上海聯(lián)遜生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；Polybrene購自美國Sigma公司；羅丹尼123(Rhodanmine123，Rho123)購自中國Solarbio公司；碘化丙啶(PI)購自美國Sigma 公司；rhGM-CSF、 rhIL-4、rhIL-2購自美國Peprotech公司；PBS購自日本TAKARA公司；鼠抗人caspase-3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；無菌培養(yǎng)板購自美國Costar公司；流式細(xì)胞儀(Epic-XLⅡ型)購自美國Beckmen Coulter公司。

1.3制備人食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型 Eca109細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(青、鏈霉素各100 U/mL)，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，將呈對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，每只于裸鼠右側(cè)背部皮下接種1×107細(xì)胞，成瘤標(biāo)準(zhǔn)為皮下結(jié)節(jié)直徑超過0.5 cm，成瘤率100%。

1.4DC的轉(zhuǎn)染和致敏 用淋巴細(xì)胞分離液分離食管癌患者的外周血，1 000 r/min離心30 min；吸取單個核細(xì)胞層進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，單個核細(xì)胞貼壁2 h后吸取的懸浮細(xì)胞即是淋巴細(xì)胞，應(yīng)用尼龍毛柱分離純化的自體T淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)研究。將單個核細(xì)胞培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞隔天加rhIL-4(50 μg/L)，rhGM-CSF(100 μg/L) 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞為DC。第6天將DC分組：DCIL-27+Ag組，抗原致敏IL-27基因修飾DC；DCIL-27組，IL-27基因修飾DC；DCnaive組，未轉(zhuǎn)染DC組。分別加PA317/IL-27培養(yǎng)上清、polybrene于DCIL-27+Ag組和DCIL-27組，轉(zhuǎn)染4 h后收集DC繼續(xù)培養(yǎng)。其中DCIL-27+Ag組加入Eca109細(xì)胞凍融抗原懸液后致敏DC 72 h。

1.5人食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的實(shí)驗(yàn)分組、治療和觀察、組織取材 將移植瘤裸鼠模型按照雌雄各半每組8只的原則隨機(jī)分成5組。將DC、DCIL-27和DCIL-27+Ag細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×107/mL后按1∶1比例與Tnaive細(xì)胞均勻混合。第1組作為對照于瘤體周圍注射PBS；第2組于瘤體周圍注射Tnaive；第3組于瘤體周圍注射DC +Tnaivel；第4組于瘤體周圍注射DCIL-27+Tnaive；第5組瘤體周圍注射DCIL-27+Ag+Tnaive，每4 d注射1次，每組每次均注射0.2 mL，共注射 5次，于注射完畢后1周處死裸鼠，切取腫瘤。

1.6流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及caspase-3蛋白表達(dá)變化

1.6.1流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤組織細(xì)胞凋亡率 網(wǎng)挫法將每組移植瘤樣本制備成單細(xì)胞懸液，取單細(xì)胞懸液100 μL(含1×106個細(xì)胞)加入碘化丙啶1mL，在4 ℃冰箱中染色30 min后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測凋亡。對細(xì)胞凋亡應(yīng)用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行分析。

1.6.2流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤組織細(xì)胞線粒體膜電位 網(wǎng)挫法將每組移植瘤樣本制備成單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，用冷PBS洗滌細(xì)胞，加入Rho 123染料并調(diào)整Rho 123濃度為10 mg/L，在37 ℃避光30 min，PBS洗滌細(xì)胞，上機(jī)檢測每組樣品的線粒體膜電位水平，用平均熒光強(qiáng)度表示線粒體膜電位水平。

1.6.3流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤組織的caspase-3蛋白表達(dá) 網(wǎng)挫法將每組移植瘤樣本制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整每組樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，用PBS洗滌細(xì)胞，100 μL PBS液懸浮細(xì)胞后每組樣本分別加入鼠抗人caspase-3抗體100 μL，室溫避光靜置30 min，PBS洗滌細(xì)胞，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液室溫避光孵育30 min，PBS 10 mL常規(guī)離心后棄上清，加入PBS 1 mL懸浮細(xì)胞，再經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，然后上機(jī)檢測caspase-3蛋白量。用平均熒光強(qiáng)度表示蛋白的表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

5組之間凋亡率、膜電位水平、caspase-3表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于PBS組，膜電位水平低于PBS組；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于Tnaive組，膜電位水平低于Tnaive組；DCIL-27+Ag、DCIL-27組凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于DCnaive組，膜電位水平低于DCnaive組；DCIL-27+Ag組在凋亡率、caspase-3表達(dá)均高于DCIL-27組，膜電位水平低于DCIL-27組。見表1，圖1。

表1 不同組別CTL細(xì)胞對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞線粒體膜電位水平的影響Table 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis rate，mitochondrial transmembrane potential and caspase-3 protein protein

圖1 DC活化的CTL對裸鼠人食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡的影響A.PBS組;B.Tnaive組;C.DCnaive組;D.DCIL-27組;E.DCIL-27+Ag組Figure 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis

3 討 論

晚期食管癌患者不但承受巨大腫瘤負(fù)荷，而且接受放、化療等綜合治療，不可避免地具有明顯的不良反應(yīng)，呈現(xiàn)出免疫抑制狀態(tài)，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致患者預(yù)后差。過繼性細(xì)胞免疫治療可以通過注射免疫活性細(xì)胞激發(fā)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體微環(huán)境的抗腫瘤能力，逆轉(zhuǎn)患者的免疫抑制狀態(tài)，最終改善疾病緩解率和延長生存期[12]。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有一定的關(guān)系，DC功能缺陷或DC數(shù)量減少導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，使腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展，活化的DC能將腫瘤抗原提呈給T細(xì)胞，是抗腫瘤，免疫的啟動者。有研究表明DC能激活特異腫瘤相關(guān)T淋巴細(xì)胞抗腫瘤，并且能直接對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用[13]。

IL-27作為一種具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子可作用于免疫系統(tǒng)發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。IL-27可以通過促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生和活化來增強(qiáng)抗腫瘤免疫。Kachroo等[15]研究顯示，在非小細(xì)胞癌中IL-27通過STAT1抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管生成的作用進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，IL-27可以體外抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)可以顯著抑制腫瘤生長和微血管形成[16]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)食管癌組織及引流淋巴結(jié)中DC存在著功能缺失。IL-27 基因修飾可以增強(qiáng)DC在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞達(dá)到抗食管癌作用，其機(jī)制可能與IL-27可以活化 T 淋巴細(xì)胞，致使 CTL分泌IFN-γ 的能力增強(qiáng)有關(guān)[17-18]。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討IL-27 基因修飾DC后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞抗腫瘤的機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是由多種基因參與調(diào)控的細(xì)胞主動的程序性細(xì)胞死亡，主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等三大途徑，其中線粒體途徑屬于內(nèi)源性凋亡途徑，其特征是線粒體內(nèi)跨膜電位降低和耗散可以導(dǎo)致細(xì)胞色素C等釋放以及活化caspase家族蛋白酶，發(fā)生一系列的caspases級聯(lián)放大反應(yīng)[19]。 Caspase家族蛋白酶作為凋亡過程中的效應(yīng)蛋白，其活化程度和表達(dá)情況與凋亡密切相關(guān)，caspase-3作為整個凋亡級聯(lián)反應(yīng)的核心蛋白，可以通過裂解細(xì)胞內(nèi)某些重要底物蛋白，在線粒體凋亡途徑的凋亡執(zhí)行期中發(fā)揮關(guān)鍵性的樞紐作用。Caspase-3表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡停止并引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[20-21]。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)活化的caspase-3可以通過Bax依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，DCIL-27+Ag組的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)顯著降低，caspase-3蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著增加。分析其機(jī)制可能是DCIL-27+Ag激活的CTL在體內(nèi)可以通過降低細(xì)胞的線粒體膜電位水平和激發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而活化caspase-3蛋白表達(dá)，起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，在體內(nèi)體現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性細(xì)胞毒作用，

綜上所述，經(jīng)食管癌細(xì)胞抗原致敏、IL-27基因修飾的DC可活化特異性CTL，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞膜電位水平和caspase-3有關(guān)，本研究為IL-27臨床上應(yīng)用于食管腫瘤的生物治療提供了一個新思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Effects of specific CTL which are activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell mitochondria membrane potential and cell apoptosis

WANG Shao-qing1, ZHANG Wan-yu2, WANG Da-peng3, WANG Shi-dong4, MI Yuan5, WANG Lei5*

(1.Department of Chest Surgery， the Hospital of Longyao County, Hebei Province Longyao 055350, China; 2.Department of Pathology, Shexian Hospital of Hebei Province, Shexian 056400, China; 3.Department of Surgery, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group, Handan 056201, China; 4.Department of Dermatology, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group,Hebei Province Handan 056201, China; 5.Department of Thoracic Surgery, Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011, China)

ObjectiveTo explore the effect of specific cytotoxic lymphocyte(CTL) which are activated by dendritic cell(DC) modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell apoptosis.MethodsAfter making the nude mice models with esophageal cancer cell successfully, the mice were immunized with specific CTL which are activated by IL-27 gene modified DC loaded with esophageal tumor lysate(DCIL-27+Ag). The cell apoptosis rate was analyzed by Annexin V/PI staining. The mitochondrial membrane potential was measured by Rhodamine 123 staining and the expression level of caspase-3 protein was detected by flow cytometry.ResultsThe ratio of apoptosis, membrane potential of mitochondria and expression of caspase-3 of 5 groups showed significant difference(P<0.05).The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup were higher than those in PBS group(control group). The membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was higher than that in PBS group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Ag, group, DCIL-27group and,DCnaivegroup were higher than those in Tnaive group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was lower than that in Tnaive group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group were higher than those in DCnaivegroup, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group was lower than that in DCnaivegroup. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup,were higher than those in DCIL-27group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup was lower than that in DCIL-27group.ConclusionSpecific CTL, activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate, efficiently play cytotoxic effect on tumor-bearing mice in vivo through reducing the mitochondrial membrane potential, initiating the intrinsic mitochondrial apoptotic pathways and increasing caspase-3 protein expression.

esophageal carcinoma; dendritic cells; interleukin 27; cell apoptosis

2016-04-01；

2016-10-25

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20110136)

王少青(1981-)，男，河北隆堯人，河北省隆堯縣醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事胸外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yuankundu@163.com

R735.1

A

1007-3205(2016)12-1402-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.010