田 偉，董 彬，李鎮(zhèn)芳，孟德梅,，樊振川,

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457)

萊茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備

田 偉1，董 彬1，李鎮(zhèn)芳1，孟德梅1,2，樊振川1,2

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457)

IFT139是萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT復(fù)合物A中的一個(gè)重要組分．其編碼基因的突變、缺失或沉默將會(huì)影響纖毛正常的組裝和解聚，進(jìn)而導(dǎo)致纖毛病的產(chǎn)生．為深入研究IFT139的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先PCR獲得ift139 5′端458 bp的EST片斷，成功構(gòu)建了pMAL-c2-ift139與pET-28a(＋)-ift139重組質(zhì)粒．然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E. coli)BL21(DE3)，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到相對(duì)分子質(zhì)量為6.0×104和2.5×104的重組MBP/HIS-IFT139融合蛋白．進(jìn)一步將親和純化的MBP-IFT139融合蛋白(純度95%,以上)，免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，間接ELISA法測(cè)得血清效價(jià)為1∶256,000．最后將抗血清依次經(jīng)Protein A和硝酸纖維素膜純化后，用Western blot檢測(cè)抗體特異性，結(jié)果顯示所制備抗體能夠正確特異性識(shí)別萊茵衣藻中的IFT139，從而為IFT139作用機(jī)制的闡明和纖毛相關(guān)疾病的研究奠定了重要基礎(chǔ)．

萊茵衣藻；纖毛；IFT139；表達(dá)純化；多克隆抗體

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種單細(xì)胞真核微藻，由一個(gè)直徑約為8,μm的細(xì)胞和兩根長(zhǎng)度約為12,μm的纖毛組成．纖毛是一種細(xì)胞表面突起較為保守的細(xì)胞器，主要由細(xì)胞微管組成[1]．纖毛主要為萊茵衣藻提供動(dòng)力使其運(yùn)動(dòng)，同時(shí)為其逃避敵害、尋覓食物等提供了便利．組裝纖毛所需要的蛋白均在萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)合成，之后通過纖毛內(nèi)運(yùn)送蛋白(intraflagellar transport，IFT)運(yùn)進(jìn)纖毛，合成纖毛所需物質(zhì)[2-3]．

IFT復(fù)合物由IFT-A和IFT-B兩個(gè)亞蛋白復(fù)合物組成[4]，復(fù)合物B負(fù)責(zé)從纖毛基體到頂端的順向運(yùn)輸，依靠驅(qū)動(dòng)蛋白-2(kinesin-2)；復(fù)合物A負(fù)責(zé)從頂端到基部的逆向運(yùn)輸，利用的是細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(cytoplasmic dynein)[5-7]．順向運(yùn)輸?shù)倪^程中，IFT如同火車車廂般將合成纖毛所需要的蛋白組分運(yùn)送到纖毛頂端，合成纖毛相關(guān)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行纖毛的組裝．逆向過程是將解聚的纖毛組分或周轉(zhuǎn)蛋白運(yùn)出纖毛，從而完成一個(gè)循環(huán)過程[8-10]．萊茵衣藻作為一種典型的模式生物，與人類細(xì)胞的纖毛非常相近，所以，IFT139抗體的制備不僅可用于研究衣藻纖毛的相關(guān)功能，也可用于研究人體內(nèi)纖毛的結(jié)構(gòu)及功能．多項(xiàng)研究表明，纖毛中基因的突變或缺失，會(huì)造成纖毛生成缺陷，從而導(dǎo)致纖毛相關(guān)疾病的產(chǎn)生[11-14]．

IFT139作為一種纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?，是IFT-A復(fù)合物中的重要組分．目前已有研究表明人類纖毛基因ift139的純合錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致局灶節(jié)段性腎小球疾病，造成腎小球基膜增厚，腎小管萎縮，顆粒物質(zhì)的積累等癥狀[15-16]，然而對(duì)于IFT139作用機(jī)制目前仍沒有清晰的認(rèn)識(shí)．本研究對(duì)于IFT139在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備，對(duì)于今后研究IFT139在纖毛中的作用及IFT139與其他蛋白復(fù)合物的相互作用提供了理論基礎(chǔ)，也對(duì)于纖毛病的診斷提供了有利的方法基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌(E. coli)XL1-blue與BL21(DE3)菌株，pMAL-c2-acbp與 pET-28a(+)-acbp質(zhì)粒均是本實(shí)驗(yàn)室保存；pBlu-ift139由中科院水生所黃開耀老師實(shí)驗(yàn)室所贈(zèng)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性新西蘭大白兔，購自天津歐陽實(shí)驗(yàn)種兔公司．

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG和胰蛋白胨，北京索萊寶生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4,DNA連接酶、pfu DNA聚合酶和蛋白Marker，加拿大Fermentas公司；DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；親和層析填料，GE公司；AP(堿性磷酸酶)標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG和TMB (3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；弗氏完全和不完全佐劑，美國Sigma公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.3 PCR擴(kuò)增ift39基因

位于pBlu-ift139載體上的目的基因ift139，是屬于全基因序列5′端458,bp的EST片段，根據(jù)NCBI中萊茵衣藻ift139的基因序列及原核表達(dá)載體圖譜，進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)．上游引物加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)：5′-ATGGATCCATGGCGGACAGGGTACTT-3′，下游引物加入HindⅢ酶切位點(diǎn)：5′-ATAAGCTTCTG ATGATGATCCAGCCCA-3′，加粗斜體部分即為引入的酶切序列，引物設(shè)計(jì)后送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成．利用含ift139基因的重組質(zhì)粒pBluift139為模板，50,μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95,℃ 1,min；95,℃ 30,s、57,℃ 30,s、72,℃40,s，30個(gè)循環(huán)；72,℃ 10,min．取2,μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%,的瓊脂糖凝膠電泳分析[17-18]．

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存質(zhì)粒pMAL-c2-acbp、pET-28a(+)-acbp使用BamHⅠ和HindⅢ于37,℃雙酶切3,h，回收目的片段和對(duì)應(yīng)載體，然后分別將獲得黏性末端的PCR產(chǎn)物和載體在T4,DNA 連接酶的作用下重組質(zhì)粒，4,℃連接過夜，轉(zhuǎn)化．分別在對(duì)應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基平板上篩選單克隆，提取重組質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證，質(zhì)粒測(cè)序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成[19-20]．

1.5 融合蛋白的表達(dá)與純化

1.5.1 融合蛋白的表達(dá)

采用CaCl2轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pMAL-c2-ift139、pET-28a(+)-ift139轉(zhuǎn)入BL21，在對(duì)應(yīng)抗生素的平板上挑取單克隆，37,℃過夜搖菌培養(yǎng)，次日以1∶20稀釋繼續(xù)培養(yǎng)，待1,h后進(jìn)行A600的測(cè)定．A600＝0.6～0.8時(shí)，28,℃、0.2,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6,h，于4,℃、3,900,r/min離心10,min，收集菌體，PBS洗滌3次后，置于冰上超聲破碎1,h．最后將破碎后的全蛋白、離心得到的上清液、用PBS處理后的沉淀按照一定的順序等量上樣，采用SDS-PAGE電泳分析融合蛋白表達(dá)情況[21-23]．

1.5.2 MBP-IFT139融合蛋白的純化

將pMAL-c2-ift139擴(kuò)大培養(yǎng)獲得大量菌液，經(jīng)超聲破碎，12,000,r/min離心10,min得到上清液，與MBP凝膠過夜結(jié)合，未結(jié)合的液體流出．然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.5)清洗雜蛋白3次，最后用含10%,麥芽糖的洗脫液將目標(biāo)蛋白從直鏈淀粉樹脂上競(jìng)爭(zhēng)性地洗脫下來．取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白純度[24]．

1.5.3 HIS-IFT139融合蛋白的純化

將pET-28a(+)-ift139擴(kuò)大培養(yǎng)獲得大量菌液，經(jīng)超聲破碎，12,000,r/min離心10,min得到沉淀．用含20,mmol/L咪唑的漂洗緩沖液(含1,mol/L尿素)洗滌沉淀3次，用結(jié)合緩沖液(含8,mol/L尿素)將沉淀溶解3,h后，于4,℃、12,000,r/min離心10,min取上清液．然后與Ni柱凝膠過夜結(jié)合，流出液體后，分別用含20、40、80,mmol/L咪唑的漂洗緩沖液(含8,mol/L尿素)清洗雜蛋白3次，用含500,mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(含8,mol/L尿素)洗脫目的蛋白，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白純度[25]．

1.6 多克隆抗體的制備及效價(jià)的測(cè)定

1.6.1 抗血清的制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是3月齡、體質(zhì)量在1.5～2,kg的雄性新西蘭大白兔，喂養(yǎng)1周后進(jìn)行第1次免疫，取1,mol/L抗原1,mL與同劑量的弗式完全佐劑進(jìn)行充分乳化后，采用背部皮下多點(diǎn)注射，初次免疫之前取血作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照．之后每隔10～14,d進(jìn)行第2～5次加強(qiáng)免疫，使用弗氏不完全佐劑，最后以心臟穿刺的方法獲得全血，將血液室溫靜置1,h或4,℃靜置過夜，于4,℃、3,000,r/min離心10,min，清澈透明的上清液即為抗血清，如有紅色溶血進(jìn)入，可再次離心取上清液，然后于-80,℃分裝保存[26-27]．

1.6.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)．將經(jīng)包被液稀釋的抗原MBP-IFT39包被于酶標(biāo)板上，每孔1,μg，4,℃包被過夜；加入0.5%,脫脂乳粉37,℃封閉1,h；加入經(jīng)PBS溶液(pH 7.5)梯度稀釋的兔血清，37,℃孵育1,h；加入經(jīng)PBS溶液(pH 7.5)稀釋20,000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37,℃孵育30,min；加入TMB顯色液，室溫避光顯色25～30,min；最后加入0.5,mol/L H2SO4終止液，終止反應(yīng)，在450,nm 波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度[28-29]．

1.7 多克隆抗體的純化及特異性分析

1.7.1 Protein A純化抗體

將填料(Protein A Sepharose)與親和層析柱按照其說明分別進(jìn)行前處理后，加入經(jīng)Binding Buffer稀釋的抗血清(1,mL抗血清＋1,mL Binding Buffer)，充分結(jié)合，用Binding Buffer沖洗層析柱，約1,h后雜蛋白峰趨于水平狀態(tài)，加入0.1,mol/L、pH 2.7的甘氨酸洗脫液進(jìn)行洗脫，收集抗體，為了保證酸不穩(wěn)定的IgG，添加1,mol/L、pH 9.0的Tris-HCl以中和洗脫下來的抗體，使pH 為7.0．將抗體于-20,℃暫時(shí)保存以備下一步純化[30-31]．

1.7.2 膜純化抗體

取2,mg另一標(biāo)簽的融合蛋白HIS-IFT139進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結(jié)束后，凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上；將膜進(jìn)行麗春紅染色10,min，剪下目的條帶，用TBST溶液(100,mL 10× TBS溶液，895,mL去離子水，5,mL 10%,的吐溫20)洗膜3次，至膜上的顏色全部褪去；加入3,mL的5%,的脫脂乳粉室溫封閉1,h；加入上步純化的抗體(≥3,mg)進(jìn)行孵育，4,℃搖床過夜；用TBST溶液洗膜3次后加入0.1,mol/L、pH 2.7的甘氨酸洗脫液進(jìn)行洗脫，收集抗體．測(cè)定濃度后加入甘油至體積分?jǐn)?shù)為30%,于-20,℃短期保存，-80,℃長(zhǎng)期保存再加入疊氮化鈉至終質(zhì)量濃度為0.3,g/L[32]．

1.7.3 抗體特異性檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡(Western blot)方法．將微藻樣品CW92經(jīng)過處理后[33]進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)至NC膜上，加入5%,的脫脂乳粉進(jìn)行室溫封閉1,h后，分別以1∶100和1∶500的稀釋比例加入純化后的抗體作為一抗，室溫孵育1,h，以1∶2,500的稀釋比例加入AP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1,h，最后加入顯色液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀觀察[34]．

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒載體的鑒定

以質(zhì)粒pBlu-ift139為模板進(jìn)行PCR，獲得約為458,bp的基因片段，與預(yù)期大小相符合，如圖1(a)所示；重組質(zhì)粒pMAL-c2-ift139、pET-28a(+)-ift139經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后，分別得到對(duì)應(yīng)的載體和458,bp的片段，與目的基因大小相一致(圖1(b)、(c))；重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后與NCBI中ift139基因序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功．

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

2.2.1 融合蛋白的表達(dá)

pMAL-c2-ift139經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白MBP-IFT139，相對(duì)分子質(zhì)量約為6.0×104，與預(yù)期相符(圖2)，溶于上清液．

圖1 ift139的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig. 1 PCR amplification of ift139 and identification of recombined plasmids with double restriction enzyme digestion

pET-28a(+)-ift139經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白HIS-IFT139，相對(duì)分子質(zhì)量約為2.0×104，與預(yù)期相符(圖3)，以包涵體的形式存在．

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)重組表達(dá)載體pMAL-c2-ift139在E．coli BL21(DE3)中的表達(dá)Fig. 2SDS-PAGE analysis of the expression of recombined vector pMAL-c2-ift139 in E．coli BL21(DE3)

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)重組表達(dá)載體pET-28a(+)-ift139在E．coli BL21(DE3)中的表達(dá)Fig. 3SDS-PAGE analysis of the expression of recombined vector pET-28a(+)-ift139 in E．coli BL21 (DE3)

2.2.2 融合蛋白的純化

MBP-IFT139和HIS-IFT139融合蛋白的親和純化結(jié)果如圖4所示．

圖4 MBP-IFT139和HIS-IFT139融合蛋白的親和純化Fig. 4Affinity purification of MBP-IFT139 and HISIFT139

MBP-IFT139與HIS-IFT139融合蛋白分別經(jīng)MBP和HIS親和層析柱純化后得到相對(duì)分子質(zhì)量約為6.0×104、2.0×104的目標(biāo)條帶，分子質(zhì)量大小均與預(yù)期相符，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為1.3、1.1,mg/ mL．MBP-IFT139蛋白純度達(dá)95%,以上，可作為抗原進(jìn)行免疫兔子，HIS-IFT139上面有些雜帶，但是不影響切膜純化抗體．

2.3 多克隆抗體的制備

2.3.1 抗血清效價(jià)的測(cè)定

用純化得到的MBP-IFT139融合蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過5次免疫之后，在耳緣靜脈少量采血，利用間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)如圖5所示，免疫抗血清A450與陰性對(duì)照血清A450之比大于等于2.1，即為陽性．所以，可得最高稀釋倍數(shù)1∶256,000為抗血清的效價(jià)．

圖5 抗血清效價(jià)的ELISA法測(cè)定Fig. 5 Determination of the antiserum titer with ELISA method

2.3.2 抗體的特異性分析

經(jīng)Protein A純化得到的IgG抗體，經(jīng)Western blot初步檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)抗體的特異性較差，又經(jīng)過硝酸纖維素膜純化法對(duì)抗體進(jìn)一步純化，得到的抗體由Western blot檢測(cè)分析，結(jié)果如圖6所示．

不同稀釋倍數(shù)的抗體均可與微藻中的IFT139蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量約為1.40×105)特異性結(jié)合，形成明顯的單一條帶且大小與預(yù)期相符合．這表明多克隆抗體成功制備．

圖6 Western blot 檢測(cè)IFT139抗體的特異性Fig. 6 Specificity analysis of IFT139 polyclonal antibody with Western blot

3 討 論

纖毛不僅是萊茵衣藻重要的組成部分，還分布于哺乳動(dòng)物的多個(gè)器官和組織中，調(diào)控著動(dòng)物的生長(zhǎng)及發(fā)育．纖毛內(nèi)基因的突變或蛋白缺失都將會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)及生理造成一定的影響，從而導(dǎo)致各種纖毛相關(guān)疾病的出現(xiàn)．像與纖毛運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)的疾病：原生纖毛不動(dòng)綜合征、呼吸道感染、生殖功能降低、輸卵管異常、內(nèi)臟移位等[13]；與纖毛感覺功能相關(guān)的疾?。阂曈X系統(tǒng)異常造成的視力下降或完全失明、聽覺系統(tǒng)中纖毛的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致聽力下降或失聰、嗅覺不靈敏等[14]；與信號(hào)傳導(dǎo)功能有關(guān)的疾?。喊偷庐吺暇C合癥(BBS)，像多指癥、肥胖癥、視力下降、精神呆滯等[35-37]．

本研究中ift139基因的突變、沉默等都將會(huì)對(duì)IFT139蛋白的合成造成一定的影響，繼而可能會(huì)造成纖毛的組裝缺陷，最終導(dǎo)致腎消耗病和窒息性胸營養(yǎng)不良綜合癥等疾病[15-16]．在IFT-B如IFT80、IFT46等蛋白進(jìn)行免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)研究中，IFT139常作為IFT-A中的重要組分被對(duì)比使用．然而，對(duì)于IFT139的研究還有很多未知和值得探討的東西，它在纖毛中具體有哪些作用、其編碼基因的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致哪些疾病等內(nèi)容均不清晰．本實(shí)驗(yàn)從PCR擴(kuò)增目的基因ift139開始，成功構(gòu)建了兩種原核表達(dá)載體，通過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，并進(jìn)一步純化抗原并免疫動(dòng)物得到高效價(jià)的抗血清，然后經(jīng)過抗體的兩步純化及特異性分析驗(yàn)證，成功獲得了抗MBP-IFT139融合蛋白的多克隆抗體，對(duì)于今后研究IFT139在纖毛中的作用及IFT139與其他蛋白復(fù)合物共同作用提供了研究基礎(chǔ)，也對(duì)纖毛病的進(jìn)一步深層次研究提供了有利支持．

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責(zé)任編輯：郎婧

Prokaryotic Expression，Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Chlamydomonas reinhardtii IFT139 Protein Antigen

TIAN Wei1，DONG Bin1，LI Zhenfang1，MENG Demei1,2，F(xiàn)AN Zhenchuan1,2
(1．Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2．Institute for New Rural Development ，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

IFT139 is a key component of the intraflagellar transport(IFT)complex A in Chlamydomonas reinhardtii．Mutations，deletions or silence of ift139 gene can affect cilia assembly and depolymerization，and thus lead to ciliopathy．To further investigate the role of IFT139 in ciliogenesis，ift139 5′-458 bp EST cDNA fragment was firstly amplified and the recombined plasmids pMAL-c2-ift139 and pET-28a(＋)-ift139 were constructed and transferred into Escherichia coli BL21(DE3)．Under IPTG induction，fusion proteins MBP-IFT139 and HIS-IFT139 with a molecular weight of 6.0×104and 2.5×104，respectively，were obtained．The fusion protein MBP-IFT139 was purified by affinity adsorption purification(more than 95%, purity)and then used for immunizing New Zealand white rabbits to produce antiserum．When the titer of antiserum reached 256,000，it was purified by Protein A，and then affinity adsorption purification was followed by nitrocellulose membrane purification procedure．The specificity of polyclonal antibodies was evaluated with Western blot．The result showed that the polyclonal antibody can specifically recognize IFT139．The research has provided an important tool for further clarifying the role of IFT139 in ciliogenesis and cilipathy.

Chlamydomonas reinhardtii；cilia；IFT139；expression and purification；polyclonal antibody

Q786

A

1672-6510(2016)06-0027-07

10.13364/j.issn.1672-6510.20160029

2016-01-24；

2016-04-14

國際遺傳工程與生物技術(shù)中心(ICGEB)研究資助項(xiàng)目(CRP/CHN15-01)

田 偉（1989—），女，山東人，碩士研究生；

樊振川，教授，fanzhen@tust.edu.cn.