谷鋒，楊繼宏，李琮，張洪安，康明，段文都，劉巖

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2華北油田總醫(yī)院)

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Shank1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及意義

谷鋒1，楊繼宏2，李琮1，張洪安1，康明1，段文都1，劉巖1

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2華北油田總醫(yī)院)

目的 觀察Shank家族成員Shank1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(HCC)組織中的表達(dá)變化，分析其與HCC臨床病理特征及肝癌預(yù)后的關(guān)系。方法 收集75例HCC患者術(shù)后HCC癌及癌旁組織,采用免疫組化染色、Western blotting和RT-PCR方法分別檢測Shank1蛋白及mRNA在癌和癌旁組織中的表達(dá)，分析Shank1表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示，HCC癌組織中Shank1表達(dá)較癌旁組織明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Western blotting檢測結(jié)果顯示HCC癌組織中Shank1蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)。Shank1在HCC癌組織中的表達(dá)下調(diào)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)(P均>0.05)，但與臨床分期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Shank1在HCC癌組織中表達(dá)降低，且與臨床分期有關(guān)；檢測Shank1蛋白表達(dá)有助于HCC病情判斷。

肝腫瘤；肝細(xì)胞性肝癌；Shank1蛋白

原發(fā)性肝癌(PLC)病死率較高，是世界第五大常見的腫瘤，每年全球約有萬余人罹患此病及因此病死亡，其中有90%以上為肝細(xì)胞性肝癌(HCC)[1]。我國是肝癌高發(fā)區(qū)，每年約有38萬人死于肝癌，占全球肝癌病死率的51%。Shank蛋白家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的骨架蛋白，主要包括Shank1、Shank2、Shank3。Shank1具有多種結(jié)構(gòu)域，這些多功能結(jié)構(gòu)域的同時存在使Shank蛋白可在不同的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合不同的蛋白分子，并介導(dǎo)他們間的相互作用。這使Shank1成為跨越核膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜的大分子細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)。但Shank家族作為細(xì)胞骨架蛋白在腫瘤中的作用研究較少，且均停留于神經(jīng)疾病領(lǐng)域[2]。我們收集2011年12月～2015年2月75例原發(fā)性HCC患者為研究對象，采用免疫組化法、Western blotting技術(shù)檢測Shank1蛋白在原發(fā)性HCC及癌旁組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在研究Shank1在原發(fā)性HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用，為原發(fā)性HCC的分子診斷及基因治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 75例原發(fā)性HCC手術(shù)后組織標(biāo)本，經(jīng)術(shù)后病理檢查確診?；颊吣?2例、女13例，年齡34～73歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例。HBsAg(+)21例，HBsAg(-)54例；合并肝硬化者27例，無肝硬化者48例。術(shù)中分別切取癌組織及距腫瘤邊緣至少2 cm的癌旁組織，體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。標(biāo)本在離體2 h內(nèi)均用中性甲醛進(jìn)行固定或先用冰盒冷藏再迅速轉(zhuǎn)移至低溫冰箱保存。

1.2 Shank1蛋白表達(dá)檢測 ①免疫組化法：對組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)步驟：60 ℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90 ℃微波抗原修復(fù)8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Shank1兔抗人一抗1∶100稀釋后室溫孵育1 h；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，酶標(biāo)抗鼠聚合物室溫孵育20 min，常規(guī)DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照組，同時做空白對照。根據(jù)陽性、陰性和空白對照的顯色情況，在排除假陽性和假陰性的前提下，計數(shù)每例腫瘤組織中的所有腫瘤細(xì)胞，當(dāng)大于10%細(xì)胞著色判斷為表達(dá)陽性，且以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃為弱陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，棕褐色為強(qiáng)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。將陰性與弱陽性定義為低表達(dá)，強(qiáng)陽性定義為高表達(dá)，同時將HCC患者癌組織低表達(dá)同時癌旁組織高表達(dá)的病例定義為Shank1表達(dá)下調(diào)病例。②Western blotting法：為進(jìn)一步證實(shí)免疫組化染色結(jié)果，選取8例病例樣本對Shank1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。取新鮮冰凍腎癌組織和癌旁組織按照重量體積比1∶3加入組織裂解液，BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取50 μg組織總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：32 mA，60 min；轉(zhuǎn)膜：110 V，120 min，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗Shank1(1∶1 000)及抗β-tubulin(1∶20 000)抗體室溫孵育1 h；TBST漂洗后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST漂洗后，用電化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.3 Shank1 mRNA表達(dá)檢測 選取8例病例樣本采用RT-PCR法檢測Shank1 mRNA表達(dá)。TRIzol試劑法提取癌和癌旁組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR法經(jīng)行RT-PCR檢測mRNA水平。兩步法程序如下：預(yù)變性95 ℃ 10 s ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Shank1蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示Shank1定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)及核周，呈棕色顆粒狀，彌漫或灶性分布；肝癌組織及癌旁肝臟組織均能被染色，只是肝癌組織中癌細(xì)胞染色為淺棕色，而癌旁肝臟組織肝細(xì)胞均著色顏色較深，呈深棕色，提示肝癌組織中Shank1表達(dá)量低于癌旁組織。Shank1 蛋白在癌旁肝臟組織中低表達(dá)，而在肝癌組織高表達(dá)，與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果一致(P<0.05)。在所收集的75例HCC癌組織和癌旁組織中，癌旁組織Shank1低表達(dá)15例，高表達(dá)60例；癌組織中Shank1低表達(dá)60例，高表達(dá)15例。癌旁組織的Shank1高表達(dá)率(80%)顯著高于肝癌組織(20%)(P<0.05)，且與癌旁組織相比肝癌組織73.33%(55/75)有不同程度的Shank1基因表達(dá)水平下調(diào)。

2.2HCC癌組織與癌旁組織中Shank1mRNA表達(dá)比較Shank1mRNA在HCC癌組織與癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為3.08±0.02、0.79±0.03，兩者比較，P<0.05。

2.3Shank1蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 75例HCC患者癌組織中Shank1表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著性相關(guān)(P均>0.05)，而與臨床分期有關(guān)(P<0.05)。Shank1在臨床分期2～4期比1期表達(dá)下調(diào)顯著(P=0.030 3)，見表1。

表1 Shank1蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

突觸后膜致密物質(zhì)(PSD)是指位于突觸后膜胞質(zhì)面的一層均勻而致密的物質(zhì)，能決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸的功能[3]。一組新的PSD蛋白，相對分子質(zhì)量大于200 kD，包含約2 000個氨基酸殘基，作為細(xì)胞骨架在突觸后膜中行使重要功能。Shank是一種神經(jīng)系統(tǒng)中重要的中心骨架蛋白，可連接多種受體、蛋白和細(xì)胞骨架，并介導(dǎo)各種受體間的信號傳導(dǎo)，在維持突觸正常功能方面有重要作用[4]。

Shank1在神經(jīng)組織中表達(dá)為完整的Shank蛋白，自N端至C端共有5個結(jié)構(gòu)域，這些完整的結(jié)構(gòu)域使Shank1本身或通過其他骨架蛋白和連接蛋白與多種蛋白分子構(gòu)成連接，其中有眾多分子與腫瘤的發(fā)生、遷移、侵襲等過程相關(guān)[5]。如通過富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域與Shank相連的Cortactin[6]。研究顯示，Cortactin在眾多不同來源的腫瘤細(xì)胞中均有過量表達(dá)，如口腔癌、食管癌、直腸癌、乳腺癌，在肝癌細(xì)胞中同樣有過表達(dá)現(xiàn)象[7]，且其在多種不同來源的腫瘤中，與腫瘤臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、分級等存在相關(guān)性[8]。Shank1可與眾多腫瘤相關(guān)的基因直接或間接相關(guān)，并通過不同方式介導(dǎo)這些分子間的信號傳導(dǎo)、作用調(diào)節(jié)，但Shank1本身并未作為腫瘤相關(guān)分子進(jìn)行報道，在腫瘤分子機(jī)制研究的領(lǐng)域仍是空白。

免疫組化染色結(jié)果顯示，Shank1在肝癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)部位集中于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)量低的部位表現(xiàn)為淺黃色或淺棕色，表達(dá)量高的部位表現(xiàn)為深褐色；基質(zhì)及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞無表達(dá)。通過進(jìn)一步半定量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，HCC癌旁組織病例中有80%被定義為高表達(dá)；而在癌組織中僅20%為高表達(dá)，顯示Shank1在HCC中的表達(dá)水平較癌旁組織中明顯下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們對實(shí)驗(yàn)結(jié)果做進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)Shank1蛋白表達(dá)水平與HCC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著性相關(guān)，但與臨床分期有顯著相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Shank1在臨床分期2～4期比1期表達(dá)下調(diào)顯著。以上結(jié)果均提示Shank1隨腫瘤發(fā)展表達(dá)量下降。

Shank1蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域可連接骨架蛋白PSD-95，并通過PSD-95與谷氨酸受體NMDA、KAR、mGluR相結(jié)合及與細(xì)胞黏附分子Semaphorin結(jié)合[9]。研究[10]顯示，Semaphorin在HCC中與癌旁和正常組織相比表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。相關(guān)研究表明Semaphorins信號通路中包含RhoGTP酶和CRMPs，他們參與調(diào)節(jié)由Semaphorin引起的細(xì)胞骨架改變[11]。Semaphorin3(Sema3)是該家族的分泌型亞家族，在細(xì)胞正常發(fā)育過程中，Sema3主要調(diào)控細(xì)胞遷移、黏附，并影響細(xì)胞增殖和凋亡，同時參與對神經(jīng)軸突生長和血管新生控制；病理狀態(tài)下，Sema3對腫瘤血管新生及腫瘤生長起重要作用，并在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[12]。我們推測，Shank1蛋白可能通過Semaphorins等相關(guān)蛋白發(fā)揮在腫瘤中的抑制作用。

同時，Shank1的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域通過Homer連接蛋白與mGluRs連接。mGluRs作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，在外周腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。除此之外，Shank1可通過骨架蛋白與RACl/CDC42、AMPA型谷氨酸受體等發(fā)生作用，這些分子在諸多類型的腫瘤中均有異常表達(dá)[13]。其中RACl/CDC42亦是腫瘤研究中的熱點(diǎn)，在肝癌、肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤中均有促進(jìn)腫瘤生長的作用，且在肝癌細(xì)胞中沉默CDC42能起到降低人肝癌細(xì)胞種植瘤的增殖、侵襲及遷移能力，抑制腫瘤細(xì)胞生長[14]。在應(yīng)用免疫組化和熒光定量PCR對肝癌組織的檢測中發(fā)現(xiàn)，皮層肌動蛋白(CTTN)在癌組織和癌旁組織中存在表達(dá)差異，且與腫瘤胞膜完整性，TNM分期、門脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移方面存在關(guān)系[15]。雖然CTTN在肝癌中的具體作用途徑未知，但該研究是肝癌與細(xì)胞骨架間關(guān)聯(lián)的有力證明。

綜上所述，Shank1在HCC組織中表達(dá)下調(diào)，且Shank1在HCC組織中的表達(dá)與患者臨床分期有關(guān)；Shank1可能在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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劉巖(E-mail:1647120274@qq.com)

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