魯志剛，冷雪芹，李燕，賈慧瓊

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,呼和浩特010051;2烏海市人民醫(yī)院)

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幽門螺旋桿菌和p14ARF在蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中的表達變化及意義

魯志剛1，冷雪芹1，李燕2，賈慧瓊1

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,呼和浩特010051;2烏海市人民醫(yī)院)

目的 探討幽門螺旋桿菌(Hp)和抑癌基因p14ARF在蒙古族、漢族胃癌患者癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達變化及意義。方法 采用免疫組化SP法、改良的Warthin-Starry(W-S)銀染色法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法分別檢測Hp和p14ARF在27例蒙古族胃癌患者和30例漢族胃癌患者癌組織、癌旁組織和正常組織中蛋白和mRNA表達。Spearman相關(guān)性分析漢族、蒙古族胃癌患者癌組織中Hp與p14ARF表達的關(guān)系。結(jié)果 p14ARF在蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中的表達低于癌旁組織和正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，癌旁組織低于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，p14ARF在蒙古族、漢族人群各組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中Hp陽性率較高，兩民族感染率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。漢族胃癌患者p14ARFmRNA相對表達量在癌、癌旁、正常組織中兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。蒙古族胃癌患者p14ARFmRNA相對表達量在癌、癌旁、正常組織中兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。蒙古族、漢族胃癌患者p14ARFmRNA相對表達量在癌、癌旁和正常組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示，漢族、蒙古族胃癌患者癌組織中Hp與p14ARF陽性表達呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.406、-0.433，P均<0.05)。結(jié)論 蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中p14ARF均呈低表達，Hp陽性率均較高，Hp陽性與p14ARF表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Hp與p14ARF在蒙古族、漢族胃癌中的發(fā)病機制可能相同，二者可能共同促進胃癌的發(fā)生。

胃癌；幽門螺旋桿菌；p14ARF基因；蒙古族；漢族

幽門螺旋桿菌(Hp)是澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall于1983年共同發(fā)現(xiàn)的一種新型細菌，是人胃的原籍寄生菌，其生長于胃黏膜表面和腫瘤腺體中。慢性胃炎-萎縮性胃炎-胃癌是胃癌發(fā)展的漸進性過程，Hp在這一進展過程中扮演重要角色，是促進胃癌發(fā)生的重要因素。p14ARF是一種新型的抑癌基因，主要通過固定mdm2于核仁，阻止其與p53結(jié)合，抑制p53的降解，達到抑制細胞增殖的目的。p14ARF與mdm2、p53的表達物同時結(jié)合成復(fù)合體，抑制癌變；p14ARF基因還可通過非p53依賴途徑抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長；p14ARF還通過其他多種途徑發(fā)揮抑癌作用。諸多學(xué)者認(rèn)為，p14ARF在抑癌作用機制方面的研究前景廣闊，可能成為腫瘤診斷的重要指標(biāo)。蒙古族是我國人口數(shù)量相對較多的一個少數(shù)民族，胃癌在蒙古族人群中的發(fā)病逐漸增多，但關(guān)于蒙古族人群胃癌的研究目前較少。Hp和p14ARF是與胃癌相關(guān)的兩種因子，與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，但目前尚無學(xué)者對兩種因子進行聯(lián)合分析。2013年12月～2016年7月，我們對兩種因子在蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中的表達進行分析，比較兩種因子在蒙古族和漢族胃癌患者癌組織中表達差異，探討他們在胃癌發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年12月～2015年12月胃腸外科手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本57例份，患者男40例、女17例，年齡34～80歲，平均62.28歲。漢族30例，蒙古族27例(三代直系親屬均為蒙古族)?；颊咝g(shù)前均未進行化療、生物治療等抗癌治療，術(shù)后經(jīng)病理切片確診為胃癌。采集患者相應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織2～3 cm處，HE染色證實為非腫瘤組織)、正常胃組織(同一標(biāo)本距離癌組織大于5 cm的正常胃黏膜)各兩份，一份固定于10%中性甲醛中用于免疫組化檢測，另一份置于無RNA酶的EP管中，立即儲存于-80 ℃液氮中，后轉(zhuǎn)存入-80 ℃冰箱儲存，做PCR備用。

1.2 漢族、蒙古族胃癌患者癌組織中Hp陽性檢測 采用改良Warthin-Starry(W-S)銀染色法。所有切片脫臘至水，經(jīng)蒸餾水清洗、浸入1%過碘酸后，將切片浸六胺銀工作液中染色，2%氯化金調(diào)色、蘇木精染色，最后95%鹽酸分化，梯度乙醇透明后封片。W-S銀染色中，Hp散在、密集或成堆分布于胃黏膜表面，和(或)胃小凹及腫瘤性腺腔內(nèi)，呈棕褐色、黑色桿狀或彎曲狀判定為Hp陽性。

1.3 p14ARF蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚石蠟切片機連續(xù)切片，置于掛膠玻片，每個病例每份組織分別留一張切片做HE染色，其余做免疫組化。p14ARF蛋白陽性表達表現(xiàn)為細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒，胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細胞。按龔代鵬等[1]的方法對免疫組化結(jié)果進行判定：在5個高倍視野下，每個高倍鏡視野計數(shù)100個細胞：①根據(jù)陽性細胞著色程度評分：蛋白顏色表達以多數(shù)細胞為準(zhǔn)，無陽性染色細胞計為0分，黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；②按陽性細胞所占比例評分：切片上未見陽性細胞計為0分，陽性細胞所占比例小于10%計為1分，10%～50%計為2分，50%～75%計為3分，>75%計為4分；③免疫組化陽性反應(yīng)分值=免疫染色的強度得分×陽性細胞的百分率；④按此兩項指標(biāo)的總積分將結(jié)果分為4級：0分為-，1～2分為+，3～4分為++，6～12分為+++。規(guī)定以-為陰性，+、++、+++均視為陽性。

1.4 p14ARFmRNA表達測定 采用RT-PCR法。研磨缽及玻璃器具經(jīng)去RNA酶(RNase)處理后，將胃組織約70 mg用TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。配置好引物行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。p14ARFmRNA結(jié)果判定：取經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物3 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電流為55 mA，電泳20 min。然后在紫外凝膠成像儀上觀察，將滿意的結(jié)果圖像拍照記錄。采用GIS圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶的灰度值，將各因子的灰度表達值與內(nèi)參灰度表達值相比，取其比值作為目的基因相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,兩樣本比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，不同標(biāo)本間相關(guān)指標(biāo)比較采用方差分析；Hp和p14ARF的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢族、蒙古族胃癌患者癌組織中Hp陽性檢測結(jié)果比較 漢族、蒙古族胃癌患者Hp陽性率分別為66.7%(20/30)、81.5%(22/27),二者比較，P>0.05(χ2=1.608)。

2.2 漢族、蒙古族胃癌患者p14ARF蛋白表達比較 蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中p14ARF的陽性表達率在癌、癌旁、正常組織中的表達呈逐漸升高趨勢，癌與癌旁、正常組織，癌旁和正常組織的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。p14ARF蛋白在蒙古族、漢族胃癌患者癌組織、癌旁組織、正常組織中的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 漢族、蒙古族胃癌患者p14ARF蛋白表達比較

2.3 不同組織中p14ARFmRNA表達比較 漢族胃癌患者p14ARFmRNA相對表達量在癌、癌旁、正常組織中兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。蒙古族胃癌患者p14ARFmRNA相對表達量在癌、癌旁、正常組織中兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。蒙古族、漢族胃癌患者p14ARF在癌、癌旁和正常組織mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 p14ARF mRNA在蒙、漢族患者不同組織中表達比較

注：1為空白對照；2、3、4為漢族患者癌、癌旁、正常組織；5、6、7為蒙古族患者癌、癌旁、正常組織。

2.4 Hp和p14ARF蛋白在漢族胃癌患者癌組織中表達的關(guān)系 漢族30例胃癌患者癌組織中Hp陽性20例，其中p14ARF表達陽性2例；Hp陰性10例，其中p14ARF表達陽性5例，經(jīng)Spearman相關(guān)分析，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.406，P<0.05)。

2.5 Hp和p14ARF蛋白在蒙古族胃癌患者癌組織中表達的關(guān)系 蒙古族27例胃癌患者癌組織中Hp陽性22例，其中p14ARF表達陽性3例；Hp陰性5例，其中p14ARF表達陽性3例，經(jīng)Spearman相關(guān)分析，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.433，P<0.05)。

3 討論

有研究[2，3]證實，基因通過攜帶、轉(zhuǎn)移、活化、翻譯等作用合成蛋白，從而實現(xiàn)其生物學(xué)功能，調(diào)控細胞的生長、增殖、分裂、凋亡。相關(guān)基因發(fā)生突變或缺失時,其蛋白水平亦會異常,使細胞的生長周期紊亂,最后發(fā)展為癌。

Hp是革蘭陰性、微需氧桿菌，其生長于胃黏膜表面和腫瘤腺體中，經(jīng)反復(fù)實驗最終確定與人胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍、胃癌的發(fā)病相關(guān)[4,5]。柳興源等[6]認(rèn)為，胃組織在 HP感染后可能通過TGF-β1及NF-κB兩條通路調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄及信號傳導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移過程。研究[7]發(fā)現(xiàn)，根除Hp能防止萎縮性胃炎進一步發(fā)展，降低胃癌的發(fā)病率。本研究結(jié)果顯示，漢族胃癌患者Hp陽性率為66.7%，與趙文月等[8]所檢測的70例漢族胃癌患者Hp陽性率64.3%接近。漢族胃癌患者Hp陽性率與蒙古族比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但蒙古族胃癌患者Hp感染率有高于漢族人群的趨勢，這可能與蒙古族人群的飲食習(xí)慣和生活環(huán)境相關(guān)，此項研究仍需進一步擴大樣本量、增加隨機性等方法進一步研究證實。該實驗表明Hp的高陽性率是導(dǎo)致胃癌尤其是蒙古族人群胃癌發(fā)生的重要原因之一。王學(xué)東等[9]通過檢測胃癌前病變和胃癌患者的Hp感染率發(fā)現(xiàn)，癌前病變患者Hp感染率低于胃癌患者，進一步推斷Hp侵襲胃黏膜后，釋放多種酶類損傷胃黏膜，引起局部組織損傷，誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，使胃黏膜發(fā)生萎縮、腸上皮細胞化生和不典型增生等改變，增加了上皮細胞的不穩(wěn)定性，使上皮細胞的凋亡和增殖功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致胃癌發(fā)生。另有部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染與胃癌發(fā)生的部位、大小、分化程度及遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)；而與浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；Hp還可通過與其他致癌、促癌因素共同作用，通過多種信號通路發(fā)揮致癌作用[10]。

p14ARF是一種新型的抑癌基因，作用于細胞周期的G1～S期和G2～S期，從而阻止細胞向下個周期進展[11]，其通過p53依賴性途徑和非p53依賴性途徑，監(jiān)控細胞周期[12]。本研究結(jié)果顯示，p14ARF在胃癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達漸進性升高，表明p14ARF在胃癌發(fā)生前已有部分失活，癌組織失活更加明顯，證明p14ARF失活參與了胃癌的發(fā)生過程。RT-PCR法進一步證實p14ARF基因缺失與胃癌發(fā)生的相關(guān)性。Lv等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌相關(guān)有抑癌作用的上皮細胞相關(guān)功能蛋白通過穩(wěn)定p53與E-cadherin蛋白相關(guān)的Rb/E2F1/p14ARF/Mdm2信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮抑癌作用，本研究結(jié)果與其一致，證實p14ARF失活是導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的又一重要因子。蒙古族胃癌患者在p14ARF表達方面與漢族患者相一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明蒙古族人群p14ARF在癌組織中表達減少同樣是促進胃癌發(fā)生的因素之一。兩民族人群癌旁組織p14ARF較癌組織表達增高，但較正常組織表達降低，進一步證明p14ARF在胃癌發(fā)生過程中的作用。關(guān)于p14ARF的研究目前尚少，其作用機制仍不明確，但隨著研究的進展，會不斷發(fā)現(xiàn)p14ARF在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

關(guān)于Hp與p14ARF在胃癌組織中表達的相關(guān)性分析研究目前尚無報道，本研究結(jié)果顯示，兩民族人群中上述兩因子的表達均呈負(fù)相關(guān)。推斷Hp感染胃黏膜后分泌細胞毒素可能導(dǎo)致黏膜炎癥反應(yīng)，同時誘導(dǎo)黏膜的變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞萎縮、異常增生或腸化，進而發(fā)展為不典型增生，在上皮細胞變化過程中，可能促進了p14ARF的失活，進一步減少對上皮細胞異常增生的抑制，促進了胃癌的發(fā)生。Wei等[14]采用免疫組化法證明p14ARF可解除依賴Hp的CagA蛋白對p53基因的抑制作用而發(fā)揮抗癌作用。蒙古族、漢族患者在Hp與p14ARF的表達相關(guān)性相同，表明上述兩種因子在兩民族中的致病機制可能相同。

綜上所述，蒙古族、漢族胃癌患者癌組織中p14ARF均呈低表達，Hp陽性率均較高，Hp陽性與p14ARF表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Hp與p14ARF在蒙古族、漢族胃癌中的發(fā)病機制可能相同，二者可能共同促進胃癌的發(fā)生。

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Expression changes of Hp and p14ARFof patients with gastric carcinoma in Han and Mongolian nationalities

LUZhigang1,LENGXueqin,LIYan,JIAHuiqiong

(1AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010051,China)

Objective To detect the expression of Helicobacter pylori (Hp) and p14ARFin the gastric cancer tissues, paracancerous tissue and normal tissues of patients with gastric carcinoma in Han and Mongolian nationalities and the mechanism of two factors in the occurrence of gastric cancer.Methods Immunohistochemical (S-P) method, a modified Warthin-Starry (W-S) silver staining method and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the expression of protein and mRNA of Hp and p14ARFin gastric cancer tissues, paracancerous tissues and normal tissues from 27 cases of Mongolian patients and 30 cases of Han patients with gastric cancer. Spearman analysis was used to analyze the correlation between the Hp and p14ARFexpression in the gastric cancer tissues of patients from two nationalities.Results The expression of p14ARFin gastric cancer tissues of Mongolian and Han patients was lower than that in paracancerous and normal tissues, and the difference was statistically significant (allP<0.05). The expression of p14ARFin the paracancerous tissues was lower than that in the normal tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05), Meanwhile, the expression of p14ARFitself in two nationalities had no significant difference (P>0.05). The positive rate of Hp was high in the gastric cancer tissues of patients in Mongolian and Han nationalities, and there was no significant difference in the rate of infection between the two nationalities (P>0.05). The relative expression of p14ARFmRNA was statistically significant among the cancer tissues, paracancerous tissues and normal tissues of Han patients with gastric cancer as well as in Mongolian patients (allP<0.05). There was no significant difference in the relative expression of p14ARFmRNA of cancer tissues, paracancerous tissues and normal tissues of Mongolian and Han patients (P>0.05). Spearman correlation analysis showed that the positive expression of Hp and p14ARFwas negatively correlated with each other in Han and Mongolian gastric cancer tissues (r=-0.406,-0.433, allP<0.05).Conclusions The expression of p14ARFis low, the positive rate of Hp is high, and p14ARFand Hp is negatively correlated in cancer tissues of patients with gastric cancer. The pathogenic mechanism of Hp and p14ARFin the Mongolian and Han patients with gastric cancer may be the same, and both of Hp and p14ARFmay jointly promote the occurrence of gastric cancer.

gastric carcinoma; Helicobacter pylori; p14ARFgene; Mongolian nationality; Han nationality

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2014MS08109)。

魯志剛(1977-)，男，碩士研究生，主要研究方向為食管腫瘤、胃腫瘤。E-mail:nmgfylzg@163.com

簡介：冷雪芹(1963-)，女，碩士研究生，主任醫(yī)師、教授，主要研究方向為消化道腫瘤。E-mail:lxq63@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.006

R735.2

A

1002-266X(2016)41-0022-04

2016-06-10)