馬笛,賀川,魏媛,馬新宇,張忠良,鞏平

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

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大蒜素對TGF-β1誘導的胰腺癌細胞EMT的抑制作用及其機制

馬笛,賀川,魏媛,馬新宇,張忠良,鞏平

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

目的 探討大蒜素對TGF-β1誘導的胰腺癌細胞上皮-間充質轉化(EMT)的抑制作用及機制。方法 常規(guī)培養(yǎng)胰腺癌細胞株PANC-1細胞，取對數生長期細胞，隨機分為大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組、TGF-β1組及空白對照組，前三組分別以TGF-β110 ng/mL+大蒜素5 μg/mL、大蒜素5 μg/mL、TGF-β110 ng/mL處理PANC-1細胞，空白對照組不予干預。應用MTT法檢測細胞增殖情況；劃痕試驗、Transwell小室試驗測定胰腺癌細胞的遷移、侵襲能力。RT-PCR法檢測各組E-Cadherin、Viminten及NF-κB表達。結果 MTT結果顯示大蒜素干預后胰腺癌細胞增殖受到抑制，24 h與48 h的IC50分別為69.44、100.90 μmol/L,呈時間和劑量依賴性；劃痕試驗顯示空白對照組、大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組及TGF-β1組8 h遷移率分別為0.56±0.11、0.10±0.07、0.09±0.05、0.61±0.23；24 h遷移率分別為1.00±0.00、0.74±0.20、0.40±0.05、1.00±0.00。Transwell小室試驗顯示，空白對照組、大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組及TGF-β1組的侵襲率分別為2.15±0.04、1.98±0.14、1.01±0.01、2.93±0.02，大蒜素組與其他三組比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；RT-PCR結果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1組E-cadherin表達明顯下調(P均<0.05)，Vimentin表達則明顯上調(P均<0.05)。與TGF-β1組相比，大蒜素+TGF-β1組及大蒜素組E-candherin表達上調，Vimentin表達下調；同時，NF-κB的表達亦明顯下調(P均<0.05)。結論 大蒜素能阻斷TGF-β1誘導的胰腺癌EMT效應，其可能通過抑制NF-κB信號通路抑制胰腺癌細胞發(fā)生EMT。

胰腺癌；大蒜素；上皮間質轉化；核因子-κB

胰腺癌是高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤之一,僅2014年就約有46 420新發(fā)病例和39 590例死亡病例[1]。眾所周知，胰腺癌具有侵襲性的原因之一是化療藥物的耐藥性[2]。晚期胰腺癌患者的標準化療方案是吉西他濱單藥或聯(lián)合其他化療藥物治療[3。4]，雖然化療和全身性治療對胰腺癌有一定療效，但5年生存率仍不達6%[1]。越來越多的證據表明，上皮-間質轉化(EMT)在胰腺癌的發(fā)展中起重要作用[5]，在EMT過程中，上皮細胞獲得間質表型，從而增強侵襲性和轉移性，同時，上皮細胞失去如E-cadherin的上皮標記物表達，而細胞獲得間質細胞標記物包括波形蛋白的高表達[6]，而TGF-β1可誘導胰腺癌細胞發(fā)生EMT從而促進其侵襲和轉移[7]。已有研究表明，多條通路均能誘導EMT，NF-κB通路就是其中重要的一條[8]，近年來研究發(fā)現(xiàn)大蒜素的抗瘤效應與核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路密切相關[9]。2015年7月，我們觀察了EMT分子標志物及NF-κB在胰腺癌細胞中的表達及細胞增殖、侵襲和轉移能力變化，探討大蒜素對NF-κB誘導的胰腺癌細胞EMT的抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株PANC-1(中國科學院細胞生物研究所)；大蒜素注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，0901241，2 mL：30 mg)；重組人TGF-β1(美國Peprotech公司，0614209)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；二甲基亞砜(上海國藥集團)；四甲基偶氮唑藍(北京鼎國生物技術有限責任公司)；胎牛血清(美國Gibco公司);Transwell試劑盒(Corning)；TRIzol試劑盒(上海普飛)。無菌超凈工作臺；英國 New Brunswick Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱；ZE122 熒光顯微鏡；湖南湘儀L420臺式低速自動平衡離心機；穩(wěn)壓電泳儀；RT-PCR儀器。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人胰腺癌細胞株PANC-1于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞70%～80%融合時用胰蛋白酶消化傳代，每3～4 d傳代1次，取對數生長期細胞，隨機分為大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組、TGF-β1組及空白對照組。

1.3 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。將處于對數生長期的各實驗組細胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，使細胞濃度為5×104/mL，將細胞接種到96孔板，每組3～5復孔，每孔100 μL，鋪好板后，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組、TGF-β1組分別以TGF-β110 ng/mL+大蒜素5 μg/mL、大蒜素5 μg/mL、TGF-β110 ng/mL處理PANC-1細胞，實驗組及空白對照組均加入不同濃度大蒜素的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μmol/L，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12、48 h，培養(yǎng)終止前4 h加入5 mg/mL的MTT 10 μL；4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO終止反應。振蕩器振蕩5～10 min，酶標儀490 nm處檢測OD值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 細胞遷移率測算 取對數生長期的人胰腺癌細胞株PANC-1經胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度至2×106/mL，接種到6孔板中，每孔1 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細胞完全貼壁鋪滿孔底，吸棄培養(yǎng)液，用黃色移液槍頭在6孔板的每孔中線劃出一道直痕，痕寬650～680 μm。分別以大蒜素5 μg/L+TGF-β110 ng/mL、大蒜素5 μg/L、 TGF-β110 ng/mL處理細胞，另設空白對照組。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、8、24 h拍照。用倒置顯微鏡圖像處理軟件測量痕寬，計算各組細胞遷移率。

1.5 細胞侵襲能力檢測 于24孔Transwell小室濾膜上方每孔涂敷人工基底膜(Matrige)50 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h，使其形成凝膠狀。分別以大蒜素5 μg/L+TGF-β110 ng/mL、大蒜素5 μg/L、 TGF-β110 ng/mL作用胰腺癌PANC-1細胞 2 h 后，取1×104個細胞加入100 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，至上室，下層培養(yǎng)孔加 600 μL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，每組設5個復孔。培養(yǎng)24 h后取出濾膜，擦掉小室內表面未穿過膜的細胞，固定后結晶紫染色，倒置顯微鏡下計數膜背面的細胞數，隨機計數20個視野，計算平均值，每組重復3次。

1.6 PANC-1細胞中E-cadherin、Vimentin及NF-κB mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。將人胰腺癌細胞株PANC-1先用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，再分別以大蒜素5 μg/L+ TGF-β110 ng/mL、大蒜素5 μg/L、TGF-β110 ng/mL處理細胞，未用藥處理組為對照組。處理48 h后采用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，采用Nanpdrop 2000/2000C分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及質量。再以Promega-M-MLV試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA,配制PCR反應液，在RT-PCR儀器上按反應條件進行RT-PCR反應，每組設3個復孔。設GAPDH為內參，E-cadherin上游引物5′-AACGCATTGCCACATACA-3′,下游引物5′-C-GGGCTTGTT-GTCATTC-3′;Vimentin上游引物5′-AATGGCTCGTCACCTTCG-3′，下游引物5′-CTAGTTTCAACCGTCTTAAT-3′;NF-κB上游引物5′-GACTACGACC-TGAATGCTGTG-3′,下游引物5′-ACCTCAATGTCCTCTTTCTGC-3′;GAPDH上游引物5′-AGGATTTCGTTTCCGTTATGT-3′，下游引物5′-TGACTTCAACAGC-GACACCCA-3′。PCR反應條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。將對照組mRNA表達量定為100%,以2-ΔΔCt法計算E-cadherin、Vimentin及NF-κB mRNA相對表達量,分析比較各組基因表達差異。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間差異比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett′s法(方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素對人胰腺癌細胞PANC-1增殖的影響MTT結果顯示大蒜素作用于胰腺癌PANC-1細胞24、48h后，IC50分別為69.44、100.9μmol/L，呈時間和劑量依賴性(圖1)。

注：A為大蒜素作用24 h；B為大蒜素作用48 h。

2.2 大蒜素對人胰腺癌PANC-1細胞發(fā)生EMT后遷移能力的影響 空白對照組、大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組及TGF-β1組8 h遷移率分別為0.56±0.11、0.10±0.07、0.09±0.05、0.61±0.23；24 h遷移率分別為1.00±0.00、0.74±0.20、0.40±0.05、1.00±0.00。給藥前各組PANC-1細胞的傷痕寬度差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，隨著時間推移，傷痕開始得到修復，8、24 h時，傷痕寬度逐漸變窄，與對照組相比，大蒜素+TGF-β1組和大蒜素組可顯著抑制劃痕的修復(P<0.05)，并呈一定時效關系。而TGF-β1組和空白對照組在24 h時已完全愈合(P>0.05)，表明大蒜素可抑制胰腺癌PANC-1細胞發(fā)生EMT后的遷移能力。

2.3 大蒜素對人胰腺癌PANC-1細胞發(fā)生EMT后侵襲能力的影響 小室實驗顯示，空白對照組、大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組及TGF-β1組的侵襲率分別為2.15±0.04、1.98±0.14、1.01±0.01、2.93±0.02。大蒜素組及大蒜素+TGF-β1組細胞的侵襲能力較對照組減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，大蒜素組及大蒜素+TGF-β1組細胞的侵襲能力較TGF-β1組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.4 大蒜素對人胰腺癌PANC-1細胞發(fā)生EMT后E-cadherin、Vimentin及NF-κB表達的影響 胰腺癌PANC-1細胞經大蒜素及TGF-β1處理后，空白對照組、大蒜素+TGF-β1組、大蒜素組及TGF-β1組E-cadherin的mRNA相對表達量分別為1.00±0.30、0.53±0.05、2.59±0.32、0.29±0.04，而Vimentin mRNA相對表達量分別為1.00±0.09、1.39±0.04、0.69±0.08、2.42±0.22，NF-κB mRNA相對表達量分別為1.00±0.05、0.92±0.05、0.45±0.04、2.17±0.26。與對照組相比，TGF-β1組的E-cadherin表達下調，Vimentin及NF-κB表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；大蒜素+TGF-β1組的E-cadherin及NF-κB表達下調，Vimentin表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而大蒜素組的E-cadherin表達明顯上調，Vimentin及NF-κB表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。此外，與TGF-β1組相比，大蒜素+TGF-β1組及大蒜素組的E-cadherin表達上調，而Vimentin及NF-κB表達明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

3 討論

大蒜素為三硫代烯丙醚類化合物，天然存在于百合科植物大蒜的鱗莖中。大量研究表明，大蒜素的攝入能減少多種腫瘤的發(fā)生；而且大蒜素在體內外對多種腫瘤包括肺癌、肝癌、結腸癌、食管癌、胃癌、前列腺癌及血液系統(tǒng)腫瘤等均有抗腫瘤作用[10]。但有關大蒜素對胰腺癌的作用機制研究卻鮮有報道。本研究通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖，并隨著作用時間延長，大蒜素對PANC-1細胞的增殖抑制率升高，并呈一定的劑量依賴性；此與文獻[11]報道基本一致。

EMT是指細胞失去上皮特性向間充質轉變的過程。研究證明，EMT與腫瘤的遷移、轉移和侵襲密切相關，有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對人腦膠質瘤[12]、肺癌[13]、結腸癌[13]等腫瘤細胞的侵襲及轉移有明顯抑制作用。本研究通過Transwell和劃痕試驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導胰腺癌PANC-1細胞發(fā)生EMT后，在大蒜素的干擾下，其侵襲及轉移能力明顯減弱；提示大蒜素可抑制胰腺癌細胞發(fā)生EMT，從而影響其侵襲和轉移能力。

上皮標志蛋白E-cadherin是腫瘤細胞EMT過程中最重要的標志蛋白，其表達缺失伴隨上皮細胞表型的喪失，使細胞黏附能力下降，易于脫落發(fā)生轉移，而間質標志蛋白Vimentin表達升高使得細胞易于發(fā)生侵襲轉移。Tsuji等[14]研究認為E-cadherin表達缺失與再表達不是取決于不可逆轉的基因缺失或突變，調節(jié)其表達的機制是可逆的。因此，抑制EMT的發(fā)生對腫瘤轉移與浸潤有重要意義。

NF-κB是一種重要的轉錄調節(jié)因子，在刺激因素作用下，胞質中的抑制蛋白IκB發(fā)生磷酸化降解，解除了對NF-κB的抑制，釋放其進入核內參與調節(jié)多種基因的轉錄表達，使其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。扈啟寬等[15]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能降低胃癌細胞的NF-κB活性，使NF-κB結合DNA的活性降低，導致某些基因表達水平改變。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，NF-κB表達下調，則會出現(xiàn)EMT現(xiàn)象，同時降低了癌細胞的侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，TGF-β1組的E-cadherin表達下調、Vimentin表達上調，同時NF-κB表達上調；而與TGF-β1組相比，大蒜素+TGF-β1組及大蒜素組E-cadherin表達上調、Vimentin表達下調，同時NF-κB表達明顯下調，差異均有統(tǒng)計學意義。上述結果表明，大蒜素可能通過調節(jié)NF-κB信號通路發(fā)揮其對胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制作用。

綜上所述，大蒜素能抑制TGF-β1誘導的胰腺癌細胞發(fā)生EMT，這種作用可能通過調節(jié)NF-κB信號通路實現(xiàn)。

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Inhibitory effect of allicin on TGF-β1-induced EMT of pancreatic cancer cells

MADi,HEChuan,WEIYuan,MAXinyu,ZHANGZhongliang,GONGPing

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To investigate the inhibitory effects of allicin on TGF-β1-induced epithelium mesenchymal transition (EMT) of pancreatic cancer cells and its mechanism.Methods The pancreatic cancer cell line PANC-1 in logarithmic growth phase were routinely cultured and then were randomly divided into allicin+TGF-β1group, allicin group, TGF-β1group and the control group. The PANC-1 cells in the former three groups were respectively treated with 10 ng/mL TGF-β1+ 5 μg/mL allicin, 5 μg/mL allicin, and 10 ng/mL TGF-β1, and the control group without any treatment. MTT assay was used to detect cell proliferation; scratch test, Transwell chamber experiment were used to measure the migration and invasion of pancreatic cancer cell, and RT-PCR was applied to detect the E-Cadherin, Viminten and NF-κB expression.Results MTT showed that after allicin intervention, the cell proliferation of pancreatic cancer was inhibited, IC50at 24 and 48 h was 69.44, and 100.9 μmol/L, which was in a time- and dose-dependent manner. The scratch test showed the migration rates at 8 h of the control group, allicin + TGF-β1group, allicin group and TGF-β1group were 0.56±0.11, 0.10±0.07, 0.09±0.05, and 0.61±0.23; at 24 h , they were 1.00±0.00, 0.74±0.20, 0.40±0.05, and 1.00±0.00. Transwell chamber experiment showed the invasion rates of the control group, allicin + TGF-β1group, allicin group and TGF-β1group were 2.15±0.04, 1.98±0.14, 1.01±0.01 and 2.93±0.02, and statistically significant difference was found between allicin group and the other three groups (allP<0.05). The RT-PCR showed that compared with the control group, E-cadherin expression was significantly decreased, and Vimentin expression was significantly increased in the TGF-β1group (allP<0.05). Compared with TGF-β1group, the E-candherin was up-regulated, Vimentin was down-regulated and the NF-κB expression was also down-regulated in the allicin + TGF-β1group and allicin group (allP<0.05). Conclusion Allicin has a blocking effect on TGF-β1-induced EMT of pancreatic cancer, which can inhibit the EMT of pancreatic cancer cells by regulating NF-κB signaling pathway.

pancreatic carcinoma; allicin; epithelial mesenchymal transition; nuclear factor-κB

上海市胰腺疾病重點實驗室開放課題(PC-2013-02)。

馬笛(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤的綜合治療。 E-mail:591417144@qq.com

簡介：鞏平(1964-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要研究方向為腫瘤的綜合治療。E-mail:18999536479@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.005

R735.9

A

1002-266X(2016)41-0018-04

2016-02-20)