劉桂彪，張銘鋒，申璐，黃劍秋，郭瑩，黃文飛，閉麗華，王保山，王彩冰，方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000)

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白花九里明對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

劉桂彪，張銘鋒，申璐，黃劍秋，郭瑩，黃文飛，閉麗華，王保山，王彩冰，方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000)

目的 探討白花九里明提取液對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 取KM小鼠50只，隨機(jī)均分為5組，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予0.9%NaCl注射液，聯(lián)苯雙酯組給予0.2g/kg聯(lián)苯雙酯，白花九里明低濃度組和高濃度組分別給予15、30g/kg的白花九里明提取液灌胃7d；同時(shí)在灌胃的第1、3、5天，對(duì)正常對(duì)照組給予0.9%NaCl注射液腹腔注射，模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度和高濃度組均給予0.1%四氯化碳(CCl4)溶液腹腔注射。末次灌胃1h后，采血分離血清、取肝左葉制肝懸液分離上清液、取肝右葉制備組織切片。檢測(cè)肝勻漿和血清的總蛋白(TP)含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組肝勻漿TP含量明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.01)，白花九里明高濃度組肝勻漿TP含量明顯高于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組(P均<0.05)，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、白花九里明低濃度組肝勻漿GPT活性明顯高于聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組(P均<0.05)，白花九里明低濃度組血清GOT活性明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；白花九里明高濃度組、聯(lián)苯雙酯組、模型對(duì)照組肝勻漿SOD活性明顯低于正常對(duì)照組(P均<0.05)，白花九里明低濃度組的肝勻漿SOD活性明顯高于聯(lián)苯雙酯組(P<0.05)，白花九里明低濃度組血清SOD活性明顯高于正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明高濃度組(P均<0.01)；白花九里明低濃度組和高濃度組肝勻漿MDA含量明顯低于正常對(duì)照組(P均<0.05)；其余各組血清TP含量、GPT活性、GOT活性、SOD活性、MDA含量組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。鏡下示聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組和高濃度組與模型對(duì)照組相比，肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞變性溶解壞死數(shù)量等均有較大改善，白花九里明低濃度組的少數(shù)中央靜脈管腔內(nèi)見少量的脫落肝組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論 白花九里明對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，且呈濃度依賴性，高濃度白花九里明保護(hù)肝細(xì)胞效應(yīng)與聯(lián)苯雙酯相當(dāng)；其機(jī)制可能與促進(jìn)和調(diào)動(dòng)SOD清除自由基、阻斷和降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成有關(guān)。

急性肝損傷；壯藥；白花九里明提取液；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性;谷草轉(zhuǎn)氨酶活性;超氧化物歧化酶活性;丙二醛；小鼠

白花九里明為菊科植物，分布于廣西、廣東、云南等地,常生長(zhǎng)于山坡灌叢、密林、林邊、溪旁、路邊，性微溫、味微苦，在壯族民間內(nèi)服治療月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后流血、風(fēng)濕骨痛，外用治療跌打腫痛[1,2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，白花九里明有促進(jìn)止血和凝血、增強(qiáng)小腸運(yùn)動(dòng)、抑制離體心臟收縮力、降低血壓等作用[3～6]。而白花九里明對(duì)肝臟損傷方面的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)用四氯化碳(CCl4)制備小鼠急性肝損傷模型，采用白花九里明的民間用量[1,2]按體表面積換算成小鼠用量給小鼠灌胃，研究白花九里明提取液對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，并與臨床上保肝藥物聯(lián)苯雙酯[7]的保肝作用相比，為白花九里明的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：健康普通級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量25～30 g, 由廣西右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 桂2011-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2012-0003。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18～22 ℃、濕度50%～60%、日光照12 h。藥材及實(shí)驗(yàn)器材： 白花九里明采于廣西百色市郊(經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)教研室覃道光教授認(rèn)定)，曬干備用。聯(lián)苯雙酯滴丸(Bifendate Pills，萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：1.5 mg，批號(hào)：A02141115)；0.9%氯化鈉注射液(貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：A15031618)；99.5%CCl4(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20110222)；甲醛(成都市科龍化工試劑廠，20101021)；TP定量測(cè)試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20151008、20151009、20151009、20150929、20150818)。酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：Multiskan MK3)；數(shù)碼顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA210Digital)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-16G)；勻漿機(jī)(PRO Scientific Inc Oxford CT USA，型號(hào)：PR0200)；水浴箱(江蘇金壇宏凱儀器廠，型號(hào)：HSY-2M)。

1.2 白花九里明提取液的制備 取白花九里明干草200 g，用30 ℃溫水2 000 mL浸泡4 h，文火煮沸1 h，過濾液隔水文火濃縮至200 mL，提取液濃度為1 g/mL(每毫升含干藥材1 g)放4 ℃冰箱保存。

1.3 小鼠急性肝損傷模型的制備 取99.5%CCl4溶液0.1 mL加入至99.9 mL的茶籽油中，配制成0.1%CCl4溶液。在灌胃的第1、3、5天，對(duì)小鼠按10 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射0.1%CCl4油溶液。小鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、不光滑，精神萎靡，大便稀爛，血標(biāo)本AST、ALT增高，肝組織結(jié)構(gòu)模糊不清、細(xì)胞水腫或細(xì)胞溶解壞死等現(xiàn)象，說明制模成功。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 取小鼠50只，按體質(zhì)量隨機(jī)均分為5組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予0.9% NaCl注射液,聯(lián)苯雙酯組給予20 mg/mL聯(lián)苯雙酯,白花九里明低濃度組和高濃度組分別給予含白花九里明干藥材濃度的0.5、1.0 g/mL白花九里明提取液灌胃，灌胃量按30 mL/kg體質(zhì)量計(jì)算，1次/d，共7 d；同時(shí)在灌胃的第1、3、5天，對(duì)正常對(duì)照組給予0.9% NaCl注射液腹腔注射，模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度和高濃度組均給予0.1%CCl4溶液腹腔注射[8]，注射量按10 mL/kg體質(zhì)量計(jì)算。

1.5 小鼠血清TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平的檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)的第7天，末次灌胃30 min后，摘除眼球法取血液，靜置2 h待血液凝固后，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，分離出血清，分別用TP定量測(cè)試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，按說明書要求進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平。

1.6 小鼠肝勻漿TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平的檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)的第7天，末次灌胃30 min取血后，迅速剖腹取肝左葉，剪取0.4 g肝組織放入含3.6 mL冰凍0.9%NaCl溶液試管中，用勻漿機(jī)攪拌成10%肝懸液，用離心機(jī)4 000 r/min離心10 min取上清夜，分別用TP定量測(cè)試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，按說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)肝勻漿TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平。

1.7 小鼠肝組織結(jié)構(gòu)變化觀察 末次灌胃1 h后摘除眼球法采血離心分離血清；迅速剖腹取肝左葉加生理鹽水?dāng)嚢柚瞥?0%肝懸液離心分離上清液；取肝右葉浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，脫水、石臘包埋、HE染色制成組織切片，通過數(shù)碼顯微鏡檢查各組小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)并攝影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝勻漿和血清TP、GPT、GOT水平比較 見表1。

表1 各組小鼠肝勻漿和血清的TP含量、GPT水平比較

2.2 各組小鼠肝勻漿和血清SOD、MDA水平比較 見表2。

表2 各組小鼠肝勻漿和血清的SOD、MDA水平比較

2.3 各組小鼠肝組織切片鏡下結(jié)構(gòu)變化 正常對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無肝細(xì)胞變性、壞死。模型對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)模糊不清，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞彌漫水腫，胞質(zhì)疏松，胞核體積變小甚至溶解，細(xì)胞溶解壞死明顯，中央靜脈管腔變小，管腔內(nèi)堆積大量的脫落肝組織結(jié)構(gòu)。聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組和高濃度組與模型對(duì)照組相比較，前三者的肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞變性溶解壞死數(shù)量等均有較大的改善，白花九里明低濃度組的少數(shù)中央靜脈管腔內(nèi)見少量的脫落肝組織結(jié)構(gòu)。

3 討論

肝臟是蛋白質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，肝細(xì)胞膜受損可致血清TP水平升高；CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450酶系作用下生成自由基CCl3·和CCl3O2·，攻擊肝細(xì)胞膜磷脂引起脂質(zhì)過氧化，亦可與肝細(xì)胞的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合而破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損；聯(lián)苯雙酯通過調(diào)控細(xì)胞色素P450同工酶作用起到保肝作用；GPT、GOT是胞內(nèi)酶，參與蛋白質(zhì)合成，正常情況下在血清中的水平很低，肝細(xì)胞膜受損時(shí)可引起血清GPT、GOT水平升高[9，10]。

SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，能清除體內(nèi)超氧自由基，避免細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的脂質(zhì)過氧化物(LPO)造成細(xì)胞損傷。正常情況下，體內(nèi)自由基生成與清除能力處于動(dòng)態(tài)平衡，無論是自由基生成過多或清除能力下降，均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。應(yīng)急狀態(tài)下，SOD被緊急動(dòng)員而水平往往高于正常。通過SOD水平的測(cè)定能反映氧自由基含量，LPO中間代謝產(chǎn)物MDA水平的測(cè)定能反映脂質(zhì)過氧化物濃度[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白花九里明高濃度組和低濃度組、聯(lián)苯雙酯組、模型對(duì)照組的肝勻漿TP水平明顯高于正常對(duì)照組，白花九里明高濃度組和聯(lián)苯雙酯組的肝勻漿GPT水平明顯低于正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、白花九里明低濃度組，肝勻漿GOT水平在各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示CCl4誘導(dǎo)肝損傷的肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增多，這是肝細(xì)胞抵抗損傷、啟動(dòng)修復(fù)程序的一種積極體現(xiàn)，肝勻漿中的TP水平升高與GPT水平降低呈反比關(guān)系，說明GPT參與肝內(nèi)蛋白質(zhì)合成[9]。血清TP、GPT水平在各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清GOT水平除白花九里明低濃度組明顯低于正常對(duì)照組外，其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而白花九里明高濃度組血清GOT水平接近于白花九里明低濃度組；提示CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷還未能在血清TP、GPT、GOT等指標(biāo)上的及時(shí)表達(dá)，白花九里明可降低血清GOT水平。白花九里明高濃度組肝勻漿TP水平明顯高于模型對(duì)照組，血清TP水平模型對(duì)照組比白花九里明低濃度和白花九里明高濃度組高。肝勻漿GPT水平白花九里明高濃度組和聯(lián)苯雙酯組明顯低于模型對(duì)照組；血清GPT水平模型對(duì)照組比白花九里明低濃度和白花九里明高濃度組高。提示白花九里明具有提高肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的作用。模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組的肝勻漿SOD水平明顯低于正常對(duì)照組，而血清SOD水平與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，肝勻漿和血清的MDA水平未出現(xiàn)明顯高于正常對(duì)照組的現(xiàn)象；提示CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)生成的自由基被SOD完全清除，但從肝組織切片觀察到使用CCl4的各組肝細(xì)胞均都呈現(xiàn)損傷表現(xiàn)，提示CCl4對(duì)肝細(xì)胞損傷不僅僅是通過自由基途徑。從肝組織切片我們觀察模型對(duì)照組損傷程度最嚴(yán)重，聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組損傷程度最輕，白花九里明低濃度組損傷程度較聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組明顯，但白花九里明低濃度組肝勻漿SOD水平明顯高于聯(lián)苯雙酯組而與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，白花九里明高濃度和低濃度組的肝勻漿MDA水平明顯低于正常對(duì)照組；提示白花九里明和聯(lián)苯雙酯均有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，白花九里明高濃度比低濃度對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)，白花九里明不僅能促進(jìn)肝細(xì)胞SOD清除自由基，還能調(diào)動(dòng)機(jī)體其他組織SOD進(jìn)入血循環(huán)，有利于運(yùn)輸?shù)礁渭?xì)胞發(fā)揮作用，同時(shí)能阻斷和降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

綜上所述，白花九里明保護(hù)肝細(xì)胞可能通過促進(jìn)和調(diào)動(dòng)SOD清除自由基，并阻斷和降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；提高肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成作用，修復(fù)肝細(xì)胞損傷、維護(hù)肝細(xì)胞膜穩(wěn)定、降低血清GPT和GOT水平實(shí)現(xiàn)；而白花九里明保護(hù)肝細(xì)胞的作用是否還存在其他途徑，有待于今后進(jìn)一步研究。

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Protective effect of Blumea megacephala on acute liver injury in mice

LIUGuibiao,ZHANGMingfeng,SHENLu,HUANGJianqiu,GUOYing,HUANGWenfei,BILihua,WANGBaoshan,WANGCaibing,FANGXiaoyan

(YoujiangMedicalCollegeforNationalities,Baise533000,China)

Objective To investigate the protective effect of Blumea megacephala extracting solution on acute liver injury of mice and its mechanism of action. Methods Fifty KM mice were randomly divided into 5 groups. Normal control group and model control group were given 0.9% NaCl injection, bifendatatum group was given 0.2 g/kg bifendatatum, Blumea megacephala low-concentration group and high-concentration group were respectively given 15 and 30 g/kg Blumea megacephala extracting solution for 7 days by gastric irrigation. Meanwhile, on day 1, 3 and 5 of gastric irrigation, the normal control group was given 0.9% NaCl by intraperitoneal injection, the rest of the groups were given 0.1%Carbon tetrachloride (CCL4) liquid. One hour 1 h after the last intragastric administration, we collected and separated the serum, and took the left lobe of liver to make and separate the liver supernatant, took the right lobe of liver to make tissue section. The total protein (TP), glutamic-pyruvic transaminase (GPT), glutamic-oxalacetic transaminase (GOT), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) content or activity in liver homogenate and serum were detected and we observed the structure changes of liver tissue microscopically. Results The TP content of liver homogenate in the model control group, bifendatatum group and Blumea megacephala low-concentration group was obviously higher than that of the normal control group (allP<0.01). The TP content of liver homogenate in the Blumea megacephala high-concentration group was higher than that of the normal control group and model control group (allP<0.05). The GPT activity of liver homogenate in the normal control group, model control group and Blumea megacephala low-concentration group was higher than that of the bifendatatum group and Blumea megacephala high-concentration group (allP<0.05). The GOT activity of serum in the Blumea megacephala low-concentration group was lower than that of the normal control group (P<0.05). The SOD activity of liver homogenate in the Blumea megacephala high-concentration group, bifendatatum group and model control group was lower than that of the normal control group (allP<0.05). The SOD activity of liver homogenate in the Blumea megacephala low-concentration group was higher than that of the bifendatatum group (P<0.05), but the SOD activity of serum was higher than that of the normal control group, model control group, bifendatatum group and Blumea megacephala high-concentration group (P<0.01). The MDA content of liver homogenate in the Blumea megacephala low-concentration group and high-concentration group was lower than that of the normal control group (allP<0.05). No statistically significant difference were found in the TP content, GPT activity, GOT activity, SOD activity and MDA content of serum among these groups (P>0.05). The histological examinations showed that the liver tissue structure was clear, less liver cells were degenerated, dissolved and necrotic and a small number of central venous cavities had a small amount of shedding liver tissue structure in the bifendatatum group, Blumea megacephala low-concentration and high-concentration group as compared with the model control group.Conclusions Blumea megacephala have protective effect on CCl4-induced acute liver injury with dose-effect relationship. The high-concentration Blumea megacephala have the same effect as bifendatatum on liver cells, whose mechanism may be related to facilitation and regulation of SOD in scavenging free radicals, blocking and reducing lipid peroxidation of liver cells, and enhancing protein synthesis in liver.

acute liver injury; Zhuang-nationality drugs; Blumea megacephala extracting solution; glutamic-pyruvic transaminase activity; glutamic-oxalacetic transaminase activity; superoxide dismutase activity; malondialdehyde; mice

2015年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510599009)。

劉桂彪(1992-)，男，本科在讀，專業(yè)為臨床醫(yī)學(xué)。E-mail：83866781@qq.com

簡(jiǎn)介：王彩冰(1962-)，女，副教授，主要研究方向?yàn)樗幬锼幮W(xué)研究及生理教學(xué)研究。E-mail：wangcb4444@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.004

R575；R931.71

A

1002-266X(2016)41-0014-04

2016-06-06)