楊 威， 呂超志， 劉 峰， 李 丹， 曹 忠

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，微納生物傳感與食品安全檢測協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410114)

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超高壓高效液相色譜法測定茶酒中茶氨酸含量

楊 威， 呂超志， 劉 峰， 李 丹， 曹 忠*

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，微納生物傳感與食品安全檢測協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410114)

[目的] 研究茶酒中茶氨酸含量的分析方法。[方法] 以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生劑，采用超高壓高效液相色譜測定茶酒中的茶氨酸。[結(jié)果]檢測茶氨酸的線性范圍為0.1～100.0 μg/mL，線性方程可擬合為Y=53.57X-41.664，相關(guān)系數(shù)r為0.999 59，該方法的最低檢出限達(dá)到0.05 μg/g(以S/N=3計)。樣品中茶氨酸的含量為0.25 mg/kg，加標(biāo)試驗的回收率在99.6%～100.1%。[結(jié)論] 該方法快速、簡單、定量準(zhǔn)確，可在茶氨酸的測定分析中推廣應(yīng)用。

超高壓；高效液相色譜；茶酒；茶氨酸

茶酒是茶葉經(jīng)過復(fù)雜的釀制工藝釀造而成的一種既有酒的香醇又有茶的香氣的保健型功能飲料酒，具有醒腦明目、殺菌解毒和健胃生津的功效。目前國內(nèi)外的主要研究方向為保健茶酒的生產(chǎn)方式、茶酒成分及功效分析[1-2]。

茶氨酸是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，在茶葉氨基酸中占50%左右。茶氨酸不僅能降壓、抗腫瘤，還能促進(jìn)神經(jīng)生長[3]，同時茶氨酸還能夠提高食品鮮味，具有放松大腦的功能。對老鼠的腦電圖研究表明,茶氨酸表現(xiàn)出了咖啡因抑制特性[4]。茶的主要成分如茶氨酸等是主要的生物活性物質(zhì)，有益于人們的健康，以茶成分為基礎(chǔ)的產(chǎn)品如冷熱茶飲料、茶保健品及化妝品等也受到人們的關(guān)注[5]。因此，研究簡單靈敏，能快速定性、定量分析不同茶葉中茶氨酸含量的方法已引起廣泛重視。目前對茶氨酸的分析方法主要有傅立葉變換近紅外(FT-IR)光譜法[6]、電動力學(xué)毛細(xì)管色譜法(ECC)[7-8]、酶催化法[9]、紙層析-分光光度法[10]、離子對色譜法[11]、薄層色譜法[12]、氣相色譜法[13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[13]、柱后補償高效液相色譜法[14]、手性衍生-高效液相色譜法[15]等。為了提高分析檢測的靈敏度和分離的選擇性，筆者結(jié)合樣品特性，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生超高壓液相色譜法分析茶酒中的茶氨酸，以期能夠達(dá)到快速、準(zhǔn)確的分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料供試茶酒，市售。Agilent 1290 超高壓液相色譜儀，美國安捷倫公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市頂新實驗儀器有限公司；分析天平，北京科儀儀器有限公司。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；鄰苯二甲醛(OPA)、硼酸鹽溶液，美國安捷倫公司；甲醇、乙腈，色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司；磷酸氫二鈉，重慶市華東化工有限公司。所用試劑除注明外均為分析純或優(yōu)級純，試驗用水均為超純水(電阻率≥18.3MΩ·cm)。

1.2 樣品的處理

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水溶解配制成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，該溶液可在4 ℃的條件下存放3個月。試驗測定時移取不同體積的上述儲備液于容量瓶中，用超純水稀釋定容配制成相應(yīng)梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品的前處理。準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確到0.001 g)茶酒樣品于比色管，加水稀釋至5 mL。于70 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，冷卻至室溫，過0.45 μm的水系濾膜，待進(jìn)樣分析。

1.3 色譜條件色譜柱：Eclipse AAA C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)；流動相A：40 mmol/mL Na2HPO4溶液(用NaOH 溶液調(diào)pH至7.8)；流動相B：ACN∶MeOH∶H2O(45∶45∶10，V/V/V)；流速0.5 mL/ min；柱溫35 ℃；檢測波長338 nm。流動相隨時間的變化進(jìn)行梯度洗脫，具體洗脫條件見表1。

1.4 柱前衍生Agilent 1290的自動進(jìn)樣器可以進(jìn)行程序進(jìn)樣，柱前衍生的過程可以在自動進(jìn)樣器中進(jìn)行，具體程序如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇由于茶氨酸的極性較強[13-15]，依據(jù)反相色譜分離原理，化合物的保留時間取決于固定相碳的數(shù)目。通過對不同C18柱在超高壓下的試驗，發(fā)現(xiàn)普通的C18柱在超高壓下容易出現(xiàn)疏水塌陷，雜質(zhì)干擾大，響應(yīng)值較弱，而Eclipse AAA C18柱能較好地分離雜質(zhì)，保留能力也較強。因此選擇Eclipse AAA C18柱進(jìn)行試驗。

表1 流動相洗脫梯度

表2 衍生程序

2.2 檢測波長的選擇取某濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生后進(jìn)樣，在190～610 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行茶氨酸衍生物的紫外吸收掃描。從測得的光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，其衍生物的最大吸收波長在335～345 nm，通過多波長的設(shè)定及對標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的測定，結(jié)合雜質(zhì)的干擾和衍生物響應(yīng)值的考量，最終選擇338 nm作為最佳的檢測波長。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1所示。

圖1 L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

2.3 線性關(guān)系及檢出限配制不同濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再在最佳的色譜條件進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示：線性方程Y=53.57X-41.664，相關(guān)系數(shù)r為0.999 59，線性范圍為0.1～100.0 μg/mL，濃度和峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，方法的最低檢出限為0.05 μg/g(以S/N=3計)。相關(guān)數(shù)據(jù)如圖2所示。

圖2 線性圖譜

2.4 精密度及方法穩(wěn)定性取一定濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一天內(nèi)進(jìn)行6次測定，測得的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.9%。取衍生前樣品和衍生樣品各2份，分別放置0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 h后進(jìn)行測定，通過對測定峰面積數(shù)據(jù)的處理得出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。上述2個試驗說明方法的精密度較佳，衍生前和衍生后樣品在一定時間內(nèi)性質(zhì)較穩(wěn)定。

2.5 樣品測定結(jié)果及回收率采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率試驗，分別在空白溶液和待測樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法進(jìn)行處理后上機(jī)測定，對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后如表3所示。從表3可以看出，樣品的茶氨酸含量為0.25 mg/kg，加標(biāo)試驗的回收率在99.6%～100.1%，滿足普通實驗室對茶氨酸分析的要求。

表3 加標(biāo)回收試驗

3 結(jié)論

該試驗采用超高壓高效液相色譜對茶酒中茶氨酸的含量進(jìn)行了分析研究，利用OPA衍生劑增加了茶氨酸的紫外吸收效果，超高壓高效液相色譜對目標(biāo)物的保留時間、響應(yīng)靈敏度都有較大地提升。該方法快速、簡單、定量準(zhǔn)確，易于在茶氨酸的測定分析中推廣應(yīng)用。

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Determination of Theanine in Tea Liquor by Ultra High Pressure and High Performance Liquid Chromatography

YANG Wei,LU Chao-zhi,LIU Feng,CAO Zhong*et al (Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection,School of Chemistry and Biological Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha,Hunan 410114)

[Objective] The analytical method for content of theanine in tea liquor was investigated.[Method] Using o-phthalaldehyde (OPA) as a derivating agent,a method was established for determination of theanine in tea liquor by super high-pressure high performance liquid chromatography.[Result] The results showed that the linear range of 0.1-100.0 μg/mL for theanine detection was obtained,and the corresponding linear equation was fitted asY=53.57X-41.664 with correlation coefficientrof 0.999 59.Also,the minimum detection limit of 0.05 μg/g (S/N=3) was reached.The theanine content of the sample was determined as 0.25 mg/kg with a recovery rate of 99.6%-100.1%.[Conclusion] The method is rapid,simple and accurate,which is easy to be widely used in the determination and analysis of theanine in tea liquor.

Ultra high pressure; High performance liquid chromatography; Tea liquor; Theanine

國家自然科學(xué)基金項目(31527803)。

楊威(1983- )，男，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：食品/藥品質(zhì)量檢測。*通訊作者，教授，博士，從事化學(xué)生物傳感與食品、藥品安全檢測研究。

2016-08-12

TS 262.91

A

0517-6611(2016)30-0070-02