史素琴， 潘 研， 岳 新， 趙 璐

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院， 2中醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站, 第三附屬醫(yī)院博士后研發(fā)基地，河南 鄭州 450008)

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SENP3對(duì)大鼠成骨細(xì)胞端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度的影響

史素琴1， 潘 研1， 岳 新1， 趙 璐2△

(河南中醫(yī)藥大學(xué)1第一附屬醫(yī)院，2中醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站, 第三附屬醫(yī)院博士后研發(fā)基地，河南 鄭州 450008)

目的： 研究sentrin特異性蛋白酶3(SENP3)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度的影響。方法:首先0.2 mmol/L H2O2處理體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞后，Western blotting法檢測(cè)SENP3及特異性蛋白1(Sp1)的表達(dá)。pcDNA3.0-SENP3轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，分別于24 h、48 h、72 h后采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。轉(zhuǎn)染48 h后，Western blotting法檢測(cè)Sp1和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達(dá)，PCR-TRAP法及PCR法檢測(cè)端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度；ELISA檢測(cè)上清中堿性磷酸酶(ALP)和骨橋蛋白(OPN)的含量；放射免疫法(RIA)檢測(cè)骨鈣蛋白(OCN)的含量。最后將pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，并檢測(cè)以上指標(biāo)。結(jié)果:H2O2處理成骨細(xì)胞后，SENP3和Sp1的表達(dá)顯著上升。pcDNA3.0-SENP3轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞后，Sp1和TERT的表達(dá)顯著上升，細(xì)胞活力、ALP、OPN及OCN含量也都顯著上升；端粒酶活性顯著增加及端粒長(zhǎng)度縮短顯著延緩。而當(dāng)pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞后，細(xì)胞活力，ALP、OPN及OCN含量，端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度均未發(fā)生顯著變化。結(jié)論:SENP1通過(guò)上調(diào)Sp1的表達(dá)促進(jìn)TERT的表達(dá)，增加端粒酶活性上升及延緩端粒長(zhǎng)度縮短，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖能力。

Sentrin特異性蛋白酶3； 特異性蛋白1； 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶； 成骨細(xì)胞； 端粒酶

成骨-破骨細(xì)胞在維持骨重建平衡中發(fā)揮重要的作用[1]，正常情況下，二者保持平衡，但隨著年齡的增長(zhǎng)，成骨細(xì)胞的活性會(huì)隨之降低，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨密度降低，最終形成骨質(zhì)疏松[2]。由此可見(jiàn)，骨質(zhì)疏松與衰老有一定的關(guān)系，而端粒酶在衰老過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[3]。

端粒是染色體末端的一段富含G的DNA重復(fù)序列，在復(fù)制分裂過(guò)程中會(huì)逐漸丟失堿基對(duì)，導(dǎo)致端粒逐漸縮短，細(xì)胞發(fā)生老化。端粒酶(telomerase)則由端粒酶相關(guān)蛋白1(telomerase-associated protein 1，TEP1)、端粒酶RNA(telomerase RNA)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)組成，其中，TERT對(duì)端粒酶活性起著限速作用。

Sentrin特異性蛋白酶3(sentrin-specific protease 3，SENP3)是介導(dǎo)去小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化修飾的酶家族成員之一，主要功能是催化底物蛋白去除SUMO2/3，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，尤其是對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[4]。研究報(bào)道，輕度的氧化應(yīng)激條件下，SENP3蛋白水平即可顯著增加，而且可通過(guò)去除轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)的SUMO2/3修飾，進(jìn)而增加Sp1的活性[5-7]；而Sp1可以激活人TERT基因的表達(dá)，提高端粒酶活性，增加端粒長(zhǎng)度[8]，起到抗衰老的作用。在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生，氧化應(yīng)激可抑制成骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞的礦化作用。因此，本文旨在探索SENP3是否可通過(guò)影響Sp1的活性，進(jìn)而在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮抗衰老的作用，以期為治療骨質(zhì)疏松提供新的藥物靶點(diǎn)及策略。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

24 h內(nèi)新生的SD大鼠15只，購(gòu)買(mǎi)于南京君科生物工程有限公司，合格證號(hào)為SCXK(滬)2013-0016。

2 主要試劑及材料

透明質(zhì)酸酶、I型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、β-甘油磷酸鈉、MTT和telomerase檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于Sigma；巴比妥納購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司； H2O2購(gòu)于上海譜振生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于Thermo Fisher；SENP3、Sp1、TERT等I抗購(gòu)于Abcam；PVDF膜購(gòu)于Millipore；脫脂奶粉購(gòu)于南京生興生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；骨鈣素放射免疫分析試劑盒購(gòu)于上海研晶生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 成骨細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 將出生24 h內(nèi)的大鼠拉頸處死，用75%的乙醇消毒5 mim后，取其顱蓋骨放入PBS中進(jìn)行清洗，然后去除骨表面被膜和軟組織，并將骨片剪成(1～3) mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2% I型膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸酶進(jìn)行消化，總共消化5次，每次20 min；收集第5次消化后的細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后換液，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)至80%時(shí)，加入0.25%的胰酶進(jìn)行消化，即為原代成骨細(xì)胞，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.2 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色法鑒定成骨細(xì)胞 將無(wú)菌的玻片放入培養(yǎng)瓶中，傳代時(shí)加入適量的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)玻片后取出。用PBS沖洗后加入冷丙醇固定10 min，蒸餾水沖洗多次；將其放入現(xiàn)配的ALP孵育液(3% β-甘油磷酸鈉5 mL，2%巴比妥納5 mL，2% CaCl210 mL，2% MgSO41 mL，蒸餾水10 mL)中，于37 ℃孵育4～6 h；蒸餾水清洗數(shù)次后，在2%硝酸鈷中浸泡3～5 min，蒸餾水清洗；再置于1%硫化銨中2 min，蒸餾水清洗，晾干，封固，于光鏡下觀察。

3.3 H2O2處理成骨細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài) 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，加入終濃度為0.2 mmol/L 的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 重組pcDNA3.0-SENP3載體轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞 重組pcDNA3.0-SENP3質(zhì)粒由輝駿生物科技有限公司構(gòu)建。所用細(xì)胞為H2O2處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為pcDNA3.0-SENP3轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.0空載轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.0 vector組)和未轉(zhuǎn)染組[即空白對(duì)照(blank control, BC)組]。將培養(yǎng)的成骨細(xì)胞以每孔1×106接種于6孔培養(yǎng)板中，待其長(zhǎng)滿(mǎn)后取出。吸取鑒定后的pcDNA3.0-SENP3質(zhì)粒20 μL，Lipofectamine 2000 100 μL，不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL，均勻混合后，室溫下靜置15 min。然后將質(zhì)粒、脂質(zhì)體混合物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，每孔300 μL，再將其放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)染組則加入等量的DMEM培養(yǎng)液，每組均重復(fù)3孔，并設(shè)置3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

3.5 pcDNA3.0-SENP3 與Sp1-siRNA共轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞 重組Sp1-siRNA由輝駿生物科技有限公司構(gòu)建合成。所用細(xì)胞為H2O2處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組(即BC組)、pcDNA3.0-SENP3+Sp1-siRNA轉(zhuǎn)染組(pcDNA-SENP3+si-Sp1)和只加轉(zhuǎn)染試劑組(mock組)，將培養(yǎng)的成骨細(xì)胞以每孔1×106接種于6孔培養(yǎng)板中，待其長(zhǎng)滿(mǎn)后取出。吸取鑒定后的pcDNA3.1-SENP3質(zhì)粒及Sp1-siRNA質(zhì)粒共20 μL，Lipofectamine 2000 100 μL，不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL，均勻混合后，室溫下靜置15 min。然后將質(zhì)粒、脂質(zhì)體混合物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，每孔300 μL，再將其放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)染組則加入等量的DMEM培養(yǎng)液，每組均重復(fù)3孔，并設(shè)置3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3.6 Western blotting實(shí)驗(yàn) 按照3.4與3.5步驟中所述各組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，將細(xì)胞于冰上放置30 min，12 000 ×g離心10 min。將30 mg總蛋白加入到10% 的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5% 脫脂奶粉封閉后，加入相應(yīng)的 I 抗(SENP3、Sp1和TERT)于4 ℃孵育過(guò)夜，然后加II抗室溫孵育1 h后，利用ECL液顯影，掃描儀成像。

3.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞(H2O2處理)，以1×106/L的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，按照3.4和3.5步驟中所述各組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每組均重復(fù)5個(gè)孔，并進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。分別于轉(zhuǎn)染后的24、48和72 h后向各孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄掉上清后加入150 μL的DMSO，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度(A)值。

3.8 TRAP-PCR法檢測(cè)端粒酶活性 按照3.4與3.5中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，分別收集細(xì)胞。嚴(yán)格按照TRAP-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。先提取細(xì)胞端粒酶，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，最后銀染，用Fragment Manager凝膠分析儀進(jìn)行分析。

3.9 PCR法測(cè)定端粒長(zhǎng)度 按照3.4與3.5所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總DNA，按照李杰華等[9]所述進(jìn)行操作。上游引物序列為5’-TTAGGG-3’，下游引物為5’-CCCTAA-3’。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 50 s， 55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)完后，向45 μL PCR產(chǎn)物中加入90 μL 無(wú)水乙醇，28 μL 乙酸銨，放于-20 ℃冰箱反應(yīng)20 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，去掉上清，加入50 μL TE緩沖液溶解沉淀，然后加入滅菌的雙蒸水到200 μL，最后于260 nm處測(cè)定紫外吸收值，進(jìn)行定量分析。

3.10 ELISA法檢測(cè)ALP和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的含量 ALP和OPN的檢測(cè)按照其相應(yīng)的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.11 放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)含量 按照3.4與3.5中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后收集各組細(xì)胞，按照[125I]OCN放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成骨細(xì)胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞，顯示細(xì)胞大多數(shù)呈梭形，有突起；ALP染色可見(jiàn)細(xì)胞中有灰黑色顆粒狀或塊狀沉淀，胞質(zhì)染色較為明顯，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Identification of osteoblasts (×200). A: the osteoblasts were observed under inverted microscope; B: the osteoblasts were identified using ALP staining.

圖1 成骨細(xì)胞的鑒定圖

2 H2O2處理成骨細(xì)胞后對(duì)SENP3和Sp1表達(dá)的影響

首先，我們用H2O2處理成骨細(xì)胞，利用Western blotting法檢測(cè)輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞中SENP3和Sp1的表達(dá)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較，H2O2處理后SENP3和Sp1的表達(dá)都顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)SENP3后對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染SENP3 24 h、48 h及72 h后，細(xì)胞活力顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)ALP、OCN和OPN含量的影響

與對(duì)照組相比較，過(guò)表達(dá)SENP3 48 h后，成骨細(xì)胞的ALP、OCN及OPN的含量顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The effect of H2O2on the protein expression of SENP3 and Sp1 in the osteoblasts determined by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖2 Western blotting法檢測(cè)H2O2對(duì)成骨細(xì)胞中SENP3和Sp1表達(dá)的影響

5 過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)Sp1和TERT表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比較，將過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.0-SENP3轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞后 Sp1和TERT的表達(dá)顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.The effect of overexpression of SENP3 on the viability of osteoblasts measured by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsblank control (BC).

圖3 MTT法測(cè)定過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

Figure 4.The effects of overexpression of SENP3 on the concentrations of ALP, OCN and OPN in the osteoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖4 過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)成骨細(xì)胞中ALP、OCN以及OPN含量的影響

Figure 5.The effects of overexpression of SENP3 on the expression of Sp1 and TERT in the osteoblasts determined by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖5 Western blotting法檢測(cè)成骨細(xì)胞過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)Sp1和TERT表達(dá)的影響

6 過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度的影響

與對(duì)照組相比較，過(guò)表達(dá)SENP3后端粒酶活性顯著上升(P<0.05)，為對(duì)照組的1.90倍；端粒長(zhǎng)度縮短顯著延緩(P<0.05)，為對(duì)照組的2.04倍，見(jiàn)圖6。

7 共轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1對(duì)成骨細(xì)胞的影響

為了研究SENP3是否是通過(guò)促進(jìn)Sp1的表達(dá)，進(jìn)而增加端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度，我們將pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1后，細(xì)胞活力變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,ALP、OCN及OPN的含量,Sp1與TERT的表達(dá),端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度也無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖7。

討 論

成骨能力下降而骨吸收加快是骨質(zhì)疏松的主要病理基礎(chǔ)，成骨細(xì)胞的增生和產(chǎn)生新生骨質(zhì)又是骨折愈合的基礎(chǔ)，因此，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，改善成骨細(xì)胞功能對(duì)治療骨質(zhì)疏松具有重要的意義[10-11]。

Figure 6.The effects of overexpression of SENP3 on the activity of telomerase and the length of telomere in the osteoblasts. A: the activity of telomerase was measured by TRAP-PCR; B: the length of telomere was measured by PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖6 成骨細(xì)胞過(guò)表達(dá)SENP3對(duì)端粒酶活性及端粒長(zhǎng)度的影響

Figure 7.siRNA-Sp1 (si-Sp1) reversed the effect of pcDNA3.0-SENP3 (pcDNA-SENP3) on the osteoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖7 siRNA-Sp1可反轉(zhuǎn)pcDNA3.0-SENP3對(duì)成骨細(xì)胞的作用

SENP3為SUMO化特異性蛋白酶家族成員之一，已有研究證明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SENP3的表達(dá)顯著上升[12]，而且與細(xì)胞增殖相關(guān)，如SENP3在氧化應(yīng)激狀態(tài)下不但可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和HeLa細(xì)胞增殖，而且還可以促進(jìn)前骨髓細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[13]；本文研究結(jié)果也表明，成骨細(xì)胞在輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SENP3的表達(dá)顯著升高，而且，過(guò)表達(dá)SENP3后可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活力，成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白ALP、OCN及OPN含量也顯著上升；而對(duì)照組細(xì)胞活性較小，可能因?yàn)槠浼?xì)胞分化程度較低，與前研究結(jié)果一致，如張永青[14]成功分離培養(yǎng)出1日齡大鼠的成骨細(xì)胞，經(jīng)不同濃度黃芪甲苷處理后，其可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而對(duì)照組則相對(duì)較低?？梢?jiàn)，SENP3可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮一定的作用。

衰老是骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)重要病因，而在這一過(guò)程中，常伴隨著端粒的丟失，端粒酶活性的下降，端粒酶活性卻主要依賴(lài)于TERT的表達(dá)水平。如Yudoh等[15]將人TERT基因轉(zhuǎn)染到人成骨細(xì)胞NHOst 54881中后可顯著增加端粒酶活性。芮鋼等[16]將hTERT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞中，能顯著增加成骨細(xì)胞的壽命，防治細(xì)胞老化并保持成骨細(xì)胞的功能特性。因此，對(duì)端粒酶活性的研究已成為抗骨質(zhì)疏松的熱點(diǎn)。Sp1是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，且研究證明Sp1參與調(diào)控了TERT的表達(dá)，如Sp1可增加皮膚角化細(xì)胞中hTERT的表達(dá)和端粒酶活性[8]；而在輕度的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SENP3又可促進(jìn)Sp1的表達(dá)[5-6]，本文研究結(jié)果也表明，H2O2處理成骨細(xì)胞后，過(guò)表達(dá)SENP3，Sp1的表達(dá)顯著上升，其次，端粒酶活性顯著增加及端粒長(zhǎng)度縮短延緩；而當(dāng)pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共同轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞后，結(jié)果顯示細(xì)胞活力、成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白含量、Sp1的表達(dá)以及端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度均未發(fā)生顯著變化，由此可見(jiàn)，SENP3可通過(guò)促進(jìn) Sp1的表達(dá)，進(jìn)而增加端粒酶活性，延緩端粒長(zhǎng)度的縮短。

綜上所述，本文在細(xì)胞水平上證明SENP3可通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中Sp1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而增加端粒酶活性，延緩端粒長(zhǎng)度的縮短，為預(yù)防老年性骨質(zhì)疏松提供了新的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)，然而，SENP3抗骨質(zhì)疏松的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of SENP3 on activity of telomerase and length of telomere of rat osteoblasts

SHI Su-qin1, PAN Yan1, YUE Xin1, ZHAO Lu2

(1TheFirstAffiliatedHospital,2PostdoctoralMobileStationofTraditionalChineseMedicine,PostdoctoralResearchandDevelopmentBaseoftheThirdAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China.E-mail:zhaolu.cn@163.com)

AIM: To analyze the effect of sentrin-specific protease 3 (SENP3) on the activity of telomerase and the length of telomere of rat osteoblasts. METHODS: The rat osteoblasts was treated with 0.2 mmol/L H2O2. The expression of SENP3 and specificity protein 1 (Sp1) was detected by Western blotting. The rat osteoblasts were transfected with pcDNA3.0-SENP3. The viability of the osteoblasts was evaluated by MTT assay. The concentrations of alkaline phosphatase (ALP) and osteopontin (OPN) were measured by ELISA. Osteocalcin (OCN) was measured by RIA. The expression of Sp1 and telomerase reverse transcriptase (TERT) were determined by Western blotting. The activity of telomerase was analyzed by PCR-TRAP method. The length of telomere was detected by PCR. pcDNA3.0-SENP3 and siRNA-Sp1 were co-transfected into osteoblasts, and the above indicators were measured. RESULTS: After the osteoblasts were treated with H2O2, the expression of SENP3 and Sp1 was significantly increased. After pcDNA3.0-SENP3 was transfected into the osteoblasts, the expression of Sp1 and TERT, the cell viability, and the concentrations of ALP, OCN and OPN were all dramatically increased. The activity of telomerase and the length of telomere were significantly enhanced. However, once pcDNA3.0-SENP3 and siRNA-Sp1 were co-transfected into the osteoblasts, no significantly change of above indicators was observed.CONCLUSION: SENP3 increases the expression of TERT through increasing the expression of Sp1, leading to the increase in the activity of telomerase and the length of telomere, finally enhances the viability of osteoblasts.

Sentrin-spectific protease 3; Specificity protein 1; Telomerase reverse transcriptase; Osteoblasts; Telomerase

1000- 4718(2016)11- 2043- 06

2016- 05- 07

2016- 08- 22

R681

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.021

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△通訊作者 Tel: 15829303233； E-mail: zhaolu.cn@163.com