穆 楊 綜述 周恩民 審校

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100)

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·專題綜述·

抗獨(dú)特型抗體研究進(jìn)展①

穆 楊 綜述 周恩民②審校

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100)

免疫系統(tǒng)是生物體體內(nèi)執(zhí)行免疫功能的組織系統(tǒng)，由免疫器官(組織)、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。機(jī)體的免疫功能包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩大部分，兩者相互獨(dú)立又緊密配合，發(fā)揮免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視等重要作用?？贵w是發(fā)揮體液免疫功能的最主要成分，是機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞增殖分化形成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)分子?？贵w分子的基本結(jié)構(gòu)由四條肽鏈組成，兩條相同的輕鏈(Light chain，L)和兩條相同的重鏈(Heavy chain，H)。通過(guò)對(duì)來(lái)自不同B細(xì)胞克隆的抗體分子的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其氨基端(N-端)的氨基酸組成及排列順序隨抗體的不同差異非常明顯，稱為可變區(qū)(Variable region,V區(qū))，組成抗體的抗原結(jié)合部位；其余部分的氨基酸序列則相對(duì)變化很小，稱為恒定區(qū)(Constant region,C區(qū))。

作為具有生物學(xué)功能的大分子蛋白質(zhì)，抗體既可以通過(guò)其抗原結(jié)合部位識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原，又能作為一種良好的抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。由于抗體產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)不同，因而不同抗體分子的抗原性存在差異，利用血清學(xué)方法可以測(cè)定和分析不同抗體分子的抗原性并將其進(jìn)行分類，稱之為抗體的血清型(免疫球蛋白的血清型)?？贵w的血清型可以分為同種型(Isotype)、同種異型(Allotype)和獨(dú)特型(Idiotype,Id)。

1 抗獨(dú)特型抗體與免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)

1.1 獨(dú)特型與抗獨(dú)特型抗體的概念 二十世紀(jì)中葉，人們發(fā)現(xiàn)將抗體注入同種或異種動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)抗體的抗血清。隨后發(fā)現(xiàn)在抗體分子上有兩類抗原決定簇，即同種型和同種異型。1955年Slater等[1]在研究兔抗人骨髓瘤蛋白抗血清的特異性時(shí)，發(fā)現(xiàn)抗某一些骨髓瘤蛋白的抗血清用無(wú)關(guān)的其他骨髓瘤蛋白或正常人Ig充分吸收后，仍然能與最初用作免疫原的那種骨髓瘤蛋白起反應(yīng)，他們把存在于抗體分子上這種新的抗原特異性稱為“個(gè)體”抗原特異性(Individual antigenic specificities)。

1963年Oudin等[2]用傷寒沙門氏菌免疫50只家兔，將其中一只家兔血清中分離的抗傷寒沙門氏菌抗體作為免疫原，免疫正常家兔，分離其血清得到抗抗體。研究發(fā)現(xiàn)，這種抗抗體只能與作為免疫原的抗傷寒沙門氏菌抗體發(fā)生反應(yīng)，不能與其余49只傷寒沙門氏菌免疫家兔的血清發(fā)生反應(yīng)，也不能與其他抗原免疫家兔血清或正常家兔血清發(fā)生反應(yīng)。表明這只家兔產(chǎn)生的抗傷寒沙門氏菌抗體具有特殊的抗原決定簇，它既不同于其他個(gè)體針對(duì)同一抗原產(chǎn)生的抗體分子上具有的抗原決定簇，也不同于同一個(gè)體針對(duì)不同抗原產(chǎn)生的抗體分子上的抗原決定簇，Oudin將這種不同于同種型和同種異型的抗原決定簇稱為獨(dú)特型。

獨(dú)特型(Idiotype,Id or Ab1)是存在于抗體分子上的獨(dú)特型抗原決定簇(Antigenic determinant，AD)的總稱，一個(gè)抗體分子上可以有多個(gè)獨(dú)特型抗原決定簇，獨(dú)特型反映了抗體分子的多樣性?？贵w分子上的獨(dú)特型抗原決定簇稱為獨(dú)特位(Idiotope)，可位于抗體分子 V 區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)，也可位于抗體分子V 區(qū)的骨架區(qū)(Framework region,FR)，獨(dú)特型抗原決定簇可以在異種、同種異體以及自身體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這種抗體被稱為抗獨(dú)特型抗體(Anti-idiotypic antibody,AId or Ab2)。獨(dú)特型和抗獨(dú)特型抗體可以形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在免疫調(diào)節(jié)中占有重要地位。

1.2 抗獨(dú)特型抗體的分類 對(duì)于AId的分類，目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)AId 與 Id 反應(yīng)的特點(diǎn)和AId 的功能，將AId分為Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2δ 四類。由于這種分類方法的試驗(yàn)依據(jù)充分，分類具體，與實(shí)際應(yīng)用聯(lián)系密切，因此這種分類法比較為廣大學(xué)者接受[3]。

1.2.1 Ab2α 由位于Ab1骨架區(qū)的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生，與Ab1的結(jié)合不影響抗原與Ab1的結(jié)合，屬于半抗原非抑制性的Ab2，Ab2α具有調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)或抑制Ab1克隆。

1.2.2 Ab2β 由位于Ab1抗原結(jié)合位的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抗原的內(nèi)影像作用，因?yàn)檫@類抗獨(dú)特型抗體在三維結(jié)構(gòu)上與抗原類似，Ab2β和Ab1的結(jié)合可以完全阻斷抗原與Ab1的結(jié)合， 這類抗獨(dú)特型抗體在實(shí)際應(yīng)用上具有重要意義。

1.2.3 Ab2γ 由靠近或位于抗原結(jié)合位的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生，與Ab1的結(jié)合可以抑制抗原與Ab1的結(jié)合，屬于半抗原非抑制性的Ab2，Ab2γ也具有調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)或抑制帶有相應(yīng)Id的細(xì)胞克隆增殖。

1.2.4 Ab2ε 由遠(yuǎn)離和位于抗原結(jié)合位的獨(dú)特位誘導(dǎo)產(chǎn)生，是一種雙特異性抗體， 既可和Ab1的抗原結(jié)合位結(jié)合，也可以和Ab1的Fc段結(jié)合，這種抗獨(dú)特型抗體對(duì)于自身免疫性疾病的研究可能具有意義。

以上4種抗獨(dú)特型抗體中，只有Ab2β能夠真正模擬原始抗原，可以被用作抗原的替代物，因此，Ab2β的鑒定在抗獨(dú)特型抗體的制備中十分重要。

1.3 免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō) 1974 年，瑞典免疫學(xué)家Jerne根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)對(duì)抗體分子獨(dú)特型的認(rèn)識(shí)，在Burnet[4]“克隆選擇學(xué)說(shuō)(Clonal selection theory)”的基礎(chǔ)上提出了著名的“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)(Immune network theory)”，用以闡明免疫系統(tǒng)內(nèi)部對(duì)免疫應(yīng)答的自我調(diào)節(jié)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)的各個(gè)細(xì)胞克隆，通過(guò)自我識(shí)別、相互刺激或相互制約構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。免疫系統(tǒng)內(nèi)所有抗體分子和淋巴細(xì)胞(T、B細(xì)胞)的抗原受體上都存在獨(dú)特型抗原決定簇，它能被體內(nèi)另一些淋巴細(xì)胞識(shí)別并產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。Id不同于一般的抗原，它具有自身免疫原性(Autoimmunogenicity)，當(dāng)外來(lái)抗原刺激機(jī)體發(fā)生應(yīng)答時(shí)，Id決定簇?cái)?shù)量增加，刺激產(chǎn)生 AId，進(jìn)而又刺激產(chǎn)生抗 AId 抗體。這種由 Id-AId 相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò) Id 和 AId 相互識(shí)別、相互刺激和制約，對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)。Jerne[5]的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)強(qiáng)調(diào)免疫系統(tǒng)是各個(gè)細(xì)胞克隆之間相互聯(lián)系、相互制約構(gòu)成的對(duì)立統(tǒng)一整體，它對(duì)免疫學(xué)理論研究以及在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用都具有重大意義。

獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)的形成與抗體具有雙重性質(zhì)密切相關(guān)，抗體既能通過(guò)其抗原結(jié)合位識(shí)別、結(jié)合抗原，也能通過(guò)其獨(dú)特型抗原決定簇刺激機(jī)體產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。參與網(wǎng)絡(luò)形成的細(xì)胞有 4 組，①抗原反應(yīng)細(xì)胞組(Antigen reaction cell，ARC)，指具有Id并識(shí)別抗原的淋巴細(xì)胞，即能與抗原結(jié)合并產(chǎn)生應(yīng)答的T、B細(xì)胞。以ARC為主體與另外3組淋巴細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。②抗獨(dú)特型細(xì)胞組，即識(shí)別ARC表面Id的淋巴細(xì)胞，可抑制ARC對(duì)外來(lái)抗原的反應(yīng)。③內(nèi)影像細(xì)胞組，即獨(dú)特型與外源性抗原的抗原決定簇相同的細(xì)胞，能被ARC識(shí)別，激發(fā)ARC的增殖。④非特異性平行細(xì)胞組，其抗原受體上的Id與ARC上的Id相同，故能被抗獨(dú)特型細(xì)胞識(shí)別，通過(guò)激發(fā)抗獨(dú)特型細(xì)胞增殖間接抑制ARC的增殖，加強(qiáng)對(duì)網(wǎng)絡(luò)的抑制作用(圖1)。

上述4組細(xì)胞中，ARC是網(wǎng)絡(luò)中第一層次的細(xì)胞，內(nèi)影像組對(duì)ARC起促進(jìn)作用，抗獨(dú)特型組對(duì)ARC起抑制性調(diào)節(jié)作用，非特異性平行組可加強(qiáng)抗獨(dú)特型組對(duì)ARC的抑制性調(diào)節(jié)作用。這4組細(xì)胞在體內(nèi)構(gòu)成一個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，對(duì)ARC具有調(diào)節(jié)作用的其他3組細(xì)胞中的每一組細(xì)胞，都可以作為針對(duì)特異性抗原的ARC，與另外的3組細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。

在正常生理情況下，獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)處在一個(gè)抑制性穩(wěn)定狀態(tài)。其中，刺激效應(yīng)所需要的抗體濃度高于抑制效應(yīng)所需的抗體濃度，這種刺激與抑制的相互調(diào)節(jié)使免疫網(wǎng)絡(luò)處于相對(duì)平衡狀態(tài)。外來(lái)抗原進(jìn)入機(jī)體后，打破了各組之間保持的抑制性平衡狀態(tài)，從而引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

2 抗獨(dú)特型抗體的制備與鑒定

2.1 抗獨(dú)特型抗體的制備 由于 Ab2β 具有抗原的內(nèi)影像作用，Ab2β和Ab1的結(jié)合可以完全阻斷抗原與Ab1的結(jié)合，因此Ab2β不管是在科研還是臨床上都有廣泛的應(yīng)用。常用的制備AId的方法有多克隆AId技術(shù)、單克隆AId技術(shù)和抗體庫(kù)技術(shù)。

圖1 Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)示意圖Fig.1 Diagram of Jerne′s immune network theory

2.1.1 多克隆AId技術(shù) 通過(guò)多克隆技術(shù)制備AId又稱為一步免疫法或自身抗體產(chǎn)生法。根據(jù)Jerne[5]的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體后，隨著抗體獨(dú)特型抗原決定簇?cái)?shù)量的增加，該抗體的獨(dú)特型抗原決定簇又能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗抗體，因此，應(yīng)用抗原一步免疫就能制得AId。采用這種方法制備AId較為簡(jiǎn)單，但AId含量低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AId僅占抗血清免疫球蛋白的10%[6]。各次制備的AId間的免疫化學(xué)性質(zhì)沒(méi)有均一性，后期的純化工作也比較繁瑣；而且必須具備檢測(cè)AId的手段，如利用純化的受體檢測(cè)其配體的AId，或者利用已有的Ab1檢測(cè)AId。若不具備檢測(cè)AId的方法，就需要分別制備Ab1和AId。

2.1.2 單克隆AId技術(shù) 即雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，也就是先用抗原免疫動(dòng)物，并采用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗原的單克隆抗體Ab1，然后用純化的Ab1或 Ab1的Fab或F(ab′)2免疫動(dòng)物再制備AId。如果選擇BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物，在免疫結(jié)束后可以取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，制備單克隆的AId。雖然這種方法前期工作比較繁瑣，費(fèi)用也高，但一旦獲得AId，就可以隨時(shí)獲得足夠量的AId，所以具有更高的實(shí)用性。

采用單克隆抗體技術(shù)制備AId，免疫用初始抗原的特異性和純度要高[7]，免疫原可以用純化的多克隆抗體、單克隆抗體、Fab或F(ab′)2 等。由于抗體分子包括 Fab和 Fc，而獨(dú)特型抗原決定簇是由抗體分子的可變區(qū)特別是高變區(qū)的氨基酸組成、排列等決定的，可變區(qū)的分子質(zhì)量相對(duì)恒定區(qū)的要小得多，其免疫原性遠(yuǎn)不能與Fc段的抗原決定簇相比，因此多數(shù)報(bào)道制備AId用的免疫原都是純化的Fab或F (ab′)2[8-13]。根據(jù)抗體的不同特性可以選擇胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶解抗體制備Fab或F(ab′)2。Dainiak等[14]報(bào)道，木瓜蛋白酶水解 IgG 時(shí)可能會(huì)破壞 Fab上的結(jié)合位點(diǎn)，胃蛋白酶作用的溶液 pH較低，容易引起抗體變性。無(wú)花果蛋白酶(Ficin)是榕屬植物樹(shù)膠中有蛋白水解酶活性的組分，它可以催化多種反應(yīng)，有很廣的 pH 工作范圍，在酶切過(guò)程中，pH 可選擇在能夠保持酶和抗體活性的范圍。研究表明，無(wú)花果蛋白酶用于制備抗體片段較已被廣泛采用的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶具有產(chǎn)率高、用時(shí)短及活性好的優(yōu)點(diǎn)，而且能從鼠 IgG1 抗體得到較高產(chǎn)量的 F (ab′)2[15,16]。

由于獨(dú)特型抗原決定簇具有自身免疫原性，可誘導(dǎo)自體、同系、同種異體及異種動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此在制備AId時(shí)可根據(jù)不同情況選用同系、同種異體或異種動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一步免疫法制備AId，實(shí)際上就是在自體體內(nèi)產(chǎn)生AId；采用兩步法制備AId時(shí)，若選擇同系動(dòng)物，獲得的抗體就是AId；若選擇同種異體動(dòng)物，則免疫血清中除了AId，還含有抗同種異型抗原決定簇的抗體。若選擇異種動(dòng)物，則免疫血清中除了AId，還含有抗異種抗原決定簇的抗體。

2.1.3 抗體庫(kù)技術(shù) 所謂抗體庫(kù)技術(shù)(Antibody library)就是采用基因克隆技術(shù)克隆某種動(dòng)物全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后重組到特定的表達(dá)載體中，再利用大腸桿菌或噬菌體以表達(dá)有功能的抗體分子片段，并通過(guò)親和篩選獲得特異性抗體可變區(qū)基因的技術(shù)。從構(gòu)建的抗體庫(kù)中篩選高親和力的抗體，同時(shí)還能找到編碼此抗體的基因。由于該技術(shù)通量高、操作性強(qiáng)、可控性好、路線多樣、已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)抗體藥物最具發(fā)展活力的領(lǐng)域[17,18]?？贵w庫(kù)技術(shù)經(jīng)歷了組合抗體庫(kù)、噬菌體展示抗體庫(kù)、核糖體展示抗體庫(kù)等發(fā)展階段。所謂組合抗體庫(kù)是指先、后分別將編碼抗體重鏈和輕鏈的基因隨機(jī)克隆到同一噬菌體中并以工程菌表達(dá)出抗體活性片段[19]。組合抗體庫(kù)出現(xiàn)后不久就被噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)取代，后者是在噬菌體表面展示(Phage display)技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來(lái)的[20,21]。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是將抗體基因插入噬菌體膜蛋白基因Ⅲ或基因Ⅷ的信號(hào)肽編碼區(qū)下游，使其以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白Ⅲ或Ⅷ的 N 端。噬菌體抗體庫(kù)以噬菌體和細(xì)菌為對(duì)象，易操作、成本較低，已成為迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體庫(kù)技術(shù)[22]。Tornetta等[23]利用噬菌體展示技術(shù)獲得了可用于臨床免疫應(yīng)答檢測(cè)的人免疫球蛋白的AId，他們的研究表明，競(jìng)爭(zhēng)篩選是從噬菌體抗體庫(kù)中獲得用于藥代動(dòng)力學(xué)和免疫應(yīng)答檢測(cè)的抗獨(dú)特性抗體的有效方法。Kabir等[24]對(duì)篩選方法進(jìn)行改進(jìn)，利用消減篩選法(Subtractive panning)制備了HM-1 致死毒素的抗獨(dú)特型抗體，結(jié)果利用改進(jìn)的方法獲得的抗獨(dú)特型單鏈抗體(Single chain fragment variable,scFv)比用普通方法篩選的scFv具有更好的結(jié)合活性和殺細(xì)胞活性。

核糖體展示技術(shù)由Pluckthun等[25]在多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)，是一種利用功能性蛋白相互作用進(jìn)行篩選的新技術(shù)，其原理是通過(guò) PCR 擴(kuò)增目的基因的DNA 文庫(kù)，同時(shí)加入啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)，并置于具有耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄翻譯的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中孵育，使目的基因的翻譯產(chǎn)物呈現(xiàn)在核糖體表面，形成“mRNA-蛋白質(zhì)-核糖體”三元復(fù)合體，最后通過(guò)常規(guī)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，如固相化的靶分子直接從三元復(fù)合體中篩選出感興趣的核糖體復(fù)合體，再利用RT-PCR 擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)過(guò)程，最終篩選出高親和力的目標(biāo)分子[26-28]。由于該技術(shù)沒(méi)有細(xì)胞轉(zhuǎn)化的步驟，構(gòu)建的庫(kù)容量可以很大，最高可達(dá)1×1015，而且在每一輪篩選后的擴(kuò)增中可以方便地引入突變，從而促進(jìn)抗體分子進(jìn)化與親和力成熟[29,30]。目前，核糖體展示技術(shù)在單鏈抗體的構(gòu)建及應(yīng)用方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有用來(lái)制備抗獨(dú)特型抗體的報(bào)道。

2.2 抗獨(dú)特型抗體的鑒定 人們對(duì)抗獨(dú)特型抗體的最大興趣在于它能模擬外來(lái)抗原的某些功能，因此利用抗獨(dú)特型抗體作為工具可以研究某些疾病的發(fā)病機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)機(jī)理、生產(chǎn)疫苗等。抗獨(dú)特型抗體鑒定包括免疫學(xué)鑒定和生物學(xué)鑒定兩方面。

2.2.1 免疫學(xué)鑒定 抗獨(dú)特型抗體要能作為抗原的“內(nèi)影像”，在免疫學(xué)方面應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①能夠與相應(yīng)的Ab1結(jié)合；②具有與始動(dòng)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab1的能力；③能夠抑制 Ab1與始動(dòng)抗原的結(jié)合或與Ab1結(jié)合的能力，能被始動(dòng)抗原抑制。免疫學(xué)鑒定常用的有以下幾種方法。

2.2.1.1 ELISA技術(shù) 通常用純化的Ab1包被ELISA 板，封閉后加入Ab2，37℃ 孵育后，加入酶標(biāo)二抗，作用后加入底物顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，同時(shí)以正常小鼠 IgG和 PBS 為對(duì)照，結(jié)果應(yīng)該是Ab2與 Ab1 的反應(yīng)呈陽(yáng)性而與正常小鼠 IgG 反應(yīng)呈陰性。

2.2.1.2 中和試驗(yàn) 中和試驗(yàn)是將待檢的融合細(xì)胞上清液先與不同稀釋度的Ab1 在37℃ 作用1 h，然后加入到用不同稀釋度Ab1 包被的酶標(biāo)板中，ELISA 法測(cè)吸光度值。若吸光度值隨Ab1 稀釋度的增加而增加，而正常小鼠血清IgG對(duì)照無(wú)此現(xiàn)象，就可以判定抗獨(dú)特型抗體陽(yáng)性。

2.2.1.3 競(jìng)爭(zhēng)抑制法 抗原抗體結(jié)合抑制試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗獨(dú)特型抗體時(shí)鑒定Ab2β的方法，這種方法是根據(jù)針對(duì)Ab1抗原結(jié)合部位獨(dú)特型的Ab2β可以抑制該Ab1與抗原結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。一般多采用兔多克隆抗體包被，加入AId及AId 與初始抗原混合物以及純化的初始抗原，同時(shí)用融合小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，用無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，再加入酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體作用，加入底物顯色后測(cè)定吸光度值。如果隨著初始抗原濃度的升高，吸光度值隨之降低，說(shuō)明初始抗原和AId間存在競(jìng)爭(zhēng)，就可以證明AId 具有模擬抗原結(jié)合位點(diǎn)的特性。

2.2.2 生物學(xué)鑒定 進(jìn)行生物學(xué)鑒定時(shí)需要用AId免疫BALB/c小鼠，然后在不同時(shí)間采血分離血清或按照單克隆抗體的制備程序生產(chǎn)腹水，然后采用間接 ELISA法檢測(cè)血清或腹水中有無(wú)針對(duì)抗原的抗體產(chǎn)生，以確定抗獨(dú)特型抗體能否模擬抗原的特性。

3 抗獨(dú)特型抗體的應(yīng)用

根據(jù)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，作為“內(nèi)影像”的抗獨(dú)特型抗體在結(jié)構(gòu)和功能上能模擬相應(yīng)抗原，在一定程度上替代原始抗原，因此可以將抗獨(dú)特型抗體作為抗原的替代物用于免疫學(xué)研究及基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究，而且在傳染性疾病的防治機(jī)理研究和惡性腫瘤的治療等應(yīng)用研究中也取得了重大進(jìn)展。

3.1 受體尋找 病毒受體指位于宿主細(xì)胞表面能夠被病毒吸附蛋白識(shí)別并與之結(jié)合，從而引起病毒感染的分子復(fù)合物，大多數(shù)屬于蛋白質(zhì)。病毒受體是公認(rèn)的引發(fā)病毒感染宿主細(xì)胞的主要決定因素，也是影響病毒宿主特異性和組織親嗜性的決定因素之一[31]。根據(jù)Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，作為抗原“內(nèi)影像”的抗獨(dú)特型抗體在結(jié)構(gòu)和功能上能模擬相應(yīng)的外來(lái)抗原，因此就能用于模擬病毒來(lái)尋找細(xì)胞受體蛋白[32]。通常，要選擇病毒的中和抗體制備抗獨(dú)特型抗體，這樣獲得的抗獨(dú)特型抗體才能很好地模擬病毒抗原。

Co等[33]制備了識(shí)別呼腸孤病毒3型HA中和表位單克隆抗體9BG5的抗獨(dú)特型抗體87.92.6，利用此AId通過(guò)免疫共沉淀分離到67 ku的哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒3型的細(xì)胞表面受體，進(jìn)一步研究確定此受體表達(dá)于小鼠、大鼠、猴和人的細(xì)胞，與細(xì)胞的正常功能有關(guān)。Hanham等[34]用狂犬病病毒(Rab-ies virus,RV)免疫小鼠，篩選到具有中和效應(yīng)的單抗細(xì)胞株7.12(IgG2α)，然后用單抗7.12的Fab免疫小鼠獲得了單克隆抗獨(dú)特型抗體B9，根據(jù)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，通過(guò)B9證實(shí)乙酰膽堿受體是狂犬病病毒感染細(xì)胞的受體。Wang等[35]制備了針對(duì)辛德華斯病毒(Sindbis virus)E2糖蛋白的具有中和效應(yīng)的單克隆抗體的兔多克隆抗獨(dú)特型抗體，熒光抗體染色顯示其中一株多克隆抗體可以與雞的細(xì)胞膜結(jié)合，通過(guò)標(biāo)記的病毒和空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)(Plaque reduction assay)均發(fā)現(xiàn)，這株多克隆抗獨(dú)特型抗體能部分阻止病毒與這些細(xì)胞的結(jié)合。利用此多克隆抗獨(dú)特型抗體，他們通過(guò)免疫共沉淀從雞細(xì)胞上鑒定出一個(gè)63 ku的辛德華斯病毒受體。Varthakavi等[36]用具有中和效應(yīng)的針對(duì)牛皰疹病毒(Bovine herpesvirus 1,BHV-1)gB蛋白的Mab83制備了抗獨(dú)特型抗體anti-83，然后用此AId通過(guò)放射免疫沉淀分析(Radioimmuoprecipitation analysis,RIPA)從MDBK細(xì)胞上鑒定出一個(gè)56 ku的BHV-1的受體，AId與此蛋白的結(jié)合能被放射標(biāo)記的膜蛋白阻斷，病毒覆蓋蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，35S標(biāo)記的BHV-1病毒粒子也能與從MDBK細(xì)胞上純化的此56 ku的膜蛋白結(jié)合，而且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，純化的此蛋白能抑制生物素化的BHV-1的吸附，表明通過(guò)抗獨(dú)特性抗體鑒定的56 ku蛋白是BHV-1的受體。繼Jiang等[37]發(fā)現(xiàn)豬(10/12)感染PRRSV產(chǎn)生了針對(duì)GP5蛋白單抗和多抗的特異性抗獨(dú)特型抗體后，Zhou等[38]發(fā)現(xiàn)，豬感染PRRSV后不僅產(chǎn)生了抗GP5抗體的AId，也產(chǎn)生了抗M蛋白抗體的AId (38/47)，而且血清中至少有兩種AId，病毒荷載豬從感染后49 d(DPI)檢測(cè)到AId，其峰值出現(xiàn)在77 DPI，而非病毒荷載豬感染后21 d就可檢測(cè)到AId，其峰值出現(xiàn)在35 DPI，這兩種AId具有不同的獨(dú)特型結(jié)合特性，但均具有抗原“內(nèi)影像”的特性，可以識(shí)別豬抗PRRSV GP5和M蛋白及鼠抗PRRSV GP5和M蛋白抗體上的共有獨(dú)特位(Common idiotopes)。他們用通過(guò)SDS-PAGE從PRRSV中純化的GP5免疫BALB/c小鼠，采集小鼠血清純化獲得IgG再免疫同系BALB/c小鼠，然后采用雜交瘤技術(shù)獲得了6株具有Ab2β活性的抗GP5抗體的AId，其中的一株(Mab2-5G2)可以抑制GP5抗體與GP5的結(jié)合，GP5也可以抑制Mab2-5G2與GP5抗體的結(jié)合。而且，Mab2-5G2可以模擬GP5結(jié)合MA-104和PAM上一個(gè)約230 ku 的可溶性蛋白，由此推測(cè)此230 ku的可溶性蛋白可能是PRRSV感染細(xì)胞的一種新受體[13]。

3.2 受體拮抗劑 受體拮抗劑指能與受體結(jié)合，但不具備內(nèi)在活性的一類物質(zhì)，也指與受體有較強(qiáng)的親和力而無(wú)內(nèi)在活性的藥物。傳統(tǒng)的生長(zhǎng)激素受體(Growth hormone receptor,GHR)拮抗劑主要分為兩類，生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH)類似物和抗生長(zhǎng)激素受體抗體，Lan等[39]獲得了pGH的抗獨(dú)特型抗體——CG-86，通過(guò)一系列的試驗(yàn)證實(shí)CG-86具有拮抗GHR的作用，提示抗獨(dú)特型抗體可以代表一種制備GHR拮抗劑的新策略并應(yīng)用于其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子拮抗劑的研究。

3.3 診斷試劑 抗原是臨床免疫學(xué)診斷中最為關(guān)鍵的試劑之一，但由于某些天然抗原的自然含量極少，或者純化抗原極其困難，或者抗原本身具有危險(xiǎn)性等種種原因，從而難以獲得必要的天然抗原。用抗獨(dú)特型抗體替代這些抗原作為診斷試劑，不僅可以克服這些困難，而且具有重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可以標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。

Zhou等[40]用針對(duì)藍(lán)舌病病毒VP7的3種單克隆抗體免疫兔子獲得了能識(shí)別單抗共有獨(dú)特位(Common idiotopes)的抗獨(dú)特型抗體RAb2s。研究表明，RAb2s可以從功能上模擬VP7，用RAb2s采用間接 ELISA 法檢測(cè)血清中各種藍(lán)舌病病毒抗體，可區(qū)別于鹿流行性腹瀉病毒抗體，具有特異性和可行性。日本血吸蟲(chóng)單克隆抗獨(dú)特型抗體NP30 為腸相關(guān)抗原(Gut associated antigens,GAA)的內(nèi)影像，與可溶性蟲(chóng)卵抗原(Soluble egg antigen,SEA )有部分交叉反應(yīng)，具有模擬抗原的作用，可替代蟲(chóng)源性抗原用于血清學(xué)診斷[41]。用模擬 HBV表面抗原的 AId 建立的檢測(cè)抗-HBs抗體的方法不僅具有良好的敏感性和特異性，而且安全、簡(jiǎn)便，試劑來(lái)源豐富，在疾病診斷上已顯示出與原抗原相似的敏感性和特異性[42]。宋其芳等[43]以玉米赤霉烯酮-BSA(ZEN- BSA)為包被原， ZEN 單抗(1G4) 為反應(yīng)抗體，用 ZEN 抗獨(dú)特型單抗1D5(Ab2β-1D5)作為標(biāo)準(zhǔn)品替代物建立了 ZEN 無(wú)毒 ELISA 定量檢測(cè)技術(shù)，方法重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，與 ZEN 類似毒素幾乎無(wú)交叉反應(yīng)。用抗獨(dú)特型單抗代替毒素標(biāo)準(zhǔn)品，不僅可以減少對(duì)環(huán)境及操作人員的危害，還可以降低因使用毒素標(biāo)準(zhǔn)品的成本。

納米抗體(Nanobody,Nb)因具有容易表達(dá)、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好等優(yōu)點(diǎn)而在基礎(chǔ)研究、新藥開(kāi)發(fā)和疾病診斷與治療上受到越來(lái)越多的關(guān)注。伏馬菌素B1(Fumonisin B1,FB1)是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物，主要污染糧食及其制品，并對(duì)某些家畜產(chǎn)生急性毒性及潛在致癌性，已成為繼黃曲霉毒素之后的又一研究熱點(diǎn)。Shu等[44]利用針對(duì)FB1的Ab2β型抗獨(dú)特型納米抗體建立了一種靈敏、環(huán)保的免疫檢測(cè)方法(Nb-ELISA)，與用半抗原-載體結(jié)合物包被的檢測(cè)FB1的商品化ELISA試劑盒相比，Nb-ELISA的靈敏度提高了20倍，但用抗獨(dú)特型納米抗體作為包被原不僅簡(jiǎn)單成本低，而且無(wú)毒素產(chǎn)品。橘霉素(Citrinin,CIT)是一種真菌毒素，主要發(fā)現(xiàn)于谷物和使動(dòng)物發(fā)生腎中毒的飼料中。Xu等[45]從天然的羊駝重鏈單域抗體庫(kù)中篩選到可以替代CIT的β型抗獨(dú)特型抗體β-AI VHH，利用β-AI VHH建立的檢測(cè)CIT的V-ELISA比用CIT-OVA作為包被原的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ic-ELISA)的靈敏度高。

3.4 抗獨(dú)特型疫苗 抗獨(dú)特型抗體中的Ab2β可以作為抗原的“內(nèi)影像”替代病原體的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答，用這種抗獨(dú)特型抗體作為疫苗用于疾病的防治即抗獨(dú)特型疫苗(anti-idiotype vaccine)，又稱內(nèi)影像疫苗?？躬?dú)特型疫苗是免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)發(fā)展到新階段的產(chǎn)物，無(wú)論抗原是細(xì)菌、病毒還是寄生蟲(chóng)，或是蛋白質(zhì)還是多糖，都可用其“內(nèi)影像”抗體來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。目前，已有許多用抗獨(dú)特型抗體制備的實(shí)驗(yàn)室疫苗接種動(dòng)物后能使免疫動(dòng)物抵抗病原體的感染。新疆農(nóng)科院研制的牛布魯菌抗獨(dú)特型疫苗、中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)和北京卓越海洋生物科技有限公司共同研發(fā)的海水魚(yú)類細(xì)菌病多聯(lián)抗獨(dú)特型疫苗、雞傳染性喉氣管炎、雞傳染性法氏囊病、禽流感、豬繁殖與呼吸綜合征抗獨(dú)特型疫苗均已有報(bào)道，這些獸醫(yī)領(lǐng)域的抗獨(dú)特型疫苗的制備為研制新型動(dòng)物疫苗、藥物及免疫檢測(cè)試劑提供了新思路。

朱瑞良等[46]用提純的IBDV IgG免疫BALB/c小鼠，獲得了能分泌抗IBDV獨(dú)特型抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用此獨(dú)特型抗體制成的IBD獨(dú)特型疫苗免疫SPF雞和普通京白公雞，可以使免疫雞100%抵抗野毒的攻擊。針對(duì)致病型朊蛋白(Pathological isoform of the prion protein,PrPSc)特異性單克隆抗體V5B2的抗獨(dú)特型抗體可以從結(jié)構(gòu)和功能上模擬朊蛋白的抗原表位，該結(jié)果為朊病毒病的試驗(yàn)研究提供了一個(gè)可行的方法[47]。

對(duì)抗獨(dú)特型腫瘤疫苗的研究已逐漸成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)，基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使抗獨(dú)特型腫瘤疫苗在腫瘤免疫治療和預(yù)防中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，無(wú)論是最初的鼠源性Ab2β，還是Ab2β的ScFv疫苗以及與 DC、細(xì)胞因子等聯(lián)合制成的疫苗，抗獨(dú)特型抗體的功能在不斷得到改進(jìn)和完善，在大多數(shù)動(dòng)物試驗(yàn)研究中都能誘導(dǎo)出抗腫瘤的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，在臨床試驗(yàn)中也取得了較好的療效[48]。

用抗原“內(nèi)影像”抗獨(dú)特型抗體制成疫苗替代腫瘤抗原，打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫抑制狀態(tài)，在腫瘤的免疫治療中具有重要意義。用Ab2β模擬腫瘤相關(guān)抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，已在許多動(dòng)物試驗(yàn)中得到證實(shí)。目前已經(jīng)制備出模擬 B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞性白血病、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、胰腺癌等人類惡性腫瘤相關(guān)抗原的 Ab2β，部分抗獨(dú)特型腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床研究，用于治療一些晚期腫瘤病人并取得了一定療效[49]。王甲甲等[50]應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建融合表達(dá)模擬鼻咽癌相關(guān)抗原的 Ab2β基因 G22-I50的原核表達(dá)載體并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的活性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)復(fù)性后的蛋白具有模擬原始抗原的活性，并且能夠刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖，其研究結(jié)果為雙價(jià)抗獨(dú)特型疫苗 G22-I50用于臨床對(duì)鼻咽癌進(jìn)行主動(dòng)免疫治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。P3是一種可以與只表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的含神經(jīng)氨酸的神經(jīng)節(jié)苷脂(Gangliosides)或硫苷脂(Sulfatides)和其他一些抗原反應(yīng)的單克隆抗體，Racotumomab(1E10)是P3的抗獨(dú)特型單克隆抗體，以Racotumomab制備的全球首個(gè)抗獨(dú)特型抗體肺癌疫苗的第三階段臨床試驗(yàn)已于2011年在新加坡啟動(dòng)，全世界超過(guò)40個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)約1 000名患者參與這項(xiàng)試驗(yàn)。第一階段和第二階段的研究顯示這種抗獨(dú)特型抗體肺癌疫苗能延長(zhǎng)患者的存活率[51,52]。

3.5 其他 筆者所在的實(shí)驗(yàn)室對(duì)PRRSV GP5蛋白的抗獨(dú)特型抗體Mab2-5G2進(jìn)行了廣泛的比較研究，除了通過(guò)Mab2-5G2確定MA-104和PAM上一個(gè)約230 ku 的可溶性蛋白可能是PRRSV感染細(xì)胞的一種新受體外[13]，我們還發(fā)現(xiàn)給免疫了PRRSV 弱毒疫苗CH-1R的PRRSV陰性仔豬注射Mab2-5G2，仔豬產(chǎn)生高水平的抗N 蛋白抗體、IL-2和IL-4，但中和抗體滴度很低，當(dāng)用PRRSV HuN4攻毒后，仔豬出現(xiàn)肺損傷、胸腺嚴(yán)重萎縮、IL-4分泌下降和顯著的病毒血癥等明顯的臨床癥狀，提示當(dāng)豬只出現(xiàn)抗PRRSV GP5的抗獨(dú)特型抗體時(shí)，不推薦使用CH-1R弱毒疫苗，否則會(huì)導(dǎo)致豬出現(xiàn)肺炎和胸腺萎縮等[53]。利用慢病毒載體系統(tǒng)在PRRSV的敏感細(xì)胞Marc-145細(xì)胞中表達(dá)Mab2-5G2的單鏈抗體，可以通過(guò)抑制病毒蛋白合成和子代病毒的產(chǎn)生顯著降低PRRSV的感染與復(fù)制，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種抑制作用是通過(guò)改變病毒與細(xì)胞的結(jié)合及增加IFN-α的水平造成的[54]。

4 存在的問(wèn)題與展望

自1974年Jerne提出免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)以來(lái)，抗獨(dú)特型抗體不僅對(duì)于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的理論研究具有重要意義，而且在傳染性疾病的預(yù)防、診斷和惡性腫瘤的治療等應(yīng)用研究中也顯示出重要的價(jià)值，特別是在疾病的防治和診斷上，有可能解決多年累積的難以解決的問(wèn)題，尤其是當(dāng)抗原為非肽類或抗原成分未知時(shí)，抗獨(dú)特型抗體技術(shù)比基因工程和合成肽技術(shù)有更明顯的優(yōu)勢(shì)。但是抗獨(dú)特型抗體的研究歷史畢竟較短，目前仍然存在諸多問(wèn)題，例如，內(nèi)影像結(jié)構(gòu)不一定與抗原活性中心結(jié)構(gòu)完全一致造成的親和力和專一性改變，制備與篩選的困難性，作為疫苗時(shí)免疫原性弱等等，這些問(wèn)題都需要長(zhǎng)時(shí)間的研究探索才能得到解決。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，抗獨(dú)特型抗體將在更多疾病的預(yù)防和治療上得到更為廣泛的應(yīng)用。

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[收稿2015-12-02]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.027

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31201883)、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(31430084)、陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2014K01-22-01)。

穆 楊(1974年-)，女，博士，副教授，主要從事重大動(dòng)物疫病發(fā)病與免疫機(jī)制研究。

R392.1

A

1000-484X(2016)11-1691-08

②通訊作者，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn。