胡倩倩 孫 銳 嚴 浩 李 盛

(江漢大學附屬醫(yī)院婦產科，武漢430015)

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MiR-634 通過mTOR通路抑制宮頸癌細胞c4-1、caski增殖并促進其凋亡的研究

胡倩倩 孫 銳①嚴 浩②李 盛

(江漢大學附屬醫(yī)院婦產科，武漢430015)

目的：探討MiR-634 通過mTOR通路抑制宮頸癌細胞c4-1、caski增殖并促進其凋亡的相關機制。方法：選取30例宮頸癌組織標本和宮頸癌細胞c4-1、caski作為研究對象，分析正常組織和宮頸癌組織的MiR-634和mTOR表達，MiR-634對宮頸癌細胞mTOR的表達水平以及對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。結果：宮頸癌組織MiR-634相對表達水平顯著低于正常組織(P<0.05)，宮頸癌組織mTOR相對表達水平顯著高于正常組織(P<0.05)，宮頸癌組織mTOR的IS得分顯著高于正常組織(P<0.05)；過表達MiR-634顯著降低mTOR的RNA和蛋白表達水平(P<0.05)，抑制MiR-634的表達顯著提高mTOR的RNA和蛋白表達水平(P<0.05)；過表達MiR-634顯著降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)，抑制MiR-634的表達顯著提高細胞的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)；抑制mTOR的表達均顯著降低細胞的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)。結論：MiR-634通過抑制mTOR的表達來抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，是宮頸癌基因靶向治療的潛在靶點。

小分子RNA；宮頸癌；MiR-634；mTOR通路；增殖；凋亡

目前，在世界范圍內，宮頸癌已經成為僅次于乳腺癌的導致女性死亡的第二大癌癥，每年約有500 000例宮頸癌被確診，近45%導致死亡[1，2]。近年來，癌癥的靶向治療廣受關注，而miRNA由于其功能既影響癌基因，又影響抑癌基因，已經成為研究的熱點[3]。相關研究證實宮頸癌伴有異常的miRNA表達，提示miRNA可能參與宮頸癌的發(fā)生過程[4,5]。為了探討MiR-634 通過mTOR通路抑制宮頸癌細胞c4-1、caski增殖并促進其凋亡的相關機制，我院對30例宮頸癌組織標本，宮頸癌細胞株(c4-1、caski)中的MiR-634 和mTOR表達情況及對癌細胞的增殖影響進行研究，現將相關內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 我院手術切除的30例宮頸癌組織標本，分別制作宮頸癌組和正常組織切片用于試驗，所有宮頸癌組織經診斷確診為鱗狀細胞癌Ⅲ期。宮頸癌細胞株c4-1、caski 購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海)。DMEM、DMEM/F-12、McCoy′s 5a、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(美國Gibco公司)；RIPA裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、CCK-8細胞增殖和活性檢測kit(北京康為世紀生物科技有限公司)；Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；陽離子脂質體2000試劑(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA)。本研究經醫(yī)院倫理委員會研究后通過，所有患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 載體構建 設計Pri-MiR-634的引物，并進行聚合酶鏈式反應擴增，然后克隆到pcDNA3載體的相應限制性內切酶位點上，并測序已證實載體構建成功，同時構建MiR-634的反義寡核苷酸載體ASO-MiR-634。通過退火反應獲得兩條70 bp的mTOR序列，用于構建Sir-MTOR載體。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 在37℃，體積分數為5%的CO2、飽和濕度條件下采用含體積分數為10%的小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)宮頸癌細胞株c4-1和caski， 每周換液2次，取指數生長期細胞進行實驗。宮頸癌細胞株(c4-1、caski)接種到6孔培養(yǎng)板中并生長過夜。然后加入構建好的載體(5 μg Pri-MiR-634或500 μg ASO-MiR-634)，pcDN-A3質粒和ASO-NC用于陰性對照。用陽離子脂質體2000試劑(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA)，根據試劑說明書進行轉染操作。5 h后將培養(yǎng)基置換為新培養(yǎng)基，轉染后24 h后，檢測細胞活力、細胞集落形成能力和體外遷移能力。

1.2.3 Western blot檢測 Western blot用于確定mTOR蛋白的表達。所得蛋白質用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠變性后轉移到PVDF膜上，在封閉緩沖液中溫育80 min，室溫下，與MTOR或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的抗體與過夜。用辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(AuGCT公司，中國北京)將膜洗滌和溫育。用增強化學發(fā)光和暴露于化學發(fā)光膜進行評估蛋白質表達，實驗室工作圖像采集和分析軟件(UVP)用于定量帶強度。

1.2.4 RT-PCR分析 各目的基因 mRNA轉錄水平的改變：Trizol 法提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄PCR， 最后進行實時定量PCR反應。 實時定量 PCR反應條件為： 50℃，2 min，95℃，2 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃，1 min，40個循環(huán)。

1.2.5 細胞存活和CCK-8法檢測細胞增殖檢測 選取對數生長的宮頸癌細胞株(c4-1、caski)，胰酶消化后吸取10 μl接種于96孔板中，調整細胞密度使每孔中細胞數約為5 000個(每組設3個復孔)，過夜孵化，然后加入不同的最終濃度的新鮮化療藥物，如順鉑或吉西他濱(Sigma公司，美國)，孵育48 h后，于正常培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2 h。向每孔加入10 μl CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%，A(加藥)：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞孔的吸光度；A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度，重復3次[6]。

1.2.6 細胞遷移和侵襲測定 將特定濃度的宮頸癌細胞株(c4-1、caski)的200 ml RPMI1640(不含FBS)培養(yǎng)基接種到Transwell小室的上室，侵襲實驗則將宮頸癌細胞株接種到涂布有50 ml 2 mg/ml的基質膠生長因子的Transwell小室的上室，下室加入500 ml的RPMI1640含有20%FBS的培養(yǎng)基，孵育幾個數小時后，用15 min 2%的結晶紫溶液對膜進行染色，并放置在載玻片上，在光學顯微鏡下對5個隨機視野進行計數，重復3次。

1.2.7 免疫組化 免疫組化用于宮頸正常組織和宮頸癌組織的mTOR表達水平的分析，所有標本均為10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片處理后，進行讀片，根據切片中上皮細胞的免疫組織化學著色深淺的比例分為弱陽性、陽性以及強陽性，分別記1分、2分、3分。樣本中mTOR陽性表達細胞所占總細胞的比例分為5級：<5%(0分)，5%～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)和>75%(4分)。免疫反應得分(Immunoreactivity Score ，IS)，IS=樣本著色程度得分×陽性細胞比例得分。

2 結果

2.1 MiR-634和mTOR在宮頸癌組織中的表達 宮頸癌組織MiR-634相對表達水平顯著低于正常組織，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，宮頸癌組織mTOR相對表達水平顯著高于正常組織，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，宮頸癌組織mTOR的IS得分顯著高于正常組織，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1、2。

2.2 MiR-634對宮頸癌細胞mTOR的表達水平的影響 在宮頸癌c4-1和caski細胞株中，過表達MiR-634均顯著降低mTOR的RNA和蛋白表達水平，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，通過反義寡核苷酸技術抑制MiR-634的表達均顯著提高mTOR的RNA和蛋白表達水平，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖3，表1。

圖1 正常宮頸組織和宮頸癌組織MiR-634和mTOR的RNA表達水平和IS得分比較Fig.1 Comparisons of RNA expression levels and IS score of MiR-634 and mTOR in normal cervical tissue and cervical cancer tissueNote: A.Comparison of expression levels of MiR-634 in normal cervical tissue and cervical cancer tissue;B.Comparison of RNA expression levels of mTOR in normal cervical tissue and cervical cancer tissue;C.Comparison of IS score of mTOR in normal cervical tissue and cervical cancer tissue.

2.3 MiR-634對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響 在宮頸癌c4-1和caski細胞株中，過表達MiR-634均顯著降低細胞的增殖、遷移和侵襲，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，通過反義寡核苷酸技術抑制MiR-634的表達均顯著提高細胞的增殖、遷移和侵襲，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

2.4 mTOR對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響 在宮頸癌c4-1和caski細胞株中，通過RNAi技術抑制mTOR的表達均顯著降低細胞的增殖、遷移和侵襲，數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

圖2 正常宮頸組織和宮頸癌組織mTOR表達情況Fig.2 mTOR expression of normal cervical tissue and cervical cancerNote: A.mTOR expression of normal cervical tissue;B.mTOR expression of cervical cancer.

圖3 過表達MiR-634降低mTOR蛋白表達水平Fig.3 Overexpression of MiR-634 reduced mTOR protein expression levels

表1 MiR-634對宮頸癌細胞mTOR的表達水平的影響

Tab.1 MiR-634 affect expression levels of mTOR in cancer cells

VectorMiR?634c4?1caskimRNAmTORc4?1caskimTORproteinc4?1caskipcDNA3678±112732±162225±065229±172215±075223±102Pri?MiR?634812±1721)1034±1871)167±0451)089±0231)068±0231)078±0251)ASO?NC521±078602±101378±112224±078201±058201±089ASO?MiR?634178±0432)188±0782)432±1822)402±0982)403±0892)409±0732)

Note：Compared with pcDNA3 group,1)P<0.05;compared with ASO-NC group，2)P<0.05.

表2 MiR-634對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響

Tab.2 MiR-634 impact on cervical cancer cell proliferation,migration and invasion

VectorCellactivityc4?1caskiMigrationcellnumber/HPc4?1caskiInvasivecellnumber/HPc4?1caskipcDNA3132±045141±084588±169579±2071558±4321218±372Pri?MiR?634087±0651)093±0831)234±1871)205±621)769±1721)778±2621)ASO?NC102±035108±023224±89558±118475±152832±179ASO?MiR?634178±0782)178±0562)612±1792)765±2632)873±1822)1631±4882)

Note：Compared with pcDNA3 group,1)P<0.05;compared with ASO-NC group,2)P<0.05.

表3 mTOR對宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響

Tab.3 mTOR impact on cervical cancer cell proliferation,migration and invasion

VectorCellactivityc4?1caskiMigrationcellnumber/HPc4?1caskiInvasivecellnumber/HPc4?1caskisiR?Ctr148±067168±084987±2731613±5631883±5322142±492siR?MiR?634073±0321)079±0371)502±1821)982±2911)634±2831)883±2321)

Note：Compared with siR-Ctr group,1)P<0.05.

3 討論

小分子RNA(miRNA)是一組內源的、保守的、非編碼小RNA，具有基因表達后轉錄調控功能，如對進行mRNA切割或翻譯抑制。目前研究發(fā)現小分子RNA調控的蛋白質編碼基因參與多種生物過程，如細胞生長、分化、發(fā)育和凋亡[7]。目前，研究確定多種miRNA參與調控腫瘤轉移[8,9]。如MiR-634能夠誘導乳腺上皮細胞從上皮至間質的轉移，從而促進癌癥的侵襲性和轉移[10]。mTOR是雷帕霉素或西羅莫司靶蛋白，屬于一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在正常細胞的生長增殖中起著極其重要的作用，而且與癌細胞的生長、增殖、分化、凋亡、代謝密切相關，在多種惡性腫瘤中起著關鍵的調控作用[11,12]。

本研究主要關注MiR-634在宮頸癌細胞中的表達和其靶基因調控機制。本研究通過定量RT-PCR和免疫組化技術檢查發(fā)現宮頸癌組織中的MiR-634的表達下調，而mTOR表達上調，推測MiR-634可能作為宮頸癌的抑制基因。通過構建過表達載體轉染宮頸癌細胞后發(fā)現，過表達MiR-634能夠明顯抑制宮頸癌細胞的mTOR的RNA和蛋白表達水平，而宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲能力也受到明顯抑制，因此，推斷MiR-634可能在子宮頸癌生長抑制因子，而可能機制是通過抑制mTOR的表達。進一步研究發(fā)現，通過RNAi技術抑制宮頸癌細胞的mTOR的表達，能夠顯著降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這提示 mTOR信號通路在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中起著重要的調控作用。相關研究也發(fā)現MiR-634在多種人類癌癥組織中表達下調[13]，如MiR-634在食管鱗狀細胞癌的抑制mTOR的表達和誘導細胞凋亡，并直接作用于成纖維細胞生長因子受體3，抑制非小細胞肺癌的生長，最近的研究表明，MiR-634能夠抑制腫瘤生長，并增強紫杉醇敏感性[14,15]。

綜上所述，MiR-634通過抑制mTOR的表達來抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，是宮頸癌基因靶向治療的潛在靶點。

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[收稿2015-12-17 修回2016-04-25]

(編輯 張曉舟)

Study of MiR-634 inhibited proliferation and promote apoptosis of cervical cancer cells c4-1 and caski by mTOR pathway

HU Qian-Qian,SUN Rui,YAN Hao,LI Sheng.

Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430015,China

Objective:To investigate the mechanisms of miR-634 inhibited proliferation and promote apoptosis of cervical cancer cells c4-1 and caski by mTOR pathway.Methods: 30 cases of cervical tissue and cervical cancer cell c4-1 and caski were selected to study,MiR-634 and mTOR expression of normal tissue and cancer tissue were analyzed,and MiR-634 expression level of mTOR in cervical cancer cells as well as cancer cell proliferation,migration and invasion.Results: The relative expression level of MiR-634 in cervical tissue was significantly lower than that in normal tissues (P<0.05),relative expression level of mTOR in cervical cancer was significantly higher than that in normal tissues (P<0.05),the IS score of mTOR in cervical cancer was significantly higher than that of normal tissues (P<0.05);overexpression of MiR-634 significantly reduced RNA and protein expression levels of mTOR (P<0.05),the inhibition of the expression of MiR-634 significantly increased RNA and protein expression levels of mTOR (P<0.05);overexpression of MiR-634 significantly reduced proliferation,migration and invasion of the cancer cells (P<0.05),the inhibition of the expression of MiR-634 significantly increased proliferation,migration and invasion of the cancer cells (P<0.05);inhibition of the expression of mTOR significantly decreased proliferation,migration and invasion of the cancer cells(P<0.05).Conclusion: MiR-634 inhibited proliferation,migration and invasion of cancer cells by inhibiting the expression of mTOR,and it is a potential target for cancer gene targeted therapy.

Small molecule RNA;Cervical cancer;MiR-634;mTOR pathway;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.010

胡倩倩(1980年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事臨床婦產科相關工作，E-mail：huqianqian442@163.com。

及指導教師：李 盛(1975年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤方面的研究，E-mail：lisheng197433@163.com。

R363.1

A

1000-484X(2016)11-1610-05

①華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，武漢430030。

②湖北省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，武漢430079。