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(江門(mén)市皮膚醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 江門(mén) 529000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

梅毒螺旋體膜脂蛋白Tp0821促炎活性研究

吳志周，文美貞，柯建良，祝新，譚雪玲

(江門(mén)市皮膚醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 江門(mén) 529000)

目的探討梅毒螺旋體(Tp)膜脂蛋白Tp0821潛在的促炎活性及可能參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法表達(dá)重組蛋白Tp0821(rTp0821)，去除其中內(nèi)毒素。rTp0821刺激THP-1細(xì)胞，ELISA檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的表達(dá)水平；ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特異性抑制劑分別預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min，再以rTp0821刺激THP-1細(xì)胞，ELISA分別檢測(cè)IL-6、IL-8和IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果rTp0821刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8和IL-1β在一定范圍內(nèi)與刺激時(shí)間以及蛋白濃度呈正相關(guān)，1.0 μg/mL刺激24 h時(shí)各細(xì)胞因子表達(dá)水平最高；rTp0821刺激經(jīng)ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特異性抑制劑預(yù)處理后的THP-1細(xì)胞，IL-6表達(dá)水平分別下降63.4%(P<0.001)、4.3%(P>0.05)、53.4%(P<0.001)和73.1%(P<0.0001)，IL-8分別下降49.2%(P<0.001)、6.0%(P>0.05)、41.1%(P<0.001)和71.0%(P<0.001)，IL-1β分別下降36.8%(P<0.01)、3.9%(P>0.05)、30.3%(P<0.001)和59.7%(P<0.001)。結(jié)論rTp0821可通過(guò)ERK1/2、p38和NF-κB通路誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β，Tp0821可能是Tp重要的致病因子。

梅毒螺旋體； 膜脂蛋白； Tp0821； 促炎細(xì)胞因子； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)引起的一種性傳播疾病。近年來(lái)梅毒發(fā)病率居高不下，全球每年大約新發(fā)1 200萬(wàn)梅毒病例，已經(jīng)成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。Tp不能在體外培養(yǎng)的特性嚴(yán)重限制了其致病分子和致病機(jī)制研究[2]。目前的研究表明，Tp膜脂蛋白引起的炎癥可能是介導(dǎo)Tp感染后機(jī)體病理?yè)p傷的主要原因[3]。

同其他膜脂蛋白一樣[4]，Tp0821膜脂蛋白具有良好的免疫原性和抗原性[5]，但其是否還具有促炎活性以及是否參與介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)尚不明確。本研究旨在探討Tp0821潛在的促炎活性以及可能參與活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為闡明Tp致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株以及人單核細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)均由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所饋贈(zèng)。BamHI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，Ni-NTA親和層析純化試劑盒、Detoxi-Gel TM內(nèi)毒素去除膠、T4連接酶、胎牛血清以及Anti-His單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，HRP-羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，ECL蛋白印跡法檢測(cè)試劑盒、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。從南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院和廣東省江門(mén)市皮膚醫(yī)院收集60份梅毒患者血清和40份正常血清。梅毒患者血清由臨床診斷確診(RPR和TPPA血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性、特異的臨床癥狀以及不潔性接觸史)。

1.2方法

1.2.1 重組Tp0821(rTp0821)的表達(dá)、純化與鑒定

從GenBank中獲取tp0821基因序列，設(shè)計(jì)引物(上海英濰捷基公司合成)。上游引物為F5′-CGCGGATCCATGAAAGGAAAAACGGTGAG-3′，下劃線(xiàn)為BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物為R5′-CCGCTCGAGCTACAAAGCAGGCGCCACC-3′，下劃線(xiàn)為XhoI酶切位點(diǎn)。以Tp Nichols株DNA為模板，PCR擴(kuò)增tp0821基因，構(gòu)建pET28a(+)/Tp0821重組質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，0.1 mmol/L IPTG于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，Ni-NTA親和層析法純化Tp0821。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)rTp0821濃度，Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠去除其中的內(nèi)毒素，鱟試劑盒檢測(cè)其中內(nèi)毒素含量。以Anti-His單抗為一抗，以羊抗鼠為二抗，Western blot鑒定rTp0821。

1.2.2 rTp0821促炎作用測(cè)定 THP-1細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱以含10% FBS、100 U/mL青霉素G、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細(xì)胞布滿(mǎn)整個(gè)視野時(shí)離心，棄去培養(yǎng)基后以無(wú)菌PBS漂洗，分裝，然后加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為測(cè)定不同濃度對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，分別以含0.5、1.0、3.0和5.0 μg/mL的rTp0821預(yù)處理THP-1細(xì)胞。為檢測(cè)rTp0821在不同時(shí)間對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，用1.0 μg/mL rTp0821刺激THP-1細(xì)胞6、12、24和48 h。各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(100 ng/mL LPS)、陰性對(duì)照(PBS)和空白對(duì)照(僅加入培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個(gè)平行孔。PBS沖洗上述THP-1細(xì)胞3次后以0.1% Triton X-100處理30 min，離心收集上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定其中IL-6、IL-8和IL-1β濃度。

1.2.3 rTp0821促炎作用的相關(guān)信號(hào)通路測(cè)定 為探討MAPK與NF-κB是否參與Tp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子，分別以ERK1/2特異性抑制劑PD98059、JNK特異性抑制劑SP600125、p38特異性抑制劑SB203580和NF-κB的特異抑制劑BAY11-7082預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min，rTp0821刺激THP-1細(xì)胞24 h后，ELISA檢測(cè)其分泌IL-6、IL-8和IL-1β濃度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rTp0821的表達(dá)、純化與鑒定tp0821基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳顯示在800 bp左右大小處存在一條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期片段的大小(807 bp)相符。測(cè)序結(jié)果與GenBank公布結(jié)果完全一致。pET-28a/Tp0821在E.coli BL21表達(dá)34 kD大小的蛋白，與預(yù)期蛋白分子量一致(圖2)。Western blot鑒定結(jié)果顯示其與His單抗和梅毒血清反應(yīng)(圖3)，表明該蛋白為T(mén)p0821。

2.2 rTp0821刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8和IL-1β rTp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在一定范圍內(nèi)與刺激時(shí)間和蛋白濃度呈正相關(guān)：低于1 μg/mL時(shí)，IL-6、IL-8和IL-1β的水平隨刺激蛋白濃度增加而增加，1 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值，分別為166.0±16.9 pg/mL、145.3±10.7 pg/mL和118.2±16.3 pg/mL(圖4A)，隨后隨濃度增加而表達(dá)下降；1 μg/mL rTp0821刺激THP-1細(xì)胞時(shí)，IL-6、IL-8和IL-1β表達(dá)水平在24 h內(nèi)隨刺激時(shí)間增加而增加，24 h時(shí)均達(dá)到峰值，分別為177.8±8.8 pg/mL、147.4±7.6 pg/mL和118.3±7.0 pg/mL(圖4B)，隨后隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)下降。

圖1 pET-28a/Tp0821菌液PCR鑒定 M：DNA marker;1，2：pET-28a/Tp0821重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 rTp0821的純化 M：Protein marker；1：流出液；2～7：不同咪唑濃度洗脫液洗脫的rTp0821

圖3 rTp0821 Western blot鑒定 C：對(duì)照正常人血清；1：Anti-His 單抗；2：梅毒患者血清

2.3 PD98059、SP600125、SB203580和BAY11-7082抑制rTp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8和IL-1β rTp0821刺激經(jīng)PD98059、SP600125、SB203580以及BAY11-7082預(yù)處理后的THP-1細(xì)胞，IL-6表達(dá)水平分別下降63.4%(P<0.001)、4.3%(P>0.05)、53.4%(P<0.001)和73.1%(P<0.0001)，IL-8分別下降49.2%(P<0.001)、6.0%(P>0.05)、41.1%(P<0.001)和71.0%(P<0.001)，IL-1β分別下降36.8%(P<0.01)、3.9%(P>0.05)、30.3%(P<0.001)和59.7%(P<0.001)(圖5)。以上表明PD98059、SB203580和BAY11-7082能顯著抑制rTp0821刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β，JNK特異性抑制劑SP600125則無(wú)明顯影響。

圖4 不同濃度rTp821 (A)和不同刺激時(shí)間(B)對(duì)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子的影響 PBS為陰性對(duì)照，LPS為陽(yáng)性對(duì)照

圖5 MAPK和NF-κB特異抑制劑對(duì)rTp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子的影響 與對(duì)照組比較，*:P<0.05；**:P<0.01，***:P<0.001，****:P<0.0001

3 討 論

前期研究表明，Tp膜脂蛋白Tp0663[6]和Tp0751[3]均可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子，與Tp致炎有關(guān)。Tp0821也是一種膜脂蛋白，但是否具有促炎活性尚不明確。本研究選擇THP-1細(xì)胞作為模式細(xì)胞主要是由于THP-1細(xì)胞比小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)刺激物更敏感，也更接近人體細(xì)胞的生理狀態(tài)，而且其作為巨噬細(xì)胞的前體，在抵抗感染的過(guò)程中起著不可替代的作用。IL-6、IL-8和IL-1β是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與介導(dǎo)機(jī)體的免疫調(diào)控。本研究結(jié)果表明Tp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子水平在一定范圍內(nèi)與蛋白濃度和刺激時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)1.0 μg/mL Tp0821刺激THP-1細(xì)胞24 h時(shí)，促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平達(dá)到峰值。這可能是由于過(guò)高濃度Tp0821和過(guò)長(zhǎng)刺激時(shí)間會(huì)干擾THP-1細(xì)胞正常生物學(xué)功能，進(jìn)而影響促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。

MAPK由ERK1/2、JNK和p38等構(gòu)成，是多種病原體活化單核/巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2特異性抑制劑PD98059和p38異性抑制劑SB203580能抑制rTp0821誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子，但JNK抑制劑SP600125預(yù)處理THP-1細(xì)胞后對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)卻沒(méi)有明顯影響。這表明，ERK1/2和p38可能參與Tp0821介導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子。

NF-κB是一種早期轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種促炎細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[9]。靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB通過(guò)與IκB結(jié)合成無(wú)活性的異二聚體而存在于胞漿[10-11]。當(dāng)受到外來(lái)刺激時(shí)，IκB磷酸化后降解，游離的NF-κB隨后轉(zhuǎn)位至胞核與特異序列結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB特異性抑制劑BAY 11-7082預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min后，促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯受到抑制，表明NF-κB可能參與rTp0821介導(dǎo)THP-1細(xì)胞所致炎癥反應(yīng)。

綜上，本研究初步表明ERK1/2、p38和NF-κB參與rTp0821介導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子，Tp0821可能為T(mén)p潛在致病因子。

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ProinflammatoryEffectofTreponemaPallidumMembraneLipoproteinTp0821

WU Zhizhou,WEN Meizhen,KE Jianliang,et al
(DepartmentofClinicalLaboratory,JiangmenDermatologyHospital,Jiangmen,Guangdong529000,China)

ObjectiveTo investigate the proinflammatory effect ofTreponemapallidummembrane lipoprotein Tp0821 and related signal transduction pathways and provide experimental basis for the clarification of pathogenesis mechanisms of T.pallidum.MethodsThe recombinant protein Tp0821 (rTp0821) was expressed and the endotoxin in rTp0821 was removed.ELISA was used to detect the expression of proinflammatory cytokines IL-6,IL-8,and IL-1β of human THP-1 cells stimulated with rTp0821.Furthermore,rTp0821 was used to stimulate human THP-1 cells pretreated with the ERK1/2 inhibitor PD98059,p38 inhibitor SB203580,and NF-κB inhibitor BAY11-7082,respectively,and then ELISA was performed for detection of the expression level of proinflammatory cytokines.ResultsrTp0821 possesses the ability to induce THP-1 cells to secret IL-6,IL-8,and IL-1β in dose- and time-dependent manners.The expression level of proinflammatory cytokines peaked when THP-1 cells were stimulated with 1.0 μg/mL of rTp0821 for 24 hours.Moreover,when pretreated with PD98059,SP600125,SB203580,and BAY11-7082,respectively,THP-1 cells decreases expression of IL-6 by 63.4% (P<0.001),4.3% (P>0.05),53.4% (P<0.001),and 73.1% (P<0.0001),IL-8 by 49.2% (P<0.001)、6.0% (P>0.05)、41.1% (P<0.001),and 71.0% (P<0.001),IL-1β by 36.8% (P<0.01),3.9% (P>0.05),30.3% (P<0.001),and 59.7% (P<0.001),respectively.ConclusionThese data indicate that the rTp0821 may activate the THP-1 cells to produce the proinflammatory cytokines via ERK1/2,P38,and NF-κB signal transduction pathways and membrane lipoprotein Tp0821 might be an important pathogenic factor.

Treponemapallidum; membrane lipoprotein; Tp0821; proinflammatory cytokines; signal transduction pathways

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.008

2016-07-03；

2016-08-28

R377.1

A

蔣湘蓮)