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(1.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院科教科，廣東 深圳 518081；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院部)

·文獻(xiàn)綜述·

BCR-ABL融合基因在慢性粒細(xì)胞白血病臨床診治中的研究進(jìn)展

蔣明1，陳文聰2，鄭多2

(1.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院科教科，廣東 深圳 518081；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院部)

BCR-ABL融合基因是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的特征性標(biāo)志，根據(jù)BCR的斷裂位置主要分為3個(gè)類型：M-BCR、m-BCR及μ-BCR。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)BCR-ABL融合基因的表達(dá)、突變對(duì)于CML的臨床診斷、治療以及預(yù)后都具有非常重要的意義。

慢性粒細(xì)胞白血??； BCR-ABL融合基因； 分子生物學(xué)技術(shù)

慢性粒細(xì)胞白血病CML(chronic myeloid leukemia，CML)是由于造血干細(xì)胞的惡性克隆而引起的疾病，在白血病病例中占15%～20%[1-2]。CML的主要特征是在外周血、脾以及骨髓中的未成熟或者成熟的髓細(xì)胞增多，并且細(xì)胞中帶有異常的染色體Ph(Philadelphia Chromosome)。Ph染色體是由位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的白血病原癌基因ABL易位至第22號(hào)染色體BCR基因的斷裂點(diǎn)形成的[3-5]，在分子水平上產(chǎn)生了BCR-ABL融合基因，導(dǎo)致持續(xù)且異?；罨睦野彼峒っ?，干擾細(xì)胞的正常增殖和凋亡程序，導(dǎo)致白血病的發(fā)生[6-7]。

以往臨床使用細(xì)胞遺傳學(xué)的方法以及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)檢測(cè)Ph染色體用于診斷CML的金標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行療效的監(jiān)測(cè)。隨著對(duì)BCR-ABL融合基因的不斷研究，對(duì)酪氨酸激酶的功能了解越來(lái)越深入。目前對(duì)CML患者的治療，已從傳統(tǒng)的姑息性治療、化療，發(fā)展到使用特異的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)進(jìn)行分子靶向治療[8]。經(jīng)過(guò)TKI治療后，可以達(dá)到完全的細(xì)胞遺傳學(xué)的緩解(complete cytogenetic remission，CCR)，即Ph陽(yáng)性的細(xì)胞消失，患者體內(nèi)可能只存在微小殘留病灶[9]，但是以往的細(xì)胞遺傳學(xué)等技術(shù)存在弊端，無(wú)法對(duì)白血病患者的微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)進(jìn)行檢測(cè)[10-11]。因此對(duì)CML的診斷、監(jiān)測(cè)等就有了更高靈敏度、準(zhǔn)確度的要求。此外，在致病和病情演變過(guò)程中，BCR-ABL融合基因會(huì)出現(xiàn)多樣性以及多變性。隨著TKI臨床應(yīng)用的增加，分子靶向治療的耐藥問(wèn)題開(kāi)始出現(xiàn)，導(dǎo)致藥物治療無(wú)法達(dá)到預(yù)定的效果，給疾病的治療帶來(lái)了新的阻礙[12-13]。應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)手段，對(duì)BCR-ABL融合基因及其突變進(jìn)行全面檢測(cè)，對(duì)于CML的診斷、治療以及預(yù)后都具有重要的意義。

1 BCR-ABL融合基因

BCR-ABL融合基因根據(jù)BCR的斷裂位置，主要分為3個(gè)類型：M-BCR、m-BCR及μ-BCR(圖1)[14]。M-BCR區(qū)，是位于外顯子b1～b5之間5.8 kb的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄成b2a2(e13a2)或b3a2(e14a2)型的mRNA，編碼p210蛋白；m-BCR區(qū)，是位于外顯子e2′和e2之間的54.4kb的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄成e1a2型的mRNA，編碼p190蛋白；μ-BCR區(qū)，位于外顯子19下游，轉(zhuǎn)錄成e19a2型的mRNA，編碼p230蛋白[15-17]。

在BCR-ABL融合基因中，主要是由ABL段攜帶細(xì)胞惡變的主要信息，而B(niǎo)CR段的斷裂位點(diǎn)主要影響疾病的表型。p210蛋白可見(jiàn)于90%以上的CML患者以及1/3的Ph陽(yáng)性的成人前體B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(precursor B-acute lymphoblastic leukemia，BALL)患者；p190蛋白可見(jiàn)于2/3的BALL患者、3%的非典型CML和慢性粒細(xì)胞單核細(xì)胞白血病(chronic myelo-monocytic leukemia，CMML)患者；而p230蛋白主要見(jiàn)于Ph陽(yáng)性的慢性中性粒細(xì)胞白血病(chronic neutrophilic leukemia，CNL)患者[18]。

圖1 BCR和ABL基因以及它們主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu) 箭頭表示BCR和ABL基因的斷點(diǎn)

因此，對(duì)BCR-ABL融合基因的分型檢測(cè)有助于了解疾病的表型。

2 BCR-ABL融合基因在CML診斷的作用

Ph染色體是臨床診斷CML的重要依據(jù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)的技術(shù)，需要制備骨髓染色體標(biāo)本，再利用R顯帶的技術(shù)進(jìn)行染色體核型的分析。其檢測(cè)結(jié)果直觀，靈敏度可以達(dá)到5%[19]。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法優(yōu)勢(shì)在于可檢測(cè)到其他的染色體異常，但無(wú)法對(duì)白血病患者的MRD進(jìn)行檢測(cè)。此外，細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的另一個(gè)限制在于，需要進(jìn)行骨髓穿刺活檢來(lái)獲得可培養(yǎng)的中期細(xì)胞，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求也較高。利用BCR和ABL的DNA探針的熒光原位雜交(FISH)的方法也常用來(lái)進(jìn)行CML的監(jiān)測(cè)。但FISH實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，若標(biāo)本處理不當(dāng)則難以檢出，因而作為臨床常規(guī)的監(jiān)測(cè)CML的手段也并不適合。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)BCR-ABL融合基因在逐漸普及[20-21]。使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，不僅可以檢測(cè)BCR-ABL融合基因，確定融合基因的確切斷裂位點(diǎn)，而且對(duì)MRD的檢測(cè)也具有高度的敏感性。因此PCR被作為臨床診斷、監(jiān)測(cè)CML的重要手段。PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，對(duì)BCR-ABL融合基因的mRNA檢測(cè)在不斷改進(jìn)，已經(jīng)從定性發(fā)展到定量檢測(cè)，從反轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)展到一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量法，使得檢測(cè)結(jié)果更加的可靠、直觀，而且便于分析。在熒光定量的檢測(cè)中，采用TaqMan MGB探針的方法，可以避免傳統(tǒng)的TaqMan探針產(chǎn)生的本底熒光對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，且快速、高靈敏，無(wú)需PCR后處理，因此被廣泛地應(yīng)用于臨床檢測(cè)。尤其是引入內(nèi)參基因，可以降低儀器、試劑、工作人員的操作以及樣本中細(xì)胞數(shù)量差異等因素對(duì)定量結(jié)果的影響，在MRD監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用，也為臨床治療提供了可靠的依據(jù)。

目前采用RQ-PCR的方法來(lái)檢測(cè)BCR-ABL融合基因，已經(jīng)成為檢測(cè)患者是否還殘留有MRD或是否已經(jīng)治愈的重要手段[22]。在對(duì)患者進(jìn)行BCR-ABL融合基因的RNA檢測(cè)時(shí)，樣本可以采用外周血，或者進(jìn)行骨髓抽樣[23]。在BCR-ABL融合基因水平較低時(shí)，兩種樣本中的BCR-ABL定量檢測(cè)的結(jié)果差異很小，但在CML急變期，有時(shí)骨髓標(biāo)本中的BCR-ABL融合基因水平顯著高于外周血。但考慮到外周血標(biāo)本能夠明顯地反映臨床治療的療效，并且標(biāo)本也容易采集，在慢性期，可常規(guī)采用外周血來(lái)進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。目前普遍認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)是，對(duì)患者進(jìn)行臨床診斷或經(jīng)過(guò)治療達(dá)到完全的細(xì)胞遺傳學(xué)的緩解后，會(huì)每三個(gè)月進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)性的檢測(cè)，從而可以對(duì)患者的臨床病情變化提出警示。定期檢測(cè)對(duì)于腫瘤微小殘留病灶的監(jiān)測(cè)和治療方案的及時(shí)調(diào)整都有重要意義[24]。

因此，采用RQ-PCR的方法來(lái)檢測(cè)BCR-ABL融合基因快速、靈敏高，是臨床診斷CML、監(jiān)測(cè)CML微小病灶的重要手段之一。

3 BCR-ABL融合基因與CML治療及預(yù)后的關(guān)系

BCR-ABL融合基因引起了持續(xù)活化的酪氨酸激酶，使用特異的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)進(jìn)行分子靶向治療，極大地改善了CML疾病的預(yù)后[2,25]。BCR-ABL的表達(dá)水平與臨床療效之間有著很好的相關(guān)性。RQ-PCR方法可以在TKI治療的前三個(gè)月便檢測(cè)出病變的明顯變化，可以以此作為病患后期治療的依據(jù)。通常認(rèn)為，在達(dá)到完全的細(xì)胞遺傳學(xué)緩解時(shí)，BCR-ABL定量檢測(cè)的結(jié)果應(yīng)較治療前下降3個(gè)對(duì)數(shù)值以上。

甲磺酸伊馬替尼(別名：格列衛(wèi)，imatinib)，是第一個(gè)分子靶向藥物，它是ATP的模擬物，較ATP有更強(qiáng)的親和力，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與BCR-ABL酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻止ATP的結(jié)合與水解，從而阻斷BCR-ABL磷酸化，使其失活，進(jìn)而阻斷其活化的信號(hào)傳導(dǎo)通路[9,26]。甲磺酸伊馬替尼并不能根治CML，它是通過(guò)抑制BCR-ABL融合蛋白的激酶活性來(lái)發(fā)揮作用的，本身并不能抑制融合蛋白形成，因此在停藥后疾病易復(fù)發(fā)。部分病人可對(duì)甲磺酸伊馬替尼產(chǎn)生耐藥性，主要表現(xiàn)為治療無(wú)效(原發(fā)或內(nèi)源性耐藥)，或緩解后的復(fù)發(fā)(繼發(fā)性耐藥)。

第二代酪氨酸激酶抑制劑，如達(dá)沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)等，能夠克服甲磺酸伊馬替尼耐藥的大部分突變[27-29]。當(dāng)然第二代酪氨酸激酶抑制劑的使用也要根據(jù)患者的實(shí)際情況，當(dāng)患者帶有Y253H、E255K/V或者F359C/V突變時(shí)最好使用達(dá)沙替尼，而帶有V299L和F317L突變時(shí)，則最好使用尼洛替尼[30]。

而當(dāng)患者產(chǎn)生甲磺酸伊馬替尼耐藥，而又不具有達(dá)沙替尼、尼洛替尼的相應(yīng)適用突變時(shí)，可以考慮使用第三代酪氨酸激酶抑制劑如伯舒替尼(bosutinib)[31-32]。當(dāng)患者產(chǎn)生T315I突變的情況下，應(yīng)考慮使用帕納替尼(Ponatinib)[33]。帕納替尼也是第三代酪氨酸激酶抑制劑，而T315I突變患者對(duì)于目前已有的其他酪氨酸激酶抑制劑均耐藥。

患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑抵抗的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：1)BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶區(qū)發(fā)生突變，使藥物結(jié)合位點(diǎn)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物不能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合BCR-ABL；2)由于BCR-ABL擴(kuò)增或過(guò)度的表達(dá)，超過(guò)了藥物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力；3)其他基因異常導(dǎo)致耐藥，因而CML克隆的增生不完全依賴BCR-ABL，如多藥耐藥蛋白(multi-drug resistance protein，MRP-1)的表達(dá)等[34-36]?；颊吣退幙赡苡缮鲜鲆环N或多種的機(jī)制協(xié)同導(dǎo)致，但研究表明，約80%的耐藥是由于融合蛋白ABL激酶區(qū)的突變引起的。ABL激酶區(qū)突變主要集中于ATP的結(jié)合區(qū)(P環(huán)，第244～255氨基酸)、T315、M351及活化區(qū)(A環(huán))四個(gè)區(qū)域，不同的突變位點(diǎn)引起的耐藥程度不同[37]。

對(duì)于BCR-ABL融合基因突變的檢測(cè)，目前多采用測(cè)序的方法進(jìn)行。測(cè)序方法可以檢測(cè)各種可能出現(xiàn)的突變類型，但其檢測(cè)的靈敏度只有20%～25%。用位點(diǎn)特異性PCR的方法進(jìn)行突變檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1‰～1%，但只能檢測(cè)出特定位點(diǎn)的突變[38]。因?yàn)槊總€(gè)不同的突變都有可能與特別的臨床預(yù)后情況相關(guān)，因此，如果能夠全面精密地檢測(cè)出突變位點(diǎn)，甚至突變所占的比例，可以給臨床醫(yī)生選擇疾病的治療方案帶來(lái)極大地便利[39]。

因此，BCR-ABL融合基因檢測(cè)可以監(jiān)測(cè)CML治療的療效，檢測(cè)BCR-ABL融合基因突變可以監(jiān)測(cè)酪氨酸激酶抑制劑治療后耐藥情況的發(fā)生。

4 小 結(jié)

目前CML分子靶向治療的方案，對(duì)臨床BCR-ABL融合基因的檢測(cè)方法提出了更高的要求。RQ-PCR方法具有高靈敏性，而且快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)和FISH方法的優(yōu)勢(shì)，使其成為臨床診斷及監(jiān)測(cè)CML的發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)，檢測(cè)耐藥相關(guān)的BCR-ABL融合基因ABL激酶區(qū)的突變，也是臨床治療中必不可少的一部分。在臨床診療中，不僅要考慮到不同的BCR-ABL融合基因的類型和疾病的表型之間的關(guān)系，還要注意選擇合適的定量監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)也需要進(jìn)行耐藥突變等情況的監(jiān)測(cè)。只有根據(jù)每位患者的病情以及疾病的發(fā)展，來(lái)應(yīng)用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)策略，才能真正做到精確的個(gè)體化治療，獲得更快的療效和更好的預(yù)后。

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深圳市鹽田區(qū)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(201301).

R733.7

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蔣湘蓮)