，

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院南院急診科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

丁苯酞在大鼠腦缺血—再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究

廖梓亙1*，陳慧2

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院南院急診科)

目的探討丁苯酞注射液在大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。方法

56只清潔級(jí)SD大鼠，隨機(jī)平均分為假手術(shù)組,缺血—再灌注組,丁苯酞24 h治療組,丁苯酞48 h治療組。缺血2 h再灌注時(shí)，丁苯酞24 h治療組及丁苯酞48 h治療組分別予腹腔注射丁苯酞注射液每天20 mg/kg，直至各時(shí)間點(diǎn)處死。假手術(shù)組和缺血—再灌注組分別向腹腔注射等量生理鹽水。觀察各組腦缺血體積及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果丁苯酞治療組比缺血再灌注組的腦缺血體積明顯縮小，且丁苯酞48 h治療組較24 h治療組縮小更顯著(P<0.05)。BDNF陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)顯示丁苯酞治療組比缺血再灌注組的BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，且丁苯酞48 h治療組較24 h治療組增多更明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論丁苯酞注射液可能通過(guò)誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

丁苯酞； SD大鼠； 腦缺血； 再灌注損傷； 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因

目前急性腦缺血性疾病是危害人類身體健康的重要疾病之一，使人的生命健康受到嚴(yán)重威脅。研究表明腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophical factor，BDNF)是一種由神經(jīng)元產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是大腦皮層[1],對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)和突觸形成、突觸連接及維持神經(jīng)元正常的生理功能起著關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)大腦損傷后腦功能的恢復(fù)起重要作用[2]。

丁苯酞是芹菜籽中提取物，為脂溶性藥物,可通過(guò)血—腦屏障。既往研究表明丁苯酞可阻斷缺血性腦損傷的一系列復(fù)雜的病理過(guò)程：可以抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕腦水腫；改善腦缺血區(qū)的能量代謝；抑制神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的壞死和凋亡；從而縮小大鼠腦梗塞體積[3-6]。丁苯酞通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合成酶(NOS)及NO水平[7]發(fā)揮抗血小板聚集和抗腦血栓作用[8-9]，但丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理尚未十分明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)頸外動(dòng)脈線栓法建立大腦腦缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)BDNF的表達(dá)情況，從而來(lái)探討丁苯酞的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理，為其治療腦缺血損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康雄性SD大鼠56只,體重200～250 g,由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYYK-025。隨機(jī)將SD大鼠分為4組：假手術(shù)組,缺血—再灌注組,丁苯酞24 h治療組，丁苯酞48 h治療組,每組各14只。2 h后治療組分別腹腔注射丁苯酞注射液20 mg/kg(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)，一天一次，假手術(shù)組,缺血—再灌注組分別腹腔注射等量生理鹽水。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備參照Longa[10]線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，術(shù)前禁食、禁水后,麻醉，去毛發(fā)后，消毒，鋪無(wú)菌孔巾；充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，輕柔分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，結(jié)扎并離斷左頸外動(dòng)脈的分支，充分游離左側(cè)頸外動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，用已準(zhǔn)備好的魚(yú)線，緩慢插入左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，長(zhǎng)度約為17±1.6 mm，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈穿刺部位，留有活結(jié)，逐層縫合組織及皮膚，將線外置；假手術(shù)組只暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈而無(wú)其他處理。

1.3模型成功判斷的標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估采用Bederson6級(jí)[11]5分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。選擇評(píng)分為1～4分的動(dòng)物模型，但符合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)而有蛛網(wǎng)膜下腔出血及術(shù)后死亡者，隨機(jī)補(bǔ)充。剔除評(píng)分為0分和5分的模型。

1.4腦缺血灶體積的測(cè)量各組SD大鼠腦缺血模型分別在缺血2 h后再灌注24 h、48 h，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉后并處死，取腦組織，放入-20 ℃冰箱內(nèi)凍存10 min后，逐層切成2 mm厚的腦片，置于2%TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，觀察腦組織。正常腦組織呈紅色，腦缺血組織呈白色。6 h后拍照并輸入計(jì)算機(jī)，用BI-醫(yī)學(xué)影像分析系統(tǒng)計(jì)算腦缺血灶面積，根據(jù)公式計(jì)算出腦缺血灶體積V=(C1+C2……Cn)/t-(C1+Cn)/2，(其中C為缺血灶面積，t為厚度，n為切片數(shù))，以腦缺血灶體積/全腦體積作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.5病理學(xué)檢查大鼠斷頭后，取得的腦組織均用10%中性甲醛24 h固定，再予以酒精梯度脫水，石蠟包埋,取腦缺血頂葉部位腦組織連續(xù)切片，厚度為3 μm，分別做常規(guī)HE染色和BDNF免疫組化染色,BDNF染色參照SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)依照步驟進(jìn)行，操作完成后在光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。

1.6 BDNF陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)觀察與計(jì)數(shù)各組均取腦缺血頂葉部位，每組取9張大腦頂葉切片行BDNF免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。顯微鏡下觀察各切片BDNF陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞和分布情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。顯微鏡目測(cè)器下對(duì)每張切片中BDNF陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)測(cè)定部位隨機(jī)選5個(gè)視野,取BDNF陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞平均數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1腦缺血灶體積和神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分假手術(shù)組腦片染成均勻紅色,未見(jiàn)腦梗缺血灶。缺血—再灌注組的腦組織有蒼白腦缺血灶,可見(jiàn)皮質(zhì)、皮質(zhì)下白質(zhì)和基底節(jié)區(qū)清晰的邊界。丁苯酞24 h治療組及48 h治療組的腦組織染色后有范圍不等的缺血灶,部位恒定，集中于大腦中動(dòng)脈供血的額、頂葉皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示丁苯酞24 h治療組及丁苯酞48 h治療組的神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分均較缺血—再灌注組顯著改善，且丁苯酞48 h治療組較丁苯酞24 h治療組改善更加顯著，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2丁苯酞注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注的腦缺血灶體積及BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)丁苯酞24 h治療組(t=19.753，P=0.000)、丁苯酞48 h治療組(t=38.981，P=0.000)腦缺血灶體積較缺血—再灌注組顯著縮小，而丁苯酞48 h治療組較丁苯酞24 h治療組改善更加顯著(t=-19.751，P=0.000)；缺血—再灌注組、丁苯酞24 h治療組、丁苯酞48 h治療組、假手術(shù)組之間的BNDF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)間差異存在顯著性(表2)。丁苯酞24 h治療組和丁苯酞48 h治療組BNDF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于缺血—再灌注組、假手術(shù)組(P均<0.05)，而丁苯酞48 h治療組較丁苯酞24 h治療組BNDF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加顯著(t=40.298，P=0.000)。

表1神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分影響(分)

與缺血—再灌注組治療后比較，a:P<0.05； 與丁苯酞24 h治療組治療后比較，b:P<0.05

表2腦缺血灶體積及BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

組別n腦缺血灶體積(mm3)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組14—58.750±4.713缺血—再灌注組14101.678±11.75635.250±3.772a丁苯酞24h治療組1482.998±5.876b85.875±2.031b丁苯酞48h治療組1462.597±7.109bc93.750±4.713bc

與假手術(shù)組比較，a：P<0.05；與缺血—再灌注組比較，b：P<0.05；與丁苯酞24 h治療組比較，c：P<0.05

2.3 HE染色顯微鏡下示假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，胞質(zhì)深染，細(xì)胞核形態(tài)正常。缺血—再灌注組神經(jīng)細(xì)胞稀疏，細(xì)胞間間隙增寬，大量細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞間質(zhì)呈空泡改變，水腫明顯，胞體縮小，細(xì)胞核固縮。丁苯酞24 h治療組神經(jīng)細(xì)胞部分變性壞死，存活神經(jīng)細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)欠正常，細(xì)胞間間隙增寬。丁苯酞48 h治療組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞間隙稍增寬，細(xì)胞形態(tài)學(xué)相對(duì)正常(圖1)。

圖1 大鼠腦缺血2 h后再灌注后腦組織的病理切片(HE染色400×) A：缺血—再灌注組；B：假手術(shù)組；C：丁苯酞24 h治療組；D：丁苯酞48 h治療組

2.4 BDNF免疫染色顯微鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組胞漿內(nèi)幾乎未見(jiàn)棕褐色或者黃色陽(yáng)性細(xì)胞；缺血—再灌注組陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量的棕褐色或者黃色細(xì)胞，BDNF之間間距較大。丁苯酞24 h治療組可見(jiàn)大量的陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕褐色或者黃色，BDNF表達(dá)明顯增多。丁苯酞48 h治療組陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕褐色或者黃色最多，較其他組BDNF表達(dá)明顯增多，BDNF之間間距較小，密度高(圖2)。

圖2 大鼠腦缺血2 h后再灌注后BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(免疫染色400×) A：缺血再灌注組；B：假手術(shù)組；C：丁苯酞24 h治療組；D：丁苯酞48 h治療組

3 討 論

既往研究表明丁苯酞對(duì)神經(jīng)損傷具有重要的保護(hù)作用。即使神經(jīng)損傷超過(guò)24 h，應(yīng)用丁苯酞仍可起到減輕腦細(xì)胞水腫的作用[12]；通過(guò)提高受損腦皮質(zhì)內(nèi)膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，起到修復(fù)神經(jīng)功能，改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷[13]；減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎癥細(xì)胞因子的釋放，縮小缺血腦組織的梗塞面積[14]； 改善大腦中動(dòng)脈栓塞缺血區(qū)細(xì)胞的腦能量代謝和微循環(huán)血流量[15]；還可以抑制神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的壞死和凋亡[16]。然而目前丁苯酞對(duì)缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用具體機(jī)理還不明確，本文丁苯酞對(duì)缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制進(jìn)行探討。

本研究示缺血—再灌注組大鼠的Longa評(píng)分最高，大鼠肢體功能癱瘓明顯，神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重。丁苯酞腹腔注射組Longa評(píng)分顯著減低，大鼠肢體功能癱瘓程度減輕，神經(jīng)功能缺損得到顯著改善，丁苯酞48 h治療組改善更為明顯。丁苯酞治療組腦缺血灶體積明顯小于缺血—再灌注組，且丁苯酞48 h治療組腦缺血體積較24 h治療組明顯縮小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明丁苯酞的保護(hù)作用有時(shí)間效應(yīng)，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，受損的神經(jīng)功能及腦缺血體積改善更加明顯。本研究中丁苯酞改善神經(jīng)缺血性損害的作用，與相關(guān)研究結(jié)果一致[17]。

另外光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，胞質(zhì)深染，細(xì)胞核形態(tài)正常；缺血—再灌注組神經(jīng)細(xì)胞稀疏，細(xì)胞間間隙明顯增寬，大量細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞間質(zhì)呈空泡改變，水腫明顯，胞體縮小，細(xì)胞核固縮；丁苯酞24 h治療組神經(jīng)細(xì)胞部分變性壞死，存活的神經(jīng)細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)欠正常，細(xì)胞間間隙增寬；丁苯酞48 h治療組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞間隙稍增寬，細(xì)胞形態(tài)學(xué)相對(duì)正常。與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣[18]，說(shuō)明丁苯酞具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)的作用。

本文還發(fā)現(xiàn)丁苯酞組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組及缺血—再灌注組明顯增多(P<0.05)，進(jìn)一步比較中發(fā)現(xiàn)48 h組較24 h組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，BDNF之間距離縮小，分布密度增高(P<0.05)，丁苯酞有誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)，提示BDNF參與腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)過(guò)程，從而得出丁苯酞可能通過(guò)誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)丁苯酞注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷可以縮小腦缺血體積，改善缺血半暗帶區(qū)的細(xì)胞學(xué)形態(tài)，增加殘存神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)BDNF的檢測(cè)，提示丁苯酞可能通過(guò)誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用。但本文未對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后不同劑量、超早期的丁苯酞未進(jìn)行研究，因此存在一定局限。

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ButylphthalideinMiceIschemia-reperfusionInjuryofNerveProtectionMechanismResearch

LIAO Zigen,CHEN Hui

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the neuroprotection of Butylphthalide in mice after ischemia-reperfusion injury and its mechanism.Methods56 clean-healthy SD rats were randomly divided into four groups:sham group，ischemic-reperfusion group,NBP for 24 hours group,NBP for 48 hours group.At the time of reperfusion after ischemia 2 h,the two NBP groups were treated with NBP (20 mg/kg,QD) by intraperitoneal injection until they were executed,also the sham group and the ischemic-reperfusion group were treated with the same dose of normal saline by intraperitoneal injection.ResultsThe volume of cerebral ischemia in NBP-group was smaller than the ischemic-reperfusion group,what was more,the NBP-48 group was much more smaller than NBP-24 group,all had statistical significance(P<0.05).The number of BDNF-positive cell in NBP-group was much more than the ischemic-reperfusion group,and NBP 48-group increased more obviously than NBP- 24 group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionButyl phthalide injection can induce the expression of BDNF and have protective effect on rats nerve with ischemia-reperfusion injury.

Butylphthalide； SPrague-Dawley rats； brain ischemia； reperfusion injury； brain derived neurotrophic factor

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.009

2015-12-15；

2016-03-28

*通訊作者，E-mail:lzg18773472527@163.com.

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蔣湘蓮)