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(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院， 湖北 十堰 442000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌細(xì)胞侵襲

羅衛(wèi)民，羅湘玉，郭家龍，林稱意，張軍*

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院， 湖北 十堰 442000)

目的探討miR-200b是否通過靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲，以揭示miR-200b的抑瘤機(jī)制。方法運(yùn)用qRT-PCR檢測miR-200b在非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織中的表達(dá)；將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞分為miR-200b mimics組、miR-200b inhibitors組、scramble組、VEGF-siRNA組和control-siRNA組，分別將miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞；采用Western blot檢測A549細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測A549細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-200b在A549、16HBE細(xì)胞的表達(dá)分別為0.704±0.053、1.582±0.071，兩者比較，差異有顯著性(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，外源過表達(dá)miR-200b或沉默VEGF能明顯下調(diào)A549細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)水平；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為(127±6)和(136±8)，與對照組(189±14)比較能明顯抑制A549細(xì)胞的穿膜能力(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA對A549細(xì)胞的侵襲抑制作用。結(jié)論miR-200b通過靶向調(diào)控VEGF抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲。

miR-200b； 非小細(xì)胞肺癌； 血管內(nèi)皮生長因子； 侵襲

MicroRAN是一類高度保守，長度約為22個核苷酸的小RNA分子，通過與靶基因mRNA 3′ UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老等多種生理過程。miRNA的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，miR-200b在多種腫瘤中表達(dá)異常，如胃癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌中表達(dá)下調(diào)類似抑癌基因樣作用[1-3]。李光劍等[4]研究顯示，miR-200b在肺癌中的表達(dá)差異可作為早期診斷云南宣威地區(qū)非吸煙女性肺癌患者的生物標(biāo)志物。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種重要的血管生成調(diào)控因子，其高表達(dá)可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂與增殖，從而促進(jìn)新生血管形成。研究顯示，VEGF在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)明顯高于健康人群，且其高表達(dá)與肺癌惡性程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。本文擬通過qRT-PCR、免疫印跡、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-200b在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，明確miR-200b在肺癌細(xì)胞中的作用及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2012年5月～2013年11月期間本院收治并確診為非小細(xì)胞肺癌的患者24例，中位年齡58(39～71)歲，男性14例，女性10例；所有非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前均未行放化療等抗腫瘤治療。所有癌組織標(biāo)本經(jīng)HE 染色并經(jīng)兩名以上病理學(xué)專家確診，所取癌旁正常組織距癌緣>5 cm，經(jīng)HE染色證實(shí)為非癌組織。

1.2主要材料非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和人支氣管上皮細(xì)胞16HBE由中山大學(xué)腫瘤研究所惠贈；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司(美國)；基質(zhì)膠與Transwell小室購于康寧公司(美國)；miR-200bmimics、inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA序列均由Ambion公司設(shè)計(jì)合成；RNA抽提試劑盒購于Ambion公司(美國)；VEGF和β-actin抗體購于Santa Cruz公司(美國)。

1.3方法

1.3.1 細(xì)胞分組與處理 將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞分為miR-200b mimics組、miR-200b inhibitors組、scramble組、VEGF-siRNA組和control-siRNA組，分別將miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞。

1.3.2 qRT-PCR 用RNA抽提試劑盒抽提A549中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 于80 ℃冰箱保存。miR-200b-

(forward)5′-CTCCCTAAAGCCTCCCACC-3′,(reverse) 5′-AGGGCTTTCTGCTGTTGTCC-3′;U6-(forward)5′-GCGGTCCGTGAA GCGTTC-3′,(reverse)5′-GTGTGCGGTCCGAGGT-3′，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，Taq DNA polymerase 5 U/μL)0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為:95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，一共40個循環(huán)。以U6 snRNA為內(nèi)參，所測定的miR-200b的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3.3 Western blot 將miR-200b mimics、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA,分別轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞中，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入VEGF抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠稀釋液鋪置在transwell小室中，放置成膜。取100 μL細(xì)胞稀釋液接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出，擦棄小室上層細(xì)胞并用4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶祡染色，PBS液洗滌，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取4個高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-200b在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平

提取非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織中的總RNA，以U6 snRNA為內(nèi)參采用qRT-PCR法檢測非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織中miR-200b的表達(dá)水平。圖1所示，非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織總RNA的18S和28S條帶清晰，A260/A280比值大于1.93，符合RT-PCR要求。以2-ΔΔCT表示miR-200b的表達(dá)水平，分析得出在24例非小細(xì)胞肺癌組織中miR-200b的平均表達(dá)值為0.704±0.053，癌旁正常肺組織中miR-200b的平均表達(dá)值為1.582±0.071，兩者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P<0.01)。

圖1 非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常肺組織的總RNA電泳圖 M：Marker；1：非小細(xì)胞肺癌；2：癌旁正常肺組織

2.2非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-200b對VEGF蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200b mimics組和VEGF-siRNA組VEGF蛋白表達(dá)水平較陰性對照組明顯降低(圖3)。即在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-200b能下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)。

2.3 miR-200b對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞侵襲的影響Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200b mimics組和VEGF-siRNA組36 h后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量分別為(127±6)和(136±8)，與各自對照組(189±14、195±11)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4，表1)。而miR-200b inhibitors聯(lián)合VEGF-siRNA共轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為(182±12)與對照組相比較，差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示外源高表達(dá)miR-200b或沉默VEGF表達(dá)均能抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的侵襲。而miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA對A549細(xì)胞的侵襲抑制作用。

圖2 qRT-PCR檢測結(jié)果 A:非小細(xì)胞肺癌組擴(kuò)增曲線；B:非小細(xì)胞肺癌組溶解曲線;C:正常肺組織組擴(kuò)增曲線；D:正常肺組織組溶解曲線

圖3 Western blot檢測miR-200b對VEGF蛋白的影響

表1miR-200b對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞侵襲的作用(n=3)

組別穿膜細(xì)胞數(shù)scramble189±14miR-200bM127±6acontrol-siRNA195±11VEGF-siRNA136±8bmiR-200bI+VEGF-siRNA182±12

與scramble比較，a：P<0.05；與control-siRNA比較，b：P<0.05

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-200b對A549細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率目前在所有惡性腫瘤中均居首位[6]。肺癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多因素協(xié)同長期作用并與多條信號通路改變相關(guān)[7]。隨著環(huán)境惡化，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增加趨勢。在肺癌的分類中以非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)為主，大約占80%以上，其早期診斷困難，故大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者在確診時已達(dá)晚期階段。因此，有效治療策略的開發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急。

miR-200家庭成員通過Zeb1、Ets-1、Suz12等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要功能[8]。研究表明，miR-200家庭成員中miR-200b在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，對多種腫瘤具有抑制作用[9]。研究顯示，在上皮性腫瘤中miR-200b可以調(diào)控EMT轉(zhuǎn)化、細(xì)胞的周期與增殖以及細(xì)胞的耐藥性[10]。miR-200b通過直接靶向E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1 與 ZEB2的表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，從而抑制EMT轉(zhuǎn)化[11]。由此可見miR-200b在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，外源高表達(dá)miR-200b能明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲，提示miR-200b在肺癌細(xì)胞中具有抑癌作用。

VEGF 是參與腫瘤血管生成的重要調(diào)控因子之一，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，還可激活蛋白酶，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，有助于新生血管的延伸，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供重要的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。VEGF高表達(dá)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖和遷移能力增強(qiáng)，其與腫瘤生長密切相關(guān)[12]。研究表明，VEGF在NSCLC中高表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床分期相關(guān)，表明VEGF 在NSCLC 的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[13]。有研究顯示VEGF是miR-200b直接調(diào)控的靶基因[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中外源過表達(dá)miR-200b能下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)，而在肺癌細(xì)胞中沉默VEGF后，肺癌細(xì)胞的侵襲能力也明顯減弱，而將miR-200b抑制劑與VEGF-siRNA共同轉(zhuǎn)染于肺癌細(xì)胞，能逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的侵襲抑制作用。說明miR-200b可能通過靶向調(diào)控VEGF抑制肺癌細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步提示VEGF是miR-200b下游的功能靶點(diǎn)，miR-200b可能通過下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的侵襲。

綜上，miR-200b可通過靶向VEGF抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲。miR-200b可能是非小細(xì)胞肺癌的潛在的治療靶點(diǎn)，為今后該疾病的靶向治療提供了新的切入點(diǎn)。

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miR-200bPromotesNon-smallCellLungCancerCellsInvasionbyTargetingVEGF

LUO Weimin,LUO Xiangyu,GUO Jialong,et al

(AffiliatedTaiheHospitalofHubeiMedicineCollege,shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo investigate whether miR-200b promotes cell invasion of non-small cell lung cancer cells by targeting VEGF,thus to reveal molecular mechanism that miR-200b functions as a tumor suppressor in non-small cell lung cancer.MethodsThe expression of miR-200b in non-small cell lung cancer and normal lung tissues was detected by qRT-PCR.Non-small cell lung cancer cell line A549 were divided into miR-200b mimics group,miR-200b inhibitors group,scramble group,VEGF-siRNA group as well as control-siRNA group.A549 cells were transfected with miR-200b mimics,scramble,VEGF-siRNA,control-siRNA,respectively.The expressions of VEGF protein in A549 cells was detected by Western blotting.The invasion ability of A549 cells were evaluated by Transwell invasion assays.ResultsqRT-PCR showed that miR-200b was significantly down-regulated in non-small cell lung cancer tissues (0.704±0.053) than normal lung tissues (1.582±0.071).Western blot showed that the level of VEGF protein was inhibited by restored miR-200b or knock-down VEGF in A549 cells.After transfection of miR-200b mimics or knock-down VEGF for 36 h,Transwell invasion assay showed that the number of cells through the basement membrane was(127±6),(136±8),compared with the control group(189±14),it can significantly suppress the invasion of A549 cell (P<0.01).However,miR-200b inhibitors could antagonize the role of VEGF-siRNA in A549 cells.ConclusionmiR-200b suppresses cell invasion by targeting VEGF in non-small cell lung cancer.

MiR-200b; non-small cell lung cancer; VEGF; invasion

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.008

2015-12-21；

2016-05-03

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(B2015477).

*通訊作者，E-mail:dengmin2006@163.com.

R734.2

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蔣湘蓮)