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(1.南華大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學病原生物學研究所)

·基礎醫(yī)學·

梅毒螺旋體纖連蛋白結(jié)合蛋白Tp0136前炎癥活性的研究

肖勇健1,2，劉卓然1，趙飛駿2，余堅2，曾鐵兵2

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學病原生物學研究所)

目的初步研究梅毒螺旋體纖連蛋白結(jié)合蛋白Tp0136潛在的前炎癥活性。方法構建重組質(zhì)粒pET-28a/Tp0136并誘導其表達目的蛋白；將不同濃度(1、2、5、10 μg/mL)的rTp0136分別刺激THP-1源性巨噬細胞，ELISA法分別檢測其產(chǎn)生前炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；并同時用二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)預先處理巨噬細胞，檢測相應細胞因子分泌量。結(jié)果成功構建了pET-28a/Tp0136重組質(zhì)粒，并誘導表達和純化出rTp0136；重組蛋白能誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α，并且呈濃度和時間依賴性；重組蛋白刺激經(jīng)PDTC預處理后的巨噬細胞，其IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分別降至32%、35%和27%。結(jié)論rTp0136可誘導巨噬細胞產(chǎn)生前炎癥細胞因子，該過程可能受NF-κB調(diào)控。

梅毒螺旋體； 纖連蛋白結(jié)合蛋白； Tp0136； 前炎癥細胞因子； 核因子kappa B

梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一種性傳播疾病(STD)，其病程較長，臨床癥狀復雜多變，并且其與AIDS的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。上世紀90年代以來，全球每年大約有1 200萬梅毒新發(fā)病例，已嚴重危害公眾的身心健康[2]，成為我國乃至全世界共同面對的社會問題和公共衛(wèi)生問題[3-4]，而對于Tp致病機制的闡明將為梅毒的防治提供有力的理論基礎。

纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding proteins,FnBP)作為病原體上的膜蛋白，在粘附宿主、定植等的過程中具有非常重要的作用，是造成宿主感染的一種非常重要的毒力因子[5-6]。Tp0136為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種Tp主要的FnBP[7]，其主要介導Tp與宿主細胞的結(jié)合，也可介導Tp結(jié)合細胞間質(zhì)中的Fn，是機體較早接觸的Tp膜蛋白之一，在感染早期可引起宿主產(chǎn)生較強的體液免疫應答，此外，Tp0136是否具有與其他膜脂蛋白[8-10]類似前炎癥效應，目前尚不明確。本文將探討Tp0136潛在的炎癥活性以及激活是否受NF-κB調(diào)控，為闡明Tp0136在Tp感染所致?lián)p傷中的作用提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Tp Nichols標準株、表達菌E.coliBL21(DE3)、pET-28a質(zhì)粒、人單核細胞(THP-1)均為南華大學病原生物學研究所保存。

1.1.2 試劑和試劑盒 Pfu PCR MasterMix試劑盒(北京天根公司)、辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗人IgG(大連寶生物公司)；DNA分子量標準、蛋白分子量標準(北京天根公司)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶(NEB公司)；Ni-NTA親和層析柱、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Qiagen公司)；BCA微量蛋白測定試劑盒(Pierce公司)、ECL蛋白印跡法檢測試劑盒(Pierce公司)，Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠(Thermo Scientific公司)，顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門鱟試劑公司)，IL-1β、IL-6和TNF-α 試劑盒(R&D生物制劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1 Tp 0136基因的擴增 在線(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)獲取Tp 0136的全基因序列(基因編號：CP004010)，應用Signal P 4.1軟件作信號肽序列分析(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，去除信號肽序列，設計引物(由上海生工合成)，上游引物F:5′-CGGGATCCCGCGATTTCACTGGCATCTTTG-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點，下游引物R:5′-GGAATTCCTACTCGCGGTTCCAGGAGCA-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點；PCR擴增體系:2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μL、10 μmol/L引物各1 μL、Tp DNA模板2 μL、加ddH2O補至25 μL。擴增條件:94 ℃5 min;94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀(Bio-rad公司)中觀察目的條帶?；厥铡⒓兓疨CR產(chǎn)物，備用。

1.2.2 重組體pET-28a/Tp 0136的構建與鑒定 將純化后的PCR產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，再用T4連接酶將按比例混合的酶切產(chǎn)物進行連接、轉(zhuǎn)化至處于感受態(tài)的克隆菌E.coliJM 109中，培養(yǎng)48 h后篩選陽性克隆，作酶切鑒定和PCR鑒定，初步鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生工公司進行測序。再將經(jīng)測序鑒定正確的pET-28a/Tp 0136轉(zhuǎn)化至表達菌E.coliBL21(DE3)中構建重組表達體。

1.2.3 Tp 0136重組蛋白的表達、純化及鑒定 IPTG誘導重組體pET-28a/Tp 0136表達目的蛋白，同時設未誘導組及陰性對照組，SDS-PAGE分析表達結(jié)果。大規(guī)模誘導重組菌，收集菌體，加入溶菌酶作用，超聲裂解菌體后離心收集沉淀制備包涵體，包涵體充分溶解后用Ni-NTA親和層析柱純化，具體操作步驟按試劑盒中說明書。純化產(chǎn)物采用尿素梯度透析復性后，作SDS-PAGE分析及Western blot鑒定；按BCA法測定重組蛋白的濃度；重組蛋白經(jīng)Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠過柱，然后用顯色基質(zhì)鱟試劑盒測定其內(nèi)毒素含量。

1.2.4 THP-1細胞培養(yǎng)及刺激試驗 于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)中加入人單核細胞系THP-1細胞，置37 ℃，5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。于傳代后第1天收集細胞，按1×106/mL細胞數(shù)接種于細胞培養(yǎng)板中，每孔加至2 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，為刺激THP-1細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，再加入終濃度為100 nmol/L的佛波酯(PMA)，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，實驗組分別加入終濃度為1、2、5、10 μg/mL重組蛋白的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。另外，為評價Tp 0136重組蛋白刺激巨噬細胞產(chǎn)生CKs的時間依賴性，于培養(yǎng)液中加入終濃度為5 μg/mL的重組蛋白分別培養(yǎng)6、12、24、48、60、72 h。各實驗組均設LPS (100 ng/mL)為陽性對照、PBS為陰性對照。各組均設3個平行試驗。為了評價CKs的分泌是否受NF-κB通路的調(diào)控，另用25 μmol/L PDTC 預處理巨噬細胞30 min，再以5 μg/mL的重組蛋白刺激巨噬細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 ELISA檢測CKs 將已貼壁的巨噬細胞用PBS吹打、沖洗3次，再用0.1% Triton X-100處理30 min，反復凍融細胞2次，離心，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書測定上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.3統(tǒng)計學方法所有實驗均重復3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，運用SPSS13.0軟件，均數(shù)之間比較采用t檢驗和One way ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1重組體pET-28a/Tp 0136的鑒定以重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增出約1 400 bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符；重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到與PCR產(chǎn)物一致的條帶(圖1)；測序結(jié)果經(jīng)BLAST后證實與GenBank中公布的Tp 0136序列完全一致。

圖1 pET-28a/Tp 0136重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及菌液PCR鑒定 1:DNA marker;2:以Tp Nichols 株DNA為模板的擴增產(chǎn)物;3:pET-28a/Tp 0136雙酶切;4:重組質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物;5:PCR陰性對照

2.2 Tp 0136重組蛋白的表達、純化及鑒定含pET-28a/Tp0136的E.coliBL21經(jīng)IPTG誘導后，表達出一分子量約50 kDa大小條帶的目的蛋白，與預期結(jié)果相符(見圖2A)；存在于包涵體的融合蛋白采用Ni-NTA親和層析純化柱以及pH梯度洗脫法純化，見圖2B；純化后目的蛋白用尿素梯度透析復性后，分別以6×His-Tag單抗和梅毒患者血清為一抗作WB鑒定，結(jié)果顯示在相應位置出現(xiàn)單一特異性條帶，見圖3；BCA法測定蛋白濃度為270 μg/mL；重組蛋白經(jīng)內(nèi)毒素去除膠去除所含內(nèi)毒素后，用鱟試劑檢測其內(nèi)毒素含量<0.04 EU/mL，符合后續(xù)試驗要求。

2.3 Tp 0136重組蛋白刺激THP-1源性巨噬細胞產(chǎn)生CKs rTp 0136呈現(xiàn)以劑量依賴方式和時間依賴方式刺激巨噬細胞產(chǎn)生CKs(圖4)。用重組蛋白刺激巨噬細胞后，能明顯誘導后者產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α，其產(chǎn)量并且隨著蛋白濃度的增加而增加，至5 μg/mL達到峰值，峰值分別為195.51±14.73 pg/mL、170.19±4.38 pg/mL、1732.90±44.52 pg/mL，隨后呈下降趨勢，實驗組CKs的分泌量均明顯高于同濃度的對照組，經(jīng)t檢驗和One way ANOVA方差分析，得IL-1β組(F=216.179,P=0.00)、IL-6組(F=283.275,P=0.00)和TNF-α組(F=1880.739,P=0.00)，其差異有統(tǒng)計學意義。當用5 μg/mL rTp0136刺激巨噬細胞，在24 h內(nèi)隨刺激時間增加，誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也增加，其中TNF-α的水平于24 h時達到高峰，為1662±87.9 pg/mL，IL-1β、IL-6的水平于48 h時達到高峰，為332.5±16.4 pg/mL、145.7±11.4 pg/mL(圖4B)。

圖3 Tp 0136重組蛋白的WB鑒定 1:陰性對照;2:梅毒患者血清;3:6 × His-Tag單抗

2.4 NF-κB與CKs產(chǎn)生的關系巨噬細胞經(jīng)PDTC預處理后，rTp0136刺激其IL-1β、IL-6和TNF-α 的產(chǎn)量分別降至對照組(經(jīng)DMSO處理)32%、35%和27%，見圖5。rTp0136刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α可能受NF-κB通路的調(diào)控。

3 討 論

Tp目前尚未證明有明顯的致病物質(zhì)，如莢膜、內(nèi)毒素和外毒素等致病因子。資料表明[5-6]，病原菌外膜上的FnBP能與ECM的纖連蛋白(Fn)結(jié)合，在細菌粘附宿主細胞等的過程中具有非常重要的作用，是引起宿主感染重要的毒力因子。同樣Tp外膜蛋白中的FnBP在Tp入侵宿主的初始階段，如粘附、定植等致病環(huán)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用[7]。此外，Tp感染宿主后，細胞免疫在致病過程中起著重要作用[8]，一方面能清除螺旋體，另一方面又導致局部組織病理損傷，這主要是由于Tp在感染部位繁殖后，某些菌體成分可激活局部或/和鄰近的單核/巨噬細胞，誘導合成和釋放一系列炎性介質(zhì)，引起炎癥反應，形成梅毒下疳。

圖4 梅毒螺旋體纖連蛋白rTp0136以劑量和時間依賴方式誘導THP-1源性巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α A:分別用不同濃度重組蛋白刺激巨噬細胞后，IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生量，其中LPS為陽性對照，PBS為陰性對照(均為三次平行試驗);B:5 μg/mL rTp0136刺激巨噬細胞后，在不同時間點IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生量(均為三次平行試驗)

圖5 NF-κB抑制劑PDTC對巨噬細胞分泌CKs的影響

目前已有研究[8-10]表明，Tp的膜蛋白TpN47、TpN17、Tp0751和Tp0663均可誘導單核/巨噬細胞釋放前炎癥細胞因子。Tp 0136作為一種膜脂蛋白，屬于FnBP家族，在感染早期，即可產(chǎn)生較強的體液免疫應答[11]，另外，Tp 0136主要依靠其氨基末端結(jié)合宿主細胞的Fn[12]，從而使螺旋體粘附于宿主細胞，為病原體在局部定植提供保證，但其是否具有促前炎癥活性作用還不明確。本研究采用人單核細胞(THP-1)源性的巨噬細胞為研究對象，在體外環(huán)境模擬人體對Tp感染后的免疫應答。IL-1β、IL-6和TNF-α是重要的促炎因子，能介導機體的炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)等。本研究顯示，Tp 0136蛋白能誘導人巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，分泌量與蛋白濃度和誘導時間呈一定的依賴關系。隨著刺激濃度增大，分泌量亦增加，在蛋白刺激濃度為5 μg/mL，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量達到高峰；在刺激時間上，TNF-α出現(xiàn)峰值時間在24 h，而IL-1β、IL-6峰值時間在48 h。當高于此濃度和此刺激時間后，CKs的產(chǎn)生量明顯減少，可能是由于濃度過高和刺激時間過長會干擾巨噬細胞正常的生物學功能，從而導致CKs分泌的減少[9]。

NF-κB作為一個早期轉(zhuǎn)錄因子，是各種炎癥反應的共同通路，參與免疫反應的早期和炎癥反應各階段的許多分子(其中包括IL-1β、IL-6和TNF-α)都受到其調(diào)控，在多種生理及病理情況下有重要作用[13]。本文利用NF-κB特異抑制劑PDTC預處理巨噬細胞后，發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制rTp0136誘導的NF-κB活化，使IL-1β、IL-6和TNF-α分泌減至20%～30%左右，表明rTp0136誘生THP-1源性巨噬細胞產(chǎn)CKs可能經(jīng)NF-κB通路調(diào)控。

由于Tp至今尚不能體外人工培養(yǎng)[8]，很大程度上制約了對其深入研究。本研究利用分子克隆技術，成功表達去信號肽的rTp0136，初步證實Tp0136蛋白作為一種膜脂蛋白，具有與TpN47、TpN17、Tp0751和Tp0663等類似的前炎癥活性，在體外能夠誘導人巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α等前炎癥因子，該過程可能受NF-κB通路的調(diào)節(jié)。誠然，本研究尚有不足之處，比如Tp0136蛋白是否還可刺激巨噬細胞產(chǎn)生其他的細胞因子，該過程是否還受到其他信號通路的調(diào)節(jié)，比如TLR-MAPK通路等，這些均有待進一步證實。

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ProinflammatoryActivityofRecombinantFibronectin-BindingProteinsTp0136ofTreponemaPallidum

XIAO Yongjian,LIU Zhuoran,ZHAO Feijun,et al

(ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore potential proinflammatory activity of the Treponema pallidum fibronectin-binding protein (FnBP) Tp0136.MethodsThe recombinant pET-28a/Tp0136 was constructed and induced to express the targeting protein inE.coliBL21.In vitro various concentrations of protein was used to stimulate human macrophages derived from THP-1 cell line at different time.ELISA was performed to detect the level of proinflammatory cytokines IL-1β,IL-6 and TNF-α;Recombinant protein was used to stimulate the macrophages pre-treated with PDTC,and ELISA was performed to detect the releasing IL-1β,IL-6 and TNF-α respectively.ResultsThe recombinant plasmid was constructed and the corresponding recombinant protein was obtained successfully;rTp0136 could induce production of IL-1β,IL-6 and TNF-α in dose- and time-dependent manners significantly.Secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α decreased to 32%,35% and 27% respectively when macrophages was pre-treated with PDTC.ConclusionThe data suggested that the FnBP Tp0136 could activate the THP-derived human macrophages to release the proinflammatory cytokines,which might be regulated via NF-κB.

Treponema pallidum; fibronectin-binding protein (FnBP); Tp0136; proinflammatory cytokines; NF-κB

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.006

2015-11-17；

2016-04-20

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目(No:B2012-055)；湖南省科技廳一般項目(No:2014TT2025)；湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目(No:B2013-035).

R759.1

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蔣湘蓮)