， ，

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床技能中心，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

膠質(zhì)瘤中Par6蛋白的表達及其臨床病理學(xué)意義

徐剛，洪麗，蔣穗斌*

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床技能中心，湖南 衡陽 421001)

目的檢測Partitioning defective 6(Par6)蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達，分析其臨床病理學(xué)意義，探討Par6基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法收集70例不同臨床分期及不同分化程度膠質(zhì)瘤組織及20例正常腦組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化檢測Par6蛋白的表達。結(jié)果與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中Par6蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。Par6蛋白在Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤中的表達明顯低于在Ⅰ、Ⅱ的膠質(zhì)瘤。結(jié)論Par6蛋白在膠質(zhì)瘤中低表達。其表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)。

膠質(zhì)瘤； Par6； 侵襲； 臨床分期

惡性膠質(zhì)瘤是一種常見的惡性程度相當(dāng)高的原發(fā)性腦瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%以上。具有病程進展快，預(yù)后差的特點[1,2]。盡管在診斷方法和手術(shù)結(jié)合放、化療的治療策略上有了明顯進步，但惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)和5年生存率依然不容樂觀[3]。因此，深入研究惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，為惡性膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的思路。

Par6蛋白是進化上高度保守的不對稱分裂所需的蛋白質(zhì)，能夠與許多極性相關(guān)蛋白組成蛋白復(fù)合物，參與包括apical-basal細胞極性，細胞定向分化，細胞遷移，細胞增殖和神經(jīng)元軸突分化等許多細胞生長發(fā)育過程[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Par6在乳腺癌、前列腺癌的Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT)進程中起到關(guān)鍵作用[5]。那么在以高度侵襲性為特點的惡性膠質(zhì)瘤中，Par6的功能極其作用機制值得探索。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在惡性程度最高的膠質(zhì)母細胞瘤中，Par6表達明顯下調(diào)。隨后，免疫組化證實Par6在各級膠質(zhì)瘤組織中表達均有不同程度下調(diào)。Par6的表達水平與惡性程度成反比。我們的實驗提示Par6可以作為膠質(zhì)瘤分子診斷的候選標(biāo)志物，并成為膠質(zhì)瘤治療過程中的新靶點。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫GBM Gene expression (AgilentG4502A_07_1)源自The Cancer Genome Atlas(http://cancergenome.nih.gov)。數(shù)據(jù)處理使用cBioPortal和GraphPad Prism軟件。

1.2主要組織標(biāo)本和主要試劑正常腦組織樣本20例，其中9例取自開顱血腫清除術(shù)的腦外傷患者，2例取自因手術(shù)部位較深必須切除部分腦組織的良性腦瘤患者，9例取自南華大學(xué)司法鑒定中心尸體解剖正常大腦組織。膠質(zhì)瘤組織樣本70例，其中病理分級Ⅰ級9例、Ⅱ級19例、Ⅲ級22例、Ⅳ級20例，以上膠質(zhì)瘤組織樣本均采集于中南大學(xué)湘雅一醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)室，組織樣本離體后立即放入液氮中保存。每例組織樣本留取部分甲醛固定，石蠟包埋，HE 染色，并經(jīng)中南大學(xué)湘雅一醫(yī)院病理科再次確診。上述所有組織樣本的使用均獲得中南大學(xué)和南華大學(xué)倫理委員會同意。

1.3 SP免疫組化檢測膠質(zhì)瘤組織中Par6蛋白的表達石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，免疫組化操作步驟按試劑盒說明進行。3% H2O2孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；10%枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原；PBS 清洗后正常羊血清封閉30 min；滴加50 μL鼠抗人Par6單克隆抗體(Santa Cruz，1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS清洗后滴加生物素化的羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗后經(jīng)DAB 顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗，每張切片至少隨機觀察5個高倍視野，綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標(biāo)準[6]:不著色0分,黃色1分,棕黃色2分，黃褐色3分。陽性細胞所占比例評分標(biāo)準:陽性細胞數(shù)<10%者0分，10%～40%者1分，40%～70% 者2分，≥70%者3分。兩種評分相加0～70%者2分，≥70%者3分。兩種評分相加0～2分為弱表達，3～6分為強表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理各組數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析Par6在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達我們從癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)計劃數(shù)據(jù)庫的膠質(zhì)母細胞瘤全基因表達圖譜數(shù)據(jù)庫中獲得10例正常腦組織及16 383例膠質(zhì)母細胞瘤組織的基因組測序結(jié)果，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤中的Par6表達水平明顯低于正常腦組織，差異有顯著性(圖1)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)母細胞瘤的表達 Normal:正常腦組織，GBM：Glioblastoma Multiforme多形性膠質(zhì)母細胞瘤。***:P<0.001

2.2膠質(zhì)瘤組織Par6蛋白的免疫組化表達Par6陽性染色為棕黃色,位于胞漿(圖2A～D)。結(jié)果顯示，相對于正常腦組織，Par6在膠質(zhì)瘤組織中表達明顯下調(diào)(表1，圖2C,D)。進一步分析Par6表達與臨床病理特征，如表2所示，雖然Par6的表達水平與病人的年齡，性別以及病理組織學(xué)類型無顯著相關(guān)性，但與膠質(zhì)瘤臨床分級顯著相關(guān)(Ⅰ～Ⅱ vs Ⅲ～Ⅳ；P=0.008)。

圖2 免疫組化SP法檢測Par6蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達 A：正常腦組織(40×)；B：膠質(zhì)瘤組織(40×)；C：正常腦組織(200×)；D：膠質(zhì)瘤組織( 200×)

表1Par6蛋白在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達

項目nPar6表達強表達弱表達P膠質(zhì)瘤7025450．013正常腦組織20164-

表2膠質(zhì)瘤中Par6蛋白表達與臨床病理特征分析

項目nPar6表達強表達弱表達P性別男4613(28．3%)33(71．7%)0．114女2413(54．2%)11(45．8%)-年齡≥503616(44．4%)20(55．6%)0．326<503410(29．4%)24(70．6%)-組織學(xué)類型星形膠質(zhì)細胞瘤5223(44．2%)29(55．8%)0．262少突膠質(zhì)細胞瘤81(12．5%)7(87．5%)-其他104(40．0%)6(60．0%)-WHO分級Ⅰ+Ⅱ2414(58．3%)10(41．7%)0．008Ⅲ+Ⅳ4611(23．9%)35(76．1%)-

3 討 論

Par6作為極性分化相關(guān)基因在線蟲發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)后，大量研究證實Par6蛋白位于極性蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心位置，類似于一個港口，各種極性蛋白在此?？浚赑ar6的參與下，組成Par6-Lgl-Scrb，Par6-Par3-cdc42-aPKCζ等極性蛋白復(fù)合共同參與細胞極性調(diào)控[7]。這些極性蛋白復(fù)合物的功能異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[8]。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，Par6基因在膠質(zhì)母細胞瘤中表達明顯下調(diào)，隨后，我們證實Par6蛋白在各級膠質(zhì)瘤中的表達均下調(diào)。雖然目前關(guān)于Par6表達下調(diào)的原因和機制尚未明確，但其在多種腫瘤中的表達異常提示Par6蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。分析Par6表達與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，Par6蛋白的表達水平與病人的年齡，性別及膠質(zhì)瘤的病理分型無關(guān)，但與WHO分級顯著相關(guān)，Par6蛋白在Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤中的表達明顯低于在Ⅰ、Ⅱ的膠質(zhì)瘤。腦膠質(zhì)瘤是起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，具有極強的侵襲能力。由于Par6蛋白在細胞極性信號通路中起到至關(guān)重要重要的作用，而細胞的極性調(diào)控異常是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的主要特征。其表達與膠質(zhì)瘤惡性程度的負相關(guān)提示，Par6蛋白與膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

惡性膠質(zhì)瘤系浸潤性生長，與正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對放療化療不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)。由于血腦屏障等因素的影響，化學(xué)藥物和一般抗腫瘤的中藥，療效也不理想。因此，研究Par6在膠質(zhì)瘤中的表達為膠質(zhì)瘤的分子診斷及靶向治療提供了新的候選靶點。

[1] Kang JH,Adamson C.Novel chemotherapeutics and other therapies for treating high-grade glioma[J].Expert Opin Investig Drugs,2015,24(10):1361-1379.

[2] Wang J,Su HK,Zhao HF,et al.Progress in the application of molecular biomarkers in gliomas[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,465(1):1-4.

[3] Ramakrishna R,Pisapia D.Recent molecular advances in our understanding of glioma[J].Cureus,2015,7(7):e287.

[4] Goldstein B,Macara IG.The PAR proteins:fundamental players in animal cell polarization[J].Dev Cell,2007,13(5):609-622.

[5] Gunaratne A,Di Guglielmo GM.Par6 is phosphorylated by aPKC to facilitate EMT[J].Cell Adh Migr,2013,7(4):357-361.

[6] 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準[J].中國癌癥雜志,1996(4):229-231.

[7] Bose R,Wrana J L.Regulation of Par6 by extracellular signals[J].Curr Opin Cell Biol,2006,18(2):206-212.

[8] Aranda V,Nolan M E,Muthuswamy S K.Par complex in cancer:a regulator of normal cell polarity joins the dark side[J].Oncogene,2008,27(55):6878-6887.

TheExpressionandClinicalPathologicalSignificanceofPar6inGlioma

XU Gang,HONG Li,JIANG Suibing

(ClinicalTechnologyCenterofMedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang421001，China)

ObjectiveTo explore the role of Par6 in the development of glioma by analysis of the expression of Par6 in glioma tissue.Methods70 cases of human glioma tissue with different clinical period and differentiation histological type and 20 cases of normal brain tissue were selected.The protein of Par6 was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with normal brain tissue,the expression of Par6 protein in glioma tissue decreased significantly (P<0.05).The expression level of Par6 was lower at stage Ⅲ～Ⅳ than that at Ⅰ～Ⅱ (Ⅰ～ⅡvsⅢ～Ⅳ;P=0.008).ConclusionThe expression of Par6 in glioma tissue decreased,and Par6 was involved in the development and progression of glioma,which was markedly correlated with clinical stage.

Par6; Glioma; invasion; clinical stage

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.007

2015-09-21；

2015-11-09

*通訊作者，E-mail:jsb923@sina.com.

R739.41

A

秦旭平)