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(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 衡陽(yáng)，421001，2.中國(guó)中藥有限公司)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理作用及機(jī)制

駱鏡妃1，胡宗科2，鄧康2，張瑤1，彭莎莎1，洪陳亮1，王珍1，楊麗1，曾中三1，秦旭平1*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 衡陽(yáng)，421001，2.中國(guó)中藥有限公司)

目的探討苗藥黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥理作用及機(jī)制。方法將雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只分為正常SD大鼠10只正常為對(duì)照組，另40只建立關(guān)節(jié)炎大鼠后分為模型非給藥組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組(給予黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊)、兩種陽(yáng)性藥物對(duì)照組(分別以強(qiáng)的松及吲哚美辛治療)，每組10只；觀察黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹、臟器指數(shù)，以及血漿、關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素(IL)-1β、白介素-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子水平的影響。結(jié)果與正常對(duì)照組相比較，關(guān)節(jié)炎模型組大鼠足腫脹程度逐漸增加，胸腺、脾臟、腎上腺和腎臟指數(shù)增加(P<0.05)；同時(shí)，關(guān)節(jié)炎大鼠血漿、關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-10、TNF-α等炎癥因子水平明顯升高。給予藥物黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊治療后，足腫脹程度、胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，腎上腺、腎臟指數(shù)無(wú)明顯改善，效果與強(qiáng)的松、吲哚美辛對(duì)照藥組相當(dāng)。炎癥因子IL-1β、TNF-α水平在藥物治療組顯著降低(P<0.05)，但I(xiàn)L-10水平較給藥后有進(jìn)一步升高。結(jié)論黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能夠起到抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫器官功能有關(guān)。

黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊； 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； 炎癥因子； 藥理作用

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病，患者臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，嚴(yán)重影響患者健康和生活。對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療，現(xiàn)今仍然是以非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)和皮質(zhì)激素為主，這些藥物在很大程度上可以改善病情，緩解癥狀，但是長(zhǎng)期服用將引起許多不良反應(yīng)，如NSAIDs的胃腸道反應(yīng)和腎毒性，增加感染的易感性、引起消化道潰瘍等[1-2]。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊是由苗族民間三味中草藥黑骨藤、追風(fēng)傘和青風(fēng)藤制成的復(fù)方制劑，其治療風(fēng)濕患者有效率超過90%[3]。目前認(rèn)為該膠囊，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕的作用，但在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的藥理作用及其分子機(jī)制尚不完全清楚。由于類風(fēng)濕大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)、血液中各項(xiàng)因子變化狀況與人體類風(fēng)濕病理狀態(tài)下的相似度非常高[4]，為此，本研究選擇大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)苗藥黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用以及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品購(gòu)買南華大學(xué)動(dòng)物中心清潔級(jí)雄性Wister大鼠50只，體重平均 185.2±13.7 g，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)條件為光照和黑暗各為12 h。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊(貴州國(guó)藥集團(tuán)老來福藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20140205)規(guī)格為 0.3 g /粒，陽(yáng)性對(duì)照藥醋酸潑尼松片(強(qiáng)的松)(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字 150820203，規(guī)格 5 mg×100片)，吲哚美辛(山西太原藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150201，規(guī)格：25 mg×100片)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

1.2動(dòng)物模型及分組將50只SD大鼠分為正常對(duì)照組10只，另40只參考文獻(xiàn)[4-5]方法制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，即使用無(wú)水羊毛脂、液體石蠟和卡介苗制備完全佐劑，將Ⅱ型膠原溶液溶解在0.01 mL/L的乙酸中，制備成濃度為4 mg/mL的溶液，攪拌后過夜放置。將攪拌好的Ⅱ型膠原乙酸溶液按照1∶1比例滴入到佐劑中，完全乳化。模型組大鼠的左后足底、尾根、背部注射乳化液，7天后再次注射，當(dāng)大鼠四肢足爪嚴(yán)重腫脹、關(guān)節(jié)增大直徑幅度超過2 mm時(shí)為造模成功。正常對(duì)照組為正常大鼠予以正常生理鹽水注射，然后給予0.5% CMC-Na灌胃治療。另40只造模成功的大鼠分為4組：模型非給藥組(0.5% CMC-Na治療)、陽(yáng)性對(duì)照藥強(qiáng)的松(醋酸潑尼松，29.2 mg/kg)組；吲哚美辛組(12.5 mg/kg)，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組(HGF,27 g/kg)，每組10只(n=10)。

1.3給藥方法所有藥物按10倍于60 kg 人體重折算為大鼠等效劑量[6]，用0.5% CMC-Na配成混懸液，根據(jù)大鼠體重選擇每日藥物劑量 (相當(dāng)人類劑量10倍)，分兩次給藥，連續(xù)21天。正常組和模型組灌胃等體積的0.5%CMC-Na。以上各組給藥體積相等。

1.4療效指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 足腫脹度測(cè)量 用大鼠足容積測(cè)量?jī)x(自制)，實(shí)驗(yàn)第1天,用記號(hào)筆在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)周圍作上記號(hào)，并拉直放入足容積測(cè)量?jī)x裝置內(nèi),使足標(biāo)記與其刻度相平,測(cè)量并記錄每只大鼠未造模前左后足容積(mL)。隨后，測(cè)定正常對(duì)照組和造模后給藥和非給藥組第4、8、16、21天大鼠左足容積，計(jì)算足腫脹度。足腫脹度=(注射佐劑后容積-注射佐劑前容積)/ 注射佐劑前容積×100%。

1.4.2 大鼠臟器指數(shù)測(cè)算 最后一次給藥后處死所有大鼠，稱體重，取出胸腺、腎上腺、脾、腎等臟器，稱量結(jié)果，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重量/體重×100%。

1.4.3 血清和組織液的制備 樣本的制備參考文獻(xiàn)[4]的方法，取造模第 21 天，末次給藥后的股動(dòng)脈取血，放置，離心，取上清液，在 -20 ℃ 下保存待測(cè)。關(guān)節(jié)液的提取，處死大鼠后，在致炎側(cè)關(guān)節(jié)上方0.5 cm處取出腫脹部分，縱向切開，放入 5 mL 生理鹽水的試管中 4 ℃ 浸泡過夜，離心，取上清液，在-20 ℃下保存待測(cè)。

1.4.4 血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β，IL-10，TNF-α 的含量測(cè)定 IL-1β、IL-10 和腫瘤壞死因子(TNF)-α，采用ELESA試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司)進(jìn)行測(cè)量。用抗大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的 Streptavidin 與生物素結(jié)合，加入酶底物 OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在 492 nm 處可測(cè)得吸光值(OD 值)，大鼠血中的IL-1β、IL-10、TNF-α濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β，IL-10，TNF-α濃度。具體步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1足腫脹程度注射佐劑后，模型組大鼠足腫脹逐漸增加，于造模后第8天到達(dá)高峰，之后開始下降，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，藥物治療組足腫脹程度逐漸降低(P<0.05)。與其他藥物治療組(強(qiáng)的松組、吲哚美辛組)相比，在第21天黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組的抗炎作用最為明顯，差異有顯著性(P<0.05，詳見表1)。

表1大鼠足腫脹測(cè)量結(jié)果(%)

組別第4天第8天第16天第21天正常對(duì)照組0．056±0．0130．081±0．0．120．115±0．0180．191±0．014模型非給藥組1．126±0．251a1．253±0．412a1．175±0．198a1．204±0．217a吲哚美辛組0．941±0．023b0．814±0．053b0．808±0．0196b0．742±0．066b強(qiáng)的松組1．132±0．027b1．127±0．046b0．942±0．123b0．908±0．025b黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組1．024±0．054b0．802±0．049b0．785±0．047b0．615±0．132bc

與正常對(duì)照組比較，a:P<0.01;與模型非給藥組比較，b:P<0.05；與強(qiáng)的松或吲哚美辛組比較，c:P<0.05

2.2大鼠臟器指數(shù)與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠胸腺、腎上腺、腎臟、脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能顯著降低胸腺和脾臟指數(shù)(P<0.05)，而升高腎上腺和腎臟指數(shù)(P<0.05)；其余藥物治療組作用相對(duì)較低。見表2。

2.3炎癥因子表達(dá)ELISA試劑盒測(cè)量大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-10、TNF-α水平發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型非給藥組IL-1β、IL-10、TNF-α水平在血液和關(guān)節(jié)液中都有明顯升高，藥物治療組能降低兩種組織中IL-1β、TNF-α的水平，但對(duì)IL-10水平不同藥物作用不同。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊與吲哚美辛組IL-10水平較有升高，強(qiáng)的松治療組IL-10水平相對(duì)降低(表3)。

表2大鼠臟器指數(shù)的比較

組別胸腺腎上腺腎臟脾臟正常對(duì)照組1．32±0．270．11±0．0055．41±0．272．26±0．48模型非給藥組1．58±0．24a0．17±0．041a7．02±0．41a3．37±0．28a吲哚美辛組1．36±0．41b0．21±0．024b7．52±0．41b2．71±0．20b強(qiáng)的松組1．42±0．31b0．15±0．0717．04±0．423．27±0．42黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組1．31±0．14b0．27±0．016b8．25±0．33b2．89±0．27b

與正常對(duì)照組比較，a:P<0.01;與模型非給藥組比較，b:P<0.05

表3大鼠血漿和滑膜組織中IL-1β、IL-10、TNF-α濃度(μg/L)

組別血清IL?1βIL?10TNF?α關(guān)節(jié)液IL?1βIL?10TNF?α正常對(duì)照組0．601±0．1370．116±0．0150．412±0．0320．451±0．1120．089±0．0250．322±0．022模型非給藥組1．18±0．204a0．217±0．043a0．725±0．024a0．918±0．104a0．117±0．033a0．612±0．014a吲哚美辛組0．66±0．41b0．221±0．024b0．520±0．41b0．526±0．014b0．123±0．034b0．320±0．211b強(qiáng)的松組0．720±0．31b0．153±0．021b0．503±0．012b0．612±0．231b0．095±0．011b0．412±0．022b黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組0．391±0．131b0．401±0．076b0．315±0．023b0．301±0．083b0．310±0．056b0．228±0．025b

與正常對(duì)照組比較，a:P<0.01;與模型非給藥組比較，b:P<0.05

3 討 論

黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊中的主要物質(zhì)為黑骨藤、青風(fēng)藤、追風(fēng)傘，在苗醫(yī)中具有抬奧、抬蒙(祛風(fēng)除濕,消腫止痛)，用于治療僵見風(fēng)。本結(jié)果顯示：大鼠注射佐劑后，足趾關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹，關(guān)節(jié)變大，說明關(guān)節(jié)炎模型成功。給予黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊治療后，大鼠足腫脹程度明顯降低，初步證實(shí)黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能夠?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到一定的防治作用。

類風(fēng)濕性疾病與免疫因素有關(guān)，體內(nèi)過強(qiáng)的免疫激活能損傷正常組織引起組織炎癥。胸腺、脾臟是體內(nèi)重要的免疫臟器，臟器相對(duì)質(zhì)量的變化就是臟器指數(shù)，臟器指數(shù)在免疫評(píng)價(jià)中有著非常重要的意義，其能夠?qū)?dòng)物免疫功能進(jìn)行評(píng)估，也是臨床中最常用、最基本的評(píng)估指標(biāo)[5]。本文結(jié)果顯示：模型組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)明顯升高，說明在炎癥應(yīng)激時(shí)，大鼠體內(nèi)免疫臟器激活。給予黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊治療后，關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕，同時(shí)胸腺和脾臟指數(shù)也明顯降低，這與強(qiáng)的松、吲哚美新組相似。說明黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的抗炎作用與抑制免疫炎癥和非特異性炎癥有關(guān)。因?yàn)檫胚崦佬碌目寡鬃饔弥饕c抑制體內(nèi)前列腺素的合成，而強(qiáng)的松主要通過白三烯等炎癥介質(zhì)和降低白細(xì)胞活性等機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)。因此，可以認(rèn)為，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能夠通過調(diào)節(jié)免疫器官的功能，起到抗類風(fēng)濕的作用，達(dá)到治療效果。本研究結(jié)果也與黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊主要成分黑骨藤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[7-9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組大鼠的腎臟指數(shù)增大，提示黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對(duì)腎臟和肝臟可能也有一定的毒副作用。

大量炎癥因子參與類風(fēng)濕性免疫炎癥的反應(yīng)[10]，間質(zhì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜病變時(shí)，關(guān)節(jié)囊內(nèi)巨噬細(xì)胞受刺激后活化并分泌IL-1，使局部組織間質(zhì)細(xì)胞分泌大量的前列腺素和膠原酶，分解壞滑膜。IL-10是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要由Th2細(xì)胞、活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-10在自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中表達(dá)上調(diào)主要是由于免疫功能失調(diào)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的高敏感性。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中檢測(cè)到IL-10水平升高，中和IL-10后關(guān)節(jié)炎加重，給予IL-10治療能明顯抑制關(guān)節(jié)的炎癥，提示在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中IL-10具體有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用。

TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，能刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成前列腺素E2和膠原酶，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部滑膜炎癥和軟骨組織破壞，也能刺激IL-1、IL-6、IL-8等其它炎癥因子的產(chǎn)生，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎局灶性骨侵蝕的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能夠降低風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α水平，增加IL-10的水平，從而控制關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。因此，可以進(jìn)一步認(rèn)為黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊能夠通過調(diào)節(jié)不同的免疫因子的分泌和釋放減輕關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)，達(dá)到抗類風(fēng)濕疾病的作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究方法的發(fā)展，進(jìn)一步證明骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊抗類風(fēng)濕作用的機(jī)制可能為闡明該病的病理生理學(xué)機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新藥靶點(diǎn)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2015-11-10；

2016-02-26

湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心湘教通(2014)405號(hào).

*通訊作者，E-mail:qinxp333@hotmail.com.

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蔣湘蓮)